肝星状细胞表达的β-PDGF受体调节小鼠肝损伤中的纤维化，但不影响致癌

动物

β-血小板衍生生长因子受体^{飞行/飞行}小鼠，如前所述[11]在人胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子的控制下，（在129S4/SvJaeSor背景下）与表达Cre重组酶的转基因FVB株杂交，以产生β-PDGFR^{飞行/飞行}星状细胞中β-PDGFR缺失的GFAP-Cre小鼠-此GFAP启动子已在先前的研究中成功验证为在肝星状细胞活性[12,13]. 创建星形细胞中具有组成性激活的β-PDGFR的动物^βJ/+小鼠，如前所述[14]，（在129S4/B6背景下）也与转基因GFAP-Cre系杂交产生β-PDGFR^βJ/+GFAP-Cre小鼠。这些动物体内的肝星状细胞具有β-PDGFR的自动激活，这是由于β-PDGFR基因座中的激活突变，加上在剪接受体和cDNA起始密码子之间添加了lox-stop lox盒[14].

小鼠肝损伤和纤维化模型

结扎总胆管（BDL）可导致肝纤维化[15]或腹腔注射四氯化碳（CCl）₄，密苏里州圣路易斯市西格玛）[16]. 对于急性CCl₄损伤研究中，小鼠共接受3次腹腔注射（交替日）玉米油或10%CCl₄（在玉米油中稀释），剂量为0.5µl/g体重。对于慢性损伤模型，小鼠接受腹腔注射CCl₄每周3次，共6周。

致癌诱导

小鼠在产后15天接受单剂量二乙基亚硝胺（DEN，Sigma，St.Louis，MO）（25µg/g bw i.p.）。DEN后两周开始，小鼠共注射了22次CCl₄（0.5µl/g bw i.p.，每周注射1次）[17]. 最后一次CCl后48小时处死小鼠₄注入。通过使用卡尺计数和测量每个病灶的直径，记录结节的数量和大小。

原代肝星状细胞的分离与培养

从β-PDGFR中分离出小鼠肝星状细胞^{飞行/飞行}GFAP-Cre阴性和β-PDGFR^{飞行/飞行}如前所述，通过蛋白酶和胶原酶消化和密度梯度离心法检测GFAP-Cre阳性小鼠[18]. 细胞用含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）培养。在含有无血清培养基（DMEM）的白蛋白（载体）中稀释PDGF-B[10 ng/ml]（新泽西州普林斯顿Peprotech）处理细胞。

组织学和免疫组织化学研究

肝脏样本采用福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚度为4µm，并常规进行H&E染色。天狼星红（Sirius Red）结合形态计量学，使用Bioquant图像分析软件（Bioquatt image analysis Corporation，田纳西州纳什维尔）定量胶原蛋白。用兔多克隆抗体在福尔马林固定、石蜡包埋的肝脏切片上对αSMA和结蛋白进行免疫组织化学染色（Abcam，Cambridge，England）。病理学家在每张幻灯片上随机为坏死、炎症和异型增生评分5个区域。

全基因组表达谱分析

根据制造商的协议，使用MouseWG-6 v2.0 expression BeadChip（Illumina）对小鼠原代肝星状细胞进行基因表达谱分析，一式三份。使用GenePattern基因组分析工具包中实现的立方脊柱算法对原始扫描数据进行标准化(www.broadinstitute.org/genepattern) [19]. 通过计算多个探针的中位数，探针级表达数据被分解为基因级，并根据Jackson实验室提供的同源映射表转换为人类基因(www.informatics.jax.org). 数据集（GSE#52253）可在NCBI基因表达综合数据库中获得(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).

星状细胞β-PDGFR缺失减轻肝纤维化在体内

由于小鼠对急性肝损伤的反应是与纤维生成标记物相关的星状细胞上β-PDGFR上调，因此我们分析了对照组和Δβ-PDGFR-动物(补充图1A)急性（1周）和慢性（6周）肝损伤后。为了做到这一点，我们给两组注射了油或CCl₄（每周3次静脉注射）。

从宏观上看，治疗后对照组和Δβ-PDGFR窝友的肝脏没有差异(补充图1B、C)，但早期坏死较少(补充图2A、B). 尽管注射一周后，Δβ-PDGFR小鼠的肝脏炎症有减轻的趋势(补充图2B)综合流式细胞术未证实野生型和Δβ-PDGFR同窝配偶在基线检查时或受伤后淋巴细胞的数量或亚群存在任何差异（数据未显示）。通过天狼星红形态计量学和羟脯氨酸测定评估，β-PDGFR缺乏导致慢性肝损伤后胶原沉积显著减少(图2 A、B、C). 血清转氨酶水平（AST和ALT）升高，尤其是6周后(图2D). 正如预期的那样，星状细胞中β-PDGFR缺失的肝脏表达较少的α座椅模块组件并且显著减少胶原蛋白α1（一）mRNA(图2E). 为了验证β-PDGFR表达减少对CCl后活化HSC扩张的影响₄治疗后，我们量化了两组的αSMA阳性组织面积(补充图3A). 短期和更显著的是，长期损伤后，与对照组相比，Δβ-PDGFR组小鼠活化HSC的扩张减少。使用CCl 6周后的肝脏全肝裂解物进一步验证了这一发现₄处理(补充图3B). 这里，β-PDGFR表达减少导致αSMA表达减少。作为HSC的额外标记物，并在肝脏损伤期间测量HSC的扩张，在CCl 1周后的组织切片上进行结蛋白染色₄处理(补充图4). 在这些小鼠中，与对照组相比，Δβ-PDGFR小鼠结蛋白阳性组织定量显著降低。

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图2

HSCβ-PDGFR缺失导致胶原沉积减少体内

（A–E）Δβ-PDGFR和对照小鼠注射CCl₄导致急性或慢性肝损伤。

（A） 急性或慢性肝损伤后石蜡包埋肝脏切片的天狼星红染色显示慢性损伤后胶原沉积显著降低（放大200倍）。

（B） 图表显示了通过形态分析测量的天狼星红染色阳性的肝脏面积百分比。与对照组相比，Δβ-PDGFR动物的纤维化组织面积显著减少。

（C） CCl 6周后每克全肝羟脯氨酸含量的测定₄反映了与对照组相比，Δβ-PDGFR肝脏中羟脯氨酸含量降低。

（D） 急性和慢性损伤期间血清AST和ALT水平。

（E） 全肝mRNA表达胶原蛋白α1（一）, α座椅模块组件, β-PDGFR公司CCl 6周后₄治疗证实，损伤后对照动物体内的星状细胞激活基因表达增加，而Δβ-PDGFR组没有增加。

所有数字表示每个实验组至少3只动物的平均值。mRNA的表达标准化为Gapdh公司（*p<0.05，**p<0.001；误差条表示SEM）。

在胆管结扎模型中也有类似但不太显著的结果（参见补充图5).

星状细胞中β-PDGFR的缺失减弱其增殖反应在体内

为了确定肝损伤后纤维化加剧是否是由于β-PDGFR介导的星状细胞增殖所致，我们进行了体内分裂星状细胞的标记。两组小鼠共接受三次腹腔注射CCl₄每48小时；最后一次注射后44小时，小鼠接受单次腹腔注射BrdU（1.5mg/150µl PBS），然后在4小时后分离细胞。分离细胞进行CD45和BrdU染色，然后进行流式细胞术分析。紫外自荧光用于区分星状细胞和非荧光细胞，而CD45的表达用于区分CD45⁻来自其他非实质细胞的星状细胞(补充图6A). 根据该分析，44.3%的β-PDGFR小鼠星状细胞含有核BrdU，而Δβ-PDGFRcells中的BrdU含量为16.3%(补充图6B)表明星状细胞的β-PDGFR表达与肝损伤期间的增殖显著增加相关。

星状细胞成分激活的β-PDGFR加重肝纤维化在体内

为了证实β-PDGFR在肝纤维化过程中的重要作用，我们分析了一种小鼠系，在该小鼠系中，通过交叉β-PDGFR-可在肝星状细胞中诱导β-PDGFR自激活突变体的表达^βJ/+GFAP-Cre转基因小鼠(补充图7A). 我们比较了PDGFR^βJ/+Cre阴性（β-PDGFR）及其PDGFR^βJ/+每周腹腔注射玉米油或CCl三次后，Cre阳性（βJ）窝友₄（0.5µl/g体重）超过一周（急性）或六周（慢性）(图3). 自激活βJ组与对照组动物在注射油后显示出纤维组织面积的差异(图3A、B、C). CCl 6周后差异也很显著₄βJ小鼠胶原沉积显著增加(图3A、B、C). 与这些发现一致，星状细胞上突变的βJ表达导致胶原蛋白α1（I）和α座椅模块组件CCl后mRNA表达₄处理(图3D).

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图3

星状细胞上β-PDGFR的“βJ”组成性激活突变导致损伤后胶原沉积增加体内

（A–D）βJ和对照小鼠注射CCl₄导致急性或慢性肝损伤。

（A） 急性或慢性肝损伤后石蜡包埋肝脏切片的天狼星红染色显示急性和慢性损伤后胶原沉积显著增加（放大200倍）。

（B） 图中显示了通过形态计量学测量的天狼星红染色阳性的肝脏面积百分比。与对照组相比，βJ动物肝脏的纤维化组织面积显著增加。

（C） CCl 6周后每克全肝羟脯氨酸含量增加₄与对照组相比，βJ小鼠的肝脏中。

（D） α的全肝mRNA表达座椅模块组件和胶原蛋白α1（一）CCl 6周后₄治疗证实肝损伤后βJ动物星形细胞激活基因表达增加。

（E） 急性肝损伤后石蜡包埋肝切片的Desmin染色显示，与对照组相比，βJ小鼠肝脏内星状细胞扩张增加。

（F） 图中显示了形态计量学测量的结蛋白阳性组织面积百分比。

所有数字表示每个实验组至少5只动物的平均数。mRNA表达标准化为Gapdh公司（*p<0.05，**p<0.001；误差条表示SEM）。

在治疗前后，对照组和突变型βJ窝友之间没有宏观差异(补充图7B)但在1周和6周后，两个治疗组的肝脏与体重的比率都有所增加(补充图7C). 血清转氨酶水平与治疗时间成比例增加，而β-PDGFR和βJ同窝婴儿之间无差异(补充图7D). 两组均显示炎症和坏死加重(补充图8A、B).

我们量化了结蛋白阳性区域，作为星状细胞扩张的反映(图3E). 使用这种方法，具有自动激活β-PDGFR的小鼠在急性损伤时显示出增加的结蛋白阳性组织面积(图3F). β-PDGFR的自激活突变导致急慢性损伤后星形细胞增殖增加和肝纤维化。

星状细胞中β-PDGFR缺乏对致癌反应无影响

由于大多数HCC发生在肝硬化肝脏内，我们评估了星状细胞中β-PDGFR信号在DEN加CCl后发育不良结节中的作用₄(补充图9A) [17]. 据报道，这种疗法模拟了再生结节和最终肝癌产生的宽松环境[12,17].

长期使用致癌物和CCl治疗后₄，通过天狼星红形态计量学评估，Δβ-PDGFR积累的胶原蛋白较少(图4A、B)，与减少胶原蛋白α1（一）信使核糖核酸(补充图9G). 然而，Δβ-PDGFR的损失对病变总数、最大结节大小或肝脏重量与体重的比值没有影响(补充图9B、C、D、E). 值得注意的是，仔细的专家分析显示病变是增生异常结节，而不是真正的肝癌。组织学上，经盲法病理学家评估，β-PDGFR和Δβ-PDGFR-小鼠的肝脏切片显示出类似的异常增生结节的外观(补充图9F).

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图4

在接受DEN和慢性CCl治疗的小鼠中，β-PDGFR的缺失可降低纤维化，但不降低肿瘤负担₄与肝硬化患者更好的预后有关

在第15天用单剂量DEN治疗小鼠，然后每周注射CCl₄在22次注射CCl的最后48小时后牺牲₄.

（A） 石蜡包埋肝脏切片用天狼星红染色以评估纤维化组织含量（放大200倍）。

（B） 通过形态计量学测量Δβ-PDGFR小鼠肝脏胶原面积的减少。条形图表示每个实验组n=5只动物的平均值。（**p<0.001；误差条表示SEM）。

（C） GSEA图显示，在HCV肝硬化患者队列中，β-PDGFR依赖性与基因特征相关，可判断预后是否良好。

从β-PDGFRfl/fl GFAP-Cre阴性（以WT表示）或β-PDGFR fl/fl GFAP-Cre阳性（以KO表示）小鼠分离的原代肝星状细胞的基因阵列样本与人类HCV肝硬化队列整体预后良好或不良的基因特征相关。

（a） β-PGDFR-敲除基因特征与肝硬化良好预后的相关性。在216例HCV相关性肝硬化早期患者（n=216）中，评估了β-PGDFR-敲除基因特征的富集与总死亡率的风险。NES=−1.14，标称p=0.21，FDR=0.22。

（b） β-PGDFR基因特征与HCV肝硬化不良预后的相关性。对216例HCV相关性肝硬化早期患者（n=216）的β-PGDFR基因特征的富集与总死亡率的风险进行了评估。NES=1.11，标称p=0.25，FDR=0.23。

使用GSEA评估基因。

（D） 从DNA微阵列数据中选择野生型和β-PDGFR敲除小鼠之间的5个差异表达最高的基因（Anxa1、Dab2、Ergic2、Lpp和Prdx5），比较DNA微阵列和RT-qPCR之间β-PDGFR-敲除介导的差异基因表达。为了验证RT-qPCR中的差异表达，设计了7对引物（2对用于Ergic和Prdx5），并对相同的RNA等分进行了三次分析。

这些数据表明，星状细胞缺乏β-PDGFR表达可减轻CCl慢性损伤的纤维化进展₄但当与致癌物结合时，不能防止发育不良结节的形成。

星状细胞中β-PDGFR的组成性激活不会导致致癌反应增加

为了进一步反映这些发现，我们使用βJ小鼠及其对照同窝小鼠评估其对DEN和CCl联合治疗的反应₄(补充图10). 宏观上，发育不良结节形成的总体定量没有差异(补充图10)关于肿瘤数量、最大肿瘤直径和肝脏总重量与体重的比值(补充图10B、C、D、E). 组织学上，βJ和对照小鼠的发育不良程度没有差异(补充图10F). 总之，在该小鼠模型中，β-PDGFR的激活水平与增生异常结节的形成无关。

作者感谢Marie Berres博士（西奈山伊坎医学院肿瘤科学系）和新洲提供的技术支持。RNA序列和DNA微阵列实验由Genomics Core执行，预处理由Ke Hao博士和Antonio Fabio Di Narzo博士（西奈山伊坎医学院遗传学和基因组科学）执行。

财务支持

这项工作得到了德国联邦基金会（DFG）（KO 4086/1-1至P.K，LE 2794/1-1至Y.A.L.）、莱文家族基金会（至A.D.）、NIH DK56621和AA020709（至S.L.F.）以及NIH DK099558和欧洲委员会第七框架计划FP7-Health 2010（Heptromic）（至Y.H.）的资助。