肾细胞腺癌（RCC）是一种肾癌，起源于近曲小管的内壁，是肾脏中极小管的一部分，将废物分子从血液输送到尿液中。大多数晚期肾癌患者预后不佳，因为肾癌容易转移，治疗进展有限(1——三). 由于缺乏肾细胞癌转基因模型，很难确定和测试新的治疗模式。
这个MYC公司在人类肾癌的大多数情况下，该通路被激活(4)，5-10%的患者基因组扩增，20%的患者过度表达(5)与遗传性RCC综合征相关(6)提示其在发病机制中的因果作用，但这一点从未被研究过。在这里，我们报道了一种用于MYC-解除调控的人肾细胞癌的条件转基因小鼠模型的开发。这个MYC公司癌基因通过多种机制参与多种癌症的发生(7——10)包括增殖和生长的调节、蛋白质和核糖体的生物生成、代谢变化、脂质合成和血管生成的诱导(11——14). MYC重编程可能导致肿瘤对葡萄糖和/或谷氨酰胺的能量代谢上瘾(15——19). MYC直接调节糖酵解和谷氨酸解途径的特定基因(15,17,20,21)包括乳酸脱氢酶A（LDHA）、葡萄糖转运蛋白1（谷氨酸1）、己糖激酶2（HK2）、磷酸果糖激酶-M1（PFKM1）和烯醇化酶1（Eno1）(21——23). 此外，MYC协调参与谷氨酰胺分解代谢的基因(SI MYC和谷氨酰胺分解代谢). 然而，没有证据表明MYC过度表达直接驱动和维持RCC，也没有证据表明这是如何发生的。
通过我们的新转基因小鼠模型，我们表明转基因MYC（而非突变RAS）在体内过度表达可快速引发高度侵袭性RCC，其组织学类似于集合管癌，是RCC的一种高度侵袭性亚型。在我们的小鼠模型中，MYC抑制后，MYC-诱导的RCC是完全可逆的。我们使用高质量分辨率和高质量精度解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI）和分子生物学方法来研究RCC模型中代谢物、脂质、蛋白质和基因的变化。我们之所以使用这种方法，是因为我们之前描述了成功使用DESI-MSI和转基因小鼠模型来检测MYC诱导的肝细胞癌（HCC）的脂质谱(24)和淋巴瘤(25).
在DESI-MSI中，组织样本被微滴轰击，这些微滴在特定位置溶解其表面上的数百种脂质和代谢物(26). 微滴在组织表面上的飞溅形成二级微滴，二级微滴进入质谱仪并提供该特定位置组织表面上分子的特征。通过二维移动样品，我们获得了组织的详细化学图。
通过使用DESI-MSI，我们发现MYC诱导的RCC的一个先前未识别的脂质特征。大多数分子离子通过串联和高分辨率质谱鉴定为游离脂肪酸和复合甘油磷脂。有趣的是，在MYC诱导的RCC中发现的相对丰度较高的许多甘油磷脂是先前在MYC-诱导的HCC和淋巴瘤中观察到的。
此外，为了研究MYC和谷氨酰胺代谢之间的关系，我们使用DESI-MSI成像谷氨酰胺酶分解途径的特定代谢物的分布。为了证实我们的结果，我们测量了谷氨酰胺途径中不同基因的丰度，以表明MYC诱导的RCC表达谷氨酰胺途径基因。此外，这些肿瘤对谷氨酰胺高度依赖。为了评估这些途径是否具有治疗价值，我们对谷氨酰胺酶进行了药理抑制，谷氨酰胺酶将谷氨酰胺转化为谷氨酸，通过TCA循环进一步氧化谷氨酸。双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚（BPTES）对谷氨酰胺酶的抑制作用(27)减缓RCC肿瘤进展，表明以谷氨酰胺分解途径为靶点是治疗人类RCC的潜在治疗方法(24,25).
结果
MYC，而非RAS，启动RCC。
目前尚无RCC的本地小鼠模型。根据先前的报告显示MYC在RCC发病机制中的作用(4——6)，我们使用Tet系统来调节Tet-O的表达-MYC公司(7)或Tet-O-K-RAS（由马里兰州贝塞斯达NIH H.Varmus善意提供）。癌基因的表达由肾脏特异性γ-谷氨酰转移酶基因启动子（GGT）驱动(28)与四环素反式激活基因（tTA）偶联(). 从饮用水中去除强力霉素（Dox）后，转基因小鼠在肾脏近曲小管细胞中有条件地表达MYC或RAS；通过免疫组织化学（IHC）的MYC或突变K-RAS的Western blot分析确认条件表达(和图S1A类）。诱导MYC而非K-RAS表达增加肾脏大小()在组织学上与快速进展的RCC相关(). 因此，MYC（而非K-RAS）可以启动肾细胞肿瘤发生。
MYC而非RAS启动肾肿瘤发生。(A类)γ-谷氨酰转移酶（GGT）启动子驱动四环素反式激活蛋白（tTA）和四环素反应元件控制下的MYC的转基因小鼠产生MYC-GGT-tTA小鼠。(B)患有MYC小鼠的Kaplan-Meier总体生存分析(n个=27）或K-RAS(n个=7）转基因。ON表示癌基因激活，OFF表示癌基因从未激活。(C类)MYC激活4周后MYC-GGT-tTA肾脏的大体解剖，与MYC保持失活的对照组相比。(天)MYC激活后每周肾切片的连续H&E和MYC IHC。(E类)典型的IHC和免疫荧光图像显示MYC激活和失活10天后的蛋白表达和组织学变化，n个在每个时间点检查=3只小鼠。
通过IHC对MYC诱导的肿瘤进行RCC标记物评估。肿瘤表达PAX8，一种肾癌的标志物(29,30) (图S2，面板1），以及E-cadherin(图S2，图2），其表明上皮起源。肿瘤CK5/6和CK7染色阳性(图S2，面板3和4），但不适用于CK20(图S2，面板5），表明该亚型为集合管癌(30). 两位病理学家的评估一致认为，肾肿瘤标记物的特征与源自集合管的肾细胞癌一致，集合管是一种罕见的致死性肾细胞癌亚型(31). 尽管这种类型的肾癌很罕见，但这种转基因小鼠提供了一种独特的方法，可以在体内研究一种高度侵袭性的肾细胞癌，并且是发现新治疗方案的工具。
MYC诱导的RCC是可逆的。
通过Dox治疗抑制癌基因后，MYC驱动的肿瘤是可逆的(). 通过观察增殖、凋亡、衰老和血管生成的变化，证实了这种逆转(7——9,12——14). MYC失活与RCC完全退化有关，这可以通过每周连续的MRI成像以及苏木精和伊红（H&E）染色组织切片的组织学检查进行定量证明(和图S3A类和B). 多克斯治疗后2天，MYC蛋白表达被完全抑制(图S3C类，第1行），与抗原Ki-67染色测定的增殖减少八倍有关(图S3C类; 54%对6.5%，P（P）< 0.0001). 值得注意的是，用裂解半胱天冬酶3（CC3）测定，细胞凋亡没有显著变化(图S3C类，第3行；MYC失活2天时为63%，10天时为38%）。MYC灭活后第2天和第5天，细胞衰老程度略有下降，第10天则显著增加（0.7%，2.3%；P（P）<0.0001），通过酸性β-半乳糖苷酶染色（SA-β-Gal）测定。然而，CD31染色检测到血管生成没有改变(图S4). 因此，RCC肿瘤的消退似乎是因为细胞增殖受到显著而迅速的抑制，同时细胞凋亡持续存在(32).
MYC诱导的RCC表现出明显的脂质特征。
为了研究MYC诱导的肾细胞癌中的脂质变化，在MYC激活（MYC ON）后2周和4周对肾组织进行DESI-MSI分析，然后进行4周的MYC灭活（MYC-OFF）。我们的分析是在负离子模式下进行的米/z200–1000范围，其中检测到各种不同类别的游离脂肪酸和复合甘油磷脂(26). 为了鉴定这些物种，我们使用了串联质谱分析和高质量精度测量。将获得的片段模式与文献中报道的不同脂质类别的特征进行比较(33)并与高质量准确度测量结合用于脂质鉴定。使用DESI-MSI结合高质量分辨率/质量精度质谱仪对肾细胞癌和正常肾脏样品进行成像。使用二甲基甲酰胺：乙腈（DMF:ACN）（1:1）的溶剂混合物，以便在同一组织切片上进行组织学评估，并在分子特征和组织疾病状态之间提供明确的相关性(34).
从对照组（正常）肾脏、2周MYC-ON诱导的肾细胞癌、4周MYC-ON诱导的肝细胞癌和4周MY1C-OFF诱导的肾细胞核癌的组织样本中获取选定的2D离子图像(). 每个组织切片都是每只动物肾脏的完整横截面。DESI-MSI后，组织切片进行H&E染色；着色部分的光学图像如所示注意，通过使用DMF:ACN作为溶剂系统，DESI-MSI过程后染色组织切片中的组织形态得以保存(34). 对照肾在组织学上表现为正常结构，有两个主要结构，即外肾皮质和内肾髓质。在2周的MYC-ON肾脏中，观察到RCC，肿瘤细胞在器官的中央区域大量聚集。在4-k MYC-ON组织中，肾脏的总体积显著增加，与2-k MYC-ON组织相比，肿瘤细胞破坏了肾脏的大部分正常结构。DESI-MSI检测到的许多离子位于肾脏的形态结构中。例如，米/z878.601，被鉴定为脂质（3′-磺基）Galβ-神经酰胺（d18:0/22:0（2OH）），通过DESI-MSI仅在肾髓质观察到，而米/z327.231，鉴定为二十二碳六烯酸，FA（22:6），在肾皮质观察到较高的相对强度。脂质的绝对质量误差小于8 ppm。请注意，甘油磷脂脂肪酸（FA）链中双键的异构使精确的结构分配复杂化，这就是为什么FA链只是暂时分配的原因。
MYC诱导的RCC的DESI-MSI显示出特定的脂质特征。同时分析了对照肾、2周MYC ON肾、4周MYC-ON肾和4周MY OFF肾的典型DESI-MS离子图像。图像显示的是米/z303.2309,米/z327.2308,米/z750.5393,米/z771.5161,米/z773.5344,米/z775.5510,米/z817.5034,米/z819.5196之间，米/z841.5037,米/z865.5021,米/z885.5432,米/z867.5218,米/z818.6018，以及米/z913.4865. 每个面板中都显示了离子的分子标识。右下面板显示了DESI-MSI后H&E染色的组织切片的光学图像。
观察到特异性脂质的相对丰度在MYC诱导的肾细胞癌和正常肾组织的光谱中表现出显著差异(图S5). 与对照肾脏样品相比，MYC-ON样品中观察到各种甘油磷酸甘油（PGs）的相对丰度较高。特别地，米/z865.502，鉴定为PG（22:6/22:6），其总丰度呈现时间变化，在MYC激活4周时相对强度最高。DESI-MS离子图像米/z771.516,米/z773.532,米/z775.551,米/z817.503,米/z819.520,米/z865.502，以及米/z867.522分别被识别为PG（18:2/18:1）、PG（18.1:1/18:1DESI-MSI先前在MYC诱导的HCC和淋巴瘤中观察到高强度的这些脂质物种(24,25)，这表明MYC癌基因过度表达与PG代谢之间的关系。其他脂质种类，包括米/z303.231中，米/z885.543，以及米/z在RCC和对照组织中观察到747.513，分别鉴定为FA（20:4）、PI（18:0/20:4）和PG（16:0/18:1），相对丰度相似。有趣的是，4周龄的MYC-OFF组织呈现出与对照组织相似的脂质特征，在肾内分析的大多数区域。然而，DESI-MS离子图像显示，与对照肾组织相比，MYC-OFF诱导的4周肾细胞癌中的小病灶区域具有较高的PG相对丰度。这些病灶区域可能与残留的肿瘤细胞有关。
MYC诱导的RCC激活谷氨酰胺代谢。
为了进一步了解MYC如何维持RCC的肿瘤发生，在MYC激活后1、2和4周进行基因表达分析。分位数归一化和对数2在所有样本中进行转化，使用>两倍的基因表达变化，临界值为P（P）= 0.05. 京都基因和基因组百科全书（KEGG）是一个数据库的集合，涉及基因组、生物途径、疾病、药物和化学物质。KEGG途径分析表明代谢途径发生了变化，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢的上调，以及对糖酵解、糖生成和O-聚糖生物合成的更复杂影响。观察到编码谷氨酸分解途径的营养转运蛋白和酶的基因的时间依赖性上调(图S6A类). 虽然糖酵解通常减少，但某些糖酵分解基因增加(图S6B). MYC通过直接启动子激活或通过miR-23a/b转录后调节谷氨酰胺酶表达(17)，MYC激活后降低(图S7A类和B). IHC分析证实谷氨酰胺分解途径的蛋白表达上调(以及糖酵解途径的下调(，面板3和4）。
在MYC诱导的肾腺癌中，谷氨酰胺分解途径上调。(A类)IHC显示正常肾脏（对照）和MYC激活3周的肾脏中谷氨酰胺酶1和2、己糖激酶1和LDHA的表达。(B)与对照组相比，2周MYC激活时谷氨酸和α-酮戊二酸的典型DESI-MS离子图像。在DESI-MSI之后，对同一节段进行了H&E。
然后，使用DESI-MSI检测RCC和原位对照肾脏中特定代谢物相对丰度的变化(32,35). 与对照样品相比，确认了谷氨酸分解途径的代谢物，包括谷氨酸和α-酮戊二酸，以及RCC中柠檬酸、丙酮酸、苹果酸和琥珀酸对应的离子相对丰度增加。这一发现表明克雷布斯循环的激活(图S6C类). DESI-MSI提供了200µm的空间分辨率，并允许代谢物与组织切片内肿瘤区域的共定位达到此精度(). 结合基因表达结果，这些结果表明RCC的MYC启动与谷氨酰胺水解的激活有关。
BPTES对谷氨酰胺酶的抑制减缓了RCC肿瘤的进展。
我们评估了MYC诱导的RCC对谷氨酰胺和葡萄糖的依赖性。首先，我们从转基因小鼠模型中获得了一个细胞系（E28），如Western blot分析所示，该细胞系继续有条件地表达MYC(图S8A类). E28只能在添加谷氨酰胺的培养基中增殖和存活(图S9A类)但不是葡萄糖(图S9B). 其次，我们发现谷氨酰胺转运所需的基因(图S9C类)并且在MYC失活后谷氨酰胺分解途径显著减少(图S9天).
接下来，我们评估了肾脏型谷氨酰胺酶变构抑制剂BPTES的活性(图S10A类) (27). 首先，发现BPTES对MYC诱导的RCC的生长具有体外影响(图S9E类). 其次，在我们的转基因小鼠模型中检测BPTES的体内抗肿瘤活性。在MYC激活后2周开始BPTES治疗。在治疗后7天和14天通过磁共振成像观察小鼠(图S10B). 与使用二甲基亚砜治疗的对照肿瘤相比，经BPTES治疗的肿瘤生长较少（11%对34%；P（P）=0.003）和（49%对70%；P（P）=0.003）在治疗第14天(). 同样，经过14天的BPTES治疗后，肾脏重量为32%(P（P）=0.0003）小于DMSO治疗的肾脏(). 已知小分子3-二羟基-6-甲基-7-（苯甲基）-4-丙基萘-1-羧酸（FX-11）可抑制LDHA，LDHA是糖酵解途径的关键部分(36). 在单独的实验中，我们发现FX-11对肿瘤生长或肾脏重量没有明显影响，即使给药剂量能影响P493异种移植物，这是MYC条件驱动的淋巴瘤模型(37).
抑制谷氨酰胺酶可阻止MYC诱导的体内肾肿瘤发生。(A类)在2周内对一只BPTES治疗的小鼠和一只DMSO治疗的小鼠进行每周MRI扫描。(B)接受BPTES的肿瘤的MRI面积增长百分比(n个=8）或二甲基亚砜(n个=8）治疗。(C类)BPTES治疗的肾脏最终重量(n个=14），FX-11(n个=12）或DMSO(n个=18）与MYC灭活相比，MYC激活4周后。
组织学检查显示，BPTES治疗与肿瘤细胞减少相关，而DMSO和FX-11对肿瘤细胞减少无影响(图S10C类). 此外，我们通过Ki-67免疫荧光染色观察到，与DMSO处理的小鼠相比，BPTES处理的小鼠肾细胞增殖减少50%(图S11A类，第1行，和B). 经CC3染色检测，MYC失活后细胞凋亡无变化(图S11A类，第2行）或BPTES治疗小鼠(图S11C类). 这些结果表明，抑制谷氨酸分解阻碍了MYC诱导的RCC。因此，在这个转基因模型中，MYC似乎通常对谷氨酰胺代谢进行编程，较少依赖葡萄糖代谢(38,39).
MYC和谷氨酰胺酶在人肾细胞癌中过度表达。
最后，我们从斯坦福组织库和斯坦福病理学系询问MYC和谷氨酰胺酶蛋白表达是否与人类肿瘤相关。通过IHC，MYC在所有样本中表达；然而，集合管癌的表达水平明显较高(). 我们观察到，谷氨酰胺酶在所有收集的导管癌样本中都表达，但仅在60%的受试的透明细胞癌（ccRCC GLS+）肿瘤组织中表达。因此，我们的数据提示，人类透明细胞癌的一个子集可能使用谷氨酰胺水解作为优先的能量供应途径。
MYC和谷氨酰胺酶在人肾细胞癌中过度表达。(A类)透明细胞RCC（ccRCC）和收集导管RCC（cdRCC）人体样本中谷氨酰胺酶（GLS）（黑色条）和MYC（灰色条）的IHC染色的定量。(B)ccRCC和cdRCC人类样本中具有代表性的GLS和MYC染色。
讨论
我们生成了人类MYC驱动的RCC的条件转基因小鼠模型(5,6)从而在体内证明MYC可以诱导并持续表达，以维持RCC。我们的结果与先前的观察结果一致，即MYC途径是活跃的，基因经常被扩增和过度表达，基因组改变与遗传性RCC相关(4——6). 这些MYC诱导的肿瘤具有高度侵袭性肿瘤亚型的表型特征，即肾细胞聚集性导管癌(40). MYC失活逆转了与阻滞、凋亡和衰老相关的肿瘤特征。RCC与许多基因产物的突变有关，如抑癌基因、Von Hippel–Lindau（VHL）基因和酪氨酸激酶受体（MET）等癌基因(三,41——48)和PI3K突变(5). 值得注意的是，PI3K似乎通过MYC维持肿瘤形成(49). MYC也已被证明在肾癌亚群中被基因激活，其过度表达在肾癌中更为常见，但其因果作用尚未通过实验验证(40,50——54). 我们在这里建立了MYC可以在条件转基因小鼠模型中引起RCC，其失活可以诱导持续的肿瘤退化。相反，激活的K-RAS是另一个癌基因，在人类肾细胞癌中既没有发现，也不足以诱导小鼠肾细胞癌，这说明了激活癌基因的组织特异性效应。
我们建立了一个RCC的本地转基因小鼠模型，该模型对于开发新的治疗方法通常是有用的。使用DESI-MSI，我们确定了与对照肾脏和MYC-OFF组织相比，MYC-ON RCC组织中相对丰度较高的复合脂质。大多数脂质种类被鉴定为PG。有趣的是，DESI-MSI检测到的脂质谱变化以前曾在人类RCC中报告过。特别是，与邻近的正常肾组织相比，在人类肾细胞癌中观察到更高的PG相对丰度（18:1/18:1）(55). PG在大多数非肿瘤动物组织中含量较低（1–2%），可以作为心磷脂的前体，心磷脂是一种复杂的脂质，几乎只存在于线粒体膜中(56). 肾癌和其他MYC诱导的癌中观察到的PGs增加与MYC对线粒体生物发生的诱导一致(57)与Warburg癌症理论有关(58). 重要的是，MYC可能通过MondoA（MLXIP）增加脂质以增加SREBP-1，从而诱导关键的成脂基因：FASN和SCD(59). 这反过来会增加脂肪酸(60)用于合成更复杂的磷脂。我们之前在MYC诱导的HCC和淋巴瘤中观察到PGs的高丰度。因此，我们的结果进一步表明MYC表达与PG代谢之间的关系。
此外，我们使用DESI-MSI原位评估特定谷氨酰胺分解代谢物丰度的变化。转基因小鼠模型的基因表达分析表明，谷氨酰胺途径上调，但葡萄糖途径未上调。这些结果表明，肾癌细胞对谷氨酰胺作为能源上瘾。
BPTES对谷氨酰胺酶的抑制阻止了MYC诱导的RCC在体内外的生长，并导致增殖停滞。BPTES是谷氨酰胺酶1的选择性抑制剂(27,61,62). 我们的结果表明，抑制谷氨酰胺酶1对肾癌有抗肿瘤作用，并且MYC相关肾癌对谷氨酰胺有依赖性。然而，在此模型中，对BPTES无反应的谷氨酰胺酶2也被MYC激活；谷氨酰胺酶2提供了一种逃逸机制，可能导致体内缺乏更有力的抑瘤作用。我们发现抑制葡萄糖代谢对肿瘤生长几乎没有影响。我们认为，抑制谷氨酰胺代谢可能是治疗与MYC过度表达相关的RCC的一种先前未确定的治疗方法。
