简介
β-catenin在干细胞维持和更新、细胞存活、增殖、胚胎模式、器官发生、分化、细胞迁移和极性等过程中发挥作用,调节肝脏发育、体内平衡、代谢、再生和致癌过程中的许多事件(). β-catenin蛋白由非结构的N端和C端尾部组成,尾部位于12个犰狳结构域的核心两侧。每个犰狳结构域都是一个由三个字母结构组成的42氨基酸模块(Huber等人,1996年),整体结构假设为右手超螺旋线,带正电荷的凹槽沿着螺旋线螺旋(Graham等人,2000年). 它是高度保守的,并出现在后生动物谱系中(Schneider等人,2003年),在细胞中发挥双重作用,作为连接跨膜蛋白E-钙粘蛋白和肌动蛋白细胞骨架的粘附分子连接的参与者(McCrea和Gumbiner,1991年;McCrea等人,1991年;Aberle等人,1994年;Rimm等人,1995年)以及通过TCF家族转录因子的结合和去表达作为信号效应器(Behrens等人,1996年;Huber等人,1996年). β-catenin的调节发生在翻译后;它在细胞质中组成性表达,但其活性是通过磷酸化事件调节的,磷酸化事件可调节其与E-钙粘蛋白的亲和力(Piedra等人,2001年)和α-胡萝卜素(Aberle等人,1996年;Ozawa和Kemler,1998年;Piedra等人,2003年)以及它被蛋白酶体降解(Aberle等人,1997年). 跨膜FZD受体转导WNT分泌蛋白的信号(Bhanot等人,1996年;Wang等人,1997年)能够通过灭活其降解复合物来稳定β-连环蛋白(Cook等人,1996年;Papkoff等人,1996年;Aberle等人,1997年;Nakamura等人,1998年;Sakanaka等人,1999年;Swiatek等人,2004年). 在没有这些信号的情况下,由糖原合成酶激酶3β(GSK3β)组成的蛋白质复合物将细胞质β-连环蛋白磷酸化为苏氨酸41和丝氨酸33、37和45(Rubinfeld等人,1996年;Yost等人,1996年)、大肠腺瘤性息肉病(APC)(Munemitsu等人,1995年)、AXIN(池田等人,1998年;Nakamura等人,1998年)和酪蛋白激酶I(CKI)(刘等人,2002;Swiatek等人,2004年) (). 这些残基的磷酸化允许E3泛素连接酶复合物识别和泛素化,包括含有F-box蛋白β-转导蛋白重复序列的蛋白βTrCP(Hart等人,1999年)26S蛋白酶体最终降解(Aberle等人,1997年). 新的证据表明,β-catenin的激活和核转位可受越来越多的因素影响,而非WNT途径蛋白,包括几种酪氨酸激酶(Roura等人,1999年;Piedra等人,2001年;Monga等人,2002年;Sekhon等人,2004年;Lilien和Balsamo,2005年;Apte等人,2006年;Zeng等人,2006年;Berg等人,2007年;Rhee等人,2007年) ().
β-catenin信号在肝脏病理生理学中起着多重作用。β-连环素信号调节细胞增殖、分化、存活、代谢和氧化还原状态。通过这些事件,β-catenin在肝脏发育、再生、干细胞辅助再生和分区等生理过程中发挥重要作用。β-连环蛋白通过调节代谢,可能与酒精性肝病(ALD)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)有关,并通过其在细胞增殖和存活中的作用在肝癌中发挥重要作用。
Beta-catenin信号。答:Wnt通过受体卷曲和共受体LRP5/6发出信号,诱导由Axin/APC/GSK3β/CK组成的β-catenin降解复合物失活,使低磷酸化的β-catanin转位到细胞核,在细胞核中结合TCF/LEF并反式激活靶基因。B类:β-连环蛋白的激活也明显独立于Wnt信号,通过在生长因子(GF)的存在下激活受体酪氨酸激酶(RTK),导致β-连环素的酪氨酸磷酸化及其靶基因的核移位和反式激活。
发育中的β-catenin
Wnt/β-catenin途径在胚胎植入前的整个发育过程中至关重要。在小鼠和其他羊膜中,受精卵经历一系列细胞分裂,然后形成空化,形成一个称为胚泡的空心球。胚泡植入母体子宫内膜,然后变平并伸长为一个圆柱体,该圆柱体由称为外胚层的外杯状上皮层、内脏内胚层和胚外内胚层组成。在哺乳动物和鸟类的原肠胚形成过程中,一群外胚层细胞迁移到囊胚的中线并进入形成原始条纹,最终形成中胚层和最终的内胚层。WNT和TGFβ信号传导对原始条纹的模式化导致前部区域可能形成心脏组织产生的前中胚层以及肝内胚层产生的最终内胚层。
在原肠胚形成前E5.5,在胚外内脏内胚层和E6外胚层细胞的狭窄区域可检测到活性β-连环蛋白,这些细胞继续形成原始条纹。此后,β-catenin信号在原始牛排和淋巴结中都发生(Mohamed等人,2004年). 试图识别负责激活β-catenin的Wnts揭示了重量1和第1部分局限于胚泡内细胞团,Wnt3a、-6、-7b和-10b在整个胚泡中表达,以及Wnt9a型囊胚腔周围细胞的表达。在原肠胚形成前不久,重量2b表达发生在假定原始条纹后端的流前胚胎中,其表达随着条纹的形成而扩大。此外,WNT3在推动原肠胚形成中起着关键作用,这一点可以从以下方面得到证明:重量3形成原始条纹、维持或产生中胚层的突变体(Liu等人,1999年;Barrow等人,2007年). 同时,WNT信号拮抗剂Sfrp1、Sfrp5,以及Dkk1公司在中游期前内脏内胚层的部分重叠区域表达(Kemp等人,2005年). WNT在后内脏内皮层的表达和WNT拮抗剂在前内脏内皮的表达建立了WNT活性的前后梯度(). WNT/β-catenin活性还促进TGFβ家族成员Nodal的表达,其表达从后原肠胚前外胚层向外辐射,并被前内脏内胚层(AVE)中的蛋白酶和Cerberus和Lefty拮抗,以创建自己的梯度(Perea Gomez等人,2002年). 通过调节Wnt、FGF和BMP通路,结节信号促进后外胚层原肠胚形成的启动(Haramoto等人,2004年;Onuma等人,2005年). 这些梯度共同促进内脏内皮细胞的顺行趋化性,从而在原始条纹的形成和前后轴的建立中发挥作用(Conlon等人,1994年;Brennan等人,2001年;Perea-Gomez等人,2002年;Lu和Robertson,2004年). 原肠胚形成后,Nodal以剂量依赖的方式促进内胚层和中胚层特异性基因表达程序,较高水平的基因表达指定内胚层,较低水平的基因表示指定中胚层(文森特等人,2003年). 最终的内胚层来源于原始条纹前端Wnt介导的Nodal表达,Nodal活性促进内胚层转录因子的表达,包括GATA4-6、Eomesodermin、混合样蛋白、Foxa1-3和Sox17(Ang等人,1993年;Arceci等人,1993年;Laverriere等人,1994年;铃木等人,1996年;Gao等人,1998年;Germain等人,2000年;青木等人,2002年;Brennan等人,2002年;Ben-Haim等人,2006年;Hagos等人,2007年;霍华德等人,2007年;Arnold等人,2008年).
β-catenin在产前肝脏发育中的时间作用和调节。答:在E5.5断奶前胚胎中,Wnt活性的梯度由Wnts和Wnt拮抗剂(sFRP和Dkk)的区域表达控制,促进原肠胚形成,Wnt表达区域最终产生肠管来源的前内脏内胚层。B类:在E8周围的肠管模式中,通过增强sFRP5表达抑制Wnt活性可促进腹侧前肠内胚层的肝脏功能。此时,来自发育中心脏的FGF和来自横隔间质的BMP信号以及来自侧板中胚层的维甲酸也有助于提高肝脏功能。抄送:Wnt信号传导在E9形成前肠模式后立即恢复活性,在此期间,肝内胚层细胞经历从柱状到假分层的形态转变,导致增厚到早期肝芽。在斑马鱼中,Wnt2bb是侧板中胚层中维甲酸活性的下游靶点,对肝脏发育的适当时机至关重要;然而,小鼠体内的Wnt配体尚未确定。医生:Wnt/β-catenin活性,结合HGF/Met活性和FGF,促进组成肝芽的双潜能成肝细胞的扩张。电子邮箱:Wnt/β-catenin活性似乎对胆管上皮细胞(BEC)分化和肝细胞向肝母细胞分化都至关重要。当WNT活性促进BEC分化时,WNT+HGF组合似乎导致肝细胞分化。
Sox17是一种对内胚层发育至关重要的HMG盒转录因子,与β-catenin合作转录靶点包括Hnf1型β,福克斯1,以及福克斯2在后内胚层。通过表达反义寡核苷酸抑制Sox17活性(Clements等人,2003年)或显性阴性Sox17蛋白(Hudson等人,1997年)干扰内胚层的形成,Sox17靶向缺失的胚胎是致命的胚胎(Kanai-Azuma等人,2002年). 此外,在早期内胚层细胞中可以检测到核β-连环蛋白,β-连环素的缺失导致Sox17靶点的抑制(Sinner等人,2004年)揭示了这两个因素在正确内胚层形成中相互作用的关键作用。
β-catenin基因空等位基因的胚胎纯合子Ctnb1号机组并表现出前后轴结构的紊乱,表现为类鲸鱼和Lim1号机组-表达预期的前内脏内胚层组织,缺乏中胚层和头部形成,以及缺乏后中胚层标记物的表达Brachyury公司和鹅科动物和前标记的表达六角、Hesx1、Otx2,以及工程1(Huelsken等人,2000年). 除了因缺失重量3(Liu等人,1999年;Barrow等人,2007年)β-catenin在胚胎模式形成中的作用得到了以下研究的进一步支持:β-catentin活性通过WNT共受体的缺失而被破坏Lrp5(Lrp5)和Lrp6号机组(Kelly等人,2004年),导致节的形成、轴的形成和内胚层的建立被破坏。此外,DKK1介导的内源性Wnt活性阻断抑制中胚层分化(Lindsley等人,2006年)组成活性β-catenin促进外胚层细胞的早期中胚层分化(Kemler等人,2004年). 最近使用胚胎干细胞的体外模型也支持这一作用,因为WNT3A或低水平激活素的治疗会导致细胞群在基因表达模式和发育潜力上类似于后原始条纹细胞,而高水平激活素治疗可诱导类似前原始条纹的细胞群(Gadue等人,2006年).
Wnt/β-catenin信号在肝脏规范中的作用
根据前肠内胚层规范,Wnt/beta-catenin信号的激活似乎在将这些内胚层祖细胞的命运转变为肝脏特异性命运方面至关重要,特别是在斑马鱼和爪蟾中。在爪蟾,Wnt配体重量2b由位于前肠内胚层侧翼的中胚层在20期和32期之间表达,并表达分泌型Frizzled相关基因sFRP5型可以检测到与重叠十六进制-第25期至尾臀期37/38的持续表达区(Pilcher和Krieg,2002年)此时肝芽可见。在斑马鱼中,一种新型Wnt亚型的表达,2亿瓦特在18 h.p.f(对应于小鼠发育过程中的E7.5)内胚层模式开始时通过原位杂交观察到,并持续到52 h.p.f.(啮齿动物出生后第8/9天)。的突变2亿瓦特,或用反义吗啉寡核苷酸抑制其表达,导致肝发育严重延迟,这一点在24小时内很明显,此时肝芽正在扩张(华莱士和帕克,2003年). 将野生型细胞注射到侧板中胚层,而不是内胚层,可以挽救这种表型,这表明驱动这一阶段肝脏发育的Wnt2bb信号是由侧板中胚层(LPM)产生的(Ober等人,2006年). 此外,使用热冲击诱导显性负三氟化碳构建结果显示,在16h.p.f和21h.p.f之间抑制β-catenin活性导致肝组织缺失或显著减少,而在25h.p.f.下热休克的鱼则形成大小不等的肝脏(Ober等人,2006年). 野生型APC杂合子动物出现肝脏肿大,可通过注射针对β-连环蛋白的吗啉反义寡核苷酸或抑制β-连环蛋白活性(显性阴性)来纠正TCF公司。空气污染指数+/−胚胎表现出内胚层模式的缺陷,表现为肝芽扩大而胰腺芽消失,这与肝脏前切区向胰腺域的扩张一致。细胞移植实验证实,β-catenin在肝脏形成中的作用是细胞自主的。通过热休克诱导表达Wnt/β-catenin活性的时间调控重量8证实虽然内胚层的前切规范需要抑制Wnt信号,但该途径对肝脏规范至关重要(Goessling等人,2008年).
有趣的是,视黄酸生物合成酶视黄醛脱氢酶2型(RALDH2)的突变导致斑马鱼肝芽形成的延迟与2亿瓦特通过外源性全反式维甲酸治疗或注射拉尔德2mRNA。缺少2亿瓦特在这些动物中也观察到LPM的表达,这表明维甲酸可能是诱导2亿瓦特表达式(根岸等,2010).
培育Foxa3-Cre和floxedβ-catenin转基因小鼠可成功删除HNF4α表达肝细胞E9.5处的β-catentin(Tan等人,2008年). 虽然在该模型中未对前肠内胚层的肝脏规格化阶段进行专门评估,但在E9.5观察到的原始肝芽在对照组和β-catenin-null肝脏中具有可比性,并且差异仅在发育后期才显现出来,如下文所述。因此,β-catenin在小鼠肝脏规范中的作用尚未明确。
β-连环蛋白活性在肝脏形态发生中的作用
β-catenin在肝脏形态发生过程中的作用是多效性和高度暂时性的。β-连环蛋白最初是在肝形态发生的早期阶段扩张成肝细胞所必需的,后来对成肝细胞向BEC的正确规范以及肝细胞成熟很重要(Tan等人,2008年).
有确凿证据表明β-连环蛋白在小鼠肝芽扩张过程中的作用。在发育中的肝脏中,β-catenin蛋白水平在E10–E12达到峰值,然后逐渐下降。核/细胞质β-连环蛋白染色也在E10–E12处达到峰值并逐渐减少,并且与PCNA阳性细胞的百分比相关,这与β-连环素在驱动肝母细胞增殖中的作用一致(Micsenyi等人,2004年). 此外,E3鸡肝原基感染表达N端和C端截短的组成性活性β-连环蛋白的病毒构建物,导致E15处肝肥大,以及靶细胞中的高核质比和肝母细胞样形态,破坏结构组织,细胞间接触松动,糖原储存减少,E-钙粘蛋白同源物L-CAM在细胞质而非膜质的定位,突出了β-连环蛋白在肝祖细胞扩张中的功能(Suksaweang等人,2004年). 相反,WNT拮抗剂的表达Dkk-1型或抑制β-catenin活性的显性阴性LEF1产生体积过小的肝脏,细胞增殖减少,凋亡增加,脐带结构和窦状细胞受损,L-CAM表达和糖原储存能力降低(Suksaweang等人,2004年). 斑马鱼(Goessling等人,2008年)还有爪蟾(McLin等人,2007年)Wnt信号转导还可促进肝脏规格化后肝祖细胞的生长和分化。
在无血清、WNT3A条件培养基存在下体外培养的10天胚胎肝脏显示胆道增生和肝细胞分化受损。WNT3A条件无血清培养基加sFRP-1培养导致细胞增殖和存活率下降以及形态缺陷。在含有血清的培养基中生长可以挽救肝脏表型,在无血清WNT3A条件培养基中添加HGF也可以挽救肝脏的表型,这表明虽然β-catenin足以分化BEC,但MET和β-catening活性都是肝细胞分化所需的() (Hussain等人,2004年).
在类似的培养系统中,胚胎第10天的肝脏在靶向β-catenin的反义磷酸二甲酯吗啉寡聚物(PMO)的存在下培养72小时,由于增殖显著减少,凋亡显著增加,导致器官质量显著降低,β-catenin在肝母细胞扩张和存活中的作用。此外,PMO处理的肝脏显示出类似的白蛋白表达以及肝细胞谱系标记物Hep-Par染色(尿素循环酶氨甲酰磷酸合成酶1)(Butler等人,2008年)尽管有趣的是,相对于对照治疗和未治疗的肝脏,Hep-Par+白蛋白+细胞也显示出c-kit染色,表明缺乏分化。PMO治疗的肝脏还显示CK19阳性细胞的缺乏,导管周围c-kit阳性细胞(成肝细胞的标记物)的显著增加(Monga等人,2003年).
此外,APC缺失小鼠胚胎表现出早期β-catenin激活,导致成肝细胞分化为BEC,当移植到成年小鼠体内时,会形成完全分化的导管,从而在体内支持β-catening在成肝细胞BEC规范中的暂时作用。
最后,更令人信服的证据表明,缺乏β-连环蛋白活性会导致肝母细胞扩张失败,胆汁规格和肝细胞成熟都会出现缺陷,这是由具有肝母细胞特异性(FoxA3)的小鼠系产生的-Cre公司driven)β-catenin缺失(Tan等人,2008年). 具有这种缺失的胚胎在E16至E17之间因肝细胞增殖减少和凋亡增加而死亡,这可能是由于氧化应激调节受损所致。有趣的是,这些动物在成肝细胞分化方面存在明显缺陷,实质细胞表现出高核质比和非融合E13/14期成肝细胞的非极化形态学特征。此外,基因敲除的肝脏在BEC和转录因子表达方面都存在缺陷C/ebp公司肝细胞分化的α和HNF4α特征。肝β-catenin的缺失也会导致α-甲胎蛋白、白蛋白的表达降低(阿尔布),cyclin-D1,粘附连接蛋白E-cadherin,紧密连接蛋白ZO-2(Tjp2型)β-catenin靶向谷氨酰胺合成酶(Glul公司)、regucalcin(Rgn(右)),Egfr公司,细胞色素p450氧化酶周期2e1和Cyp1a2细胞,谷胱甘肽S-转移酶Gsta3、Gsto1,以及Gstm1型,鸟氨酸转氨酶(燕麦)和白细胞衍生趋化因子2(莱克特2)以及在成熟肝细胞中检测到的许多其他蛋白。常驻的未成熟细胞还显示4-羟基壬醛和丙二醛水平升高,表明氧化应激增加,这可能是由于谷胱甘肽-S-转移酶表达减少所致。
sFRP3是分泌型卷曲相关蛋白家族的一员,通常作为Wnt信号的可溶性拮抗剂,其存在会损害E14.5胚胎培养肝祖细胞的分化(Bi等人,2009年). 而sFRPs sFRP1、sFRP2、sFRP4和SFRP3/FZDB都能够结合WNT3A(Wawrzak等人,2007年)然而,sFRP3的功能似乎不同,因为它不抑制Wnt3a信号(Galli等人,2006年;Wawrzak等人,2007年),但可能会抑制EGF信号(ScardigLi等人,2008年).
总之,上述发现表明β-catenin在肝脏形态发生中具有高度的时间性和多效性作用(参见总结)。β-catenin通过直接调节细胞增殖和通过调节氧化应激间接调节细胞存活,在肝芽扩张中发挥关键作用。此外,它在肝母细胞向胆道上皮细胞的转化中起着重要的暂时性作用,并最终指导肝细胞的渐进分化过程,可能通过调节Wnt通路的独立靶点集或通过调节细胞粘附和/或极性。
Wnt和Frizzle在肝脏发育中的表达:β-catenin信号的主要上游效应器
虽然许多WNT配体及其细胞来源在小鼠发育过程中尚未确定Wnt(重量)和Fzd公司已经分析了整个肝脏中的基因在肝脏发育的几个阶段,以及成人肝脏中单个细胞类型中的基因。在开发过程中,许多Wnt(重量)基因在肝脏中表达,包括Wnt1、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt9b、Wnt 10a,以及重量10b(Bi等人,2009年).预测值1-10也表示为Fzd 2、3、5、6、7、8产前最突出(Bi等人,2009年).SFrp2、3,以及5mRNA在E12.5和E14.5处较高,然后随着分化的开始而下降,但在sFrp1型和4随着分化的发生,它们的mRNA表达水平也会降低,在整个出生前和出生后的发育过程中保持显著水平(Bi等人,2009年)可能表明在出生后肝脏分区中起作用。sFRP3是分泌型卷曲相关蛋白家族的一员,通常作为Wnt信号的可溶性拮抗剂,其存在会损害E14.5胚胎培养肝祖细胞的分化(Bi等人,2009年). 而sFRP sFRP1、sFRP2、sFR P4和SFRP3/FZDB都能够绑定WNT3A(Wawrzak等人,2007年)然而,sFRP3的功能似乎不同,因为它不抑制Wnt3a信号(Galli等人,2006年;Wawrzak等人,2007年),但似乎反而抑制Wnt5a(Qian等人,2007年;刘等人,2008)以及EGF信号(ScardigLi等人,2008年).
在成年小鼠肝脏中,重量4由窦内皮细胞(SECs)、星状细胞和胆道上皮细胞(BEC)高度表达重量9b由SEC和BEC表示(Zeng等人,2007年). 成人肝细胞表达Fzd2、4、7,以及8以及生产重量5b(Zeng等人,2007年). 免疫组织化学检测发育中鸡肝周围表达的WNTs,在局部肝脏生长区检测到WNT3A和WNT8B,以及弥漫性周围和中央WNT5A和WNT 11染色(Suksaweang等人,2004年).
肝窦内皮细胞在分泌肝发育所需WNT信号中的作用的证据出现于素食主义者2-内皮细胞缺乏的空白小鼠表现出肝母细胞从肝芽迁移和肝细胞索形成的失败(Matsumoto等人,2001年). 在发育中的小鸡中,肝芽围绕并最终包裹着一条贯穿横隔(静脉导管)的静脉,该静脉分泌一种叫做Neurturin的化学引诱剂(Tatsumi等人,2007年). 此后,成肝细胞在横隔间质内放射状移动,排列成肝细胞索,肝细胞索由窦状内皮细胞排列,目前已知,这些内皮细胞通过分泌WNT9A介导这一过程(松本等人,2008年). 虽然这些发现说明了各种Wnt蛋白在肝脏发育中的作用,但对其在蛋白质水平上的表达及其对β-catenin活性的影响进行更好的评估,以及对所有Wnt和Fzd参与者及其对肝脏发育的贡献进行详尽的描述,仍有待完成。
非经典Wnt途径和非Wnt介导的β-儿茶素活性
值得注意的是,FZD的WNT激活可以激活典型的β-连环蛋白介导的信号通路或β-连环素非依赖的非典型WNT信号通路(WNT/Ca2+和WNT/平面电池极性),取决于电池上下文(Mikels和Nusse,2006年). WNT/PCP通路活性与FGF信号一起促进原肠胚形成期间背侧中胚叶的伸长,并调节肠伸长爪蟾(Li等人,2008年)斑马鱼通过wnt4a、silberblick/wnt11和wnt11相关的肠管融合(松井等人,2005年). 此外,前肠分泌的sFrp5在肠道模式形成过程中调节β-catenin活性,也抑制Wnt11介导的PCP活性,以允许适当的前肠形态发生(Li等人,2008年). 最近,WNT/Ca的活化2+WNT5结合Ryk的途径被发现可以调节原肠胚形成期间的定向细胞迁移。总的来说,非经典Wnt信号在肝脏发育中的作用尚待全面研究。
大量证据还表明,β-catenin可以被WNTs以外的信号激活,例如肝脏发育过程中间充质细胞分泌的生长因子。其中一种生长因子是成纤维细胞生长因子或FGF。FGF家族由22个FGF配体和7个酪氨酸激酶FGF受体组成,它们激活了Ras-Raf激活的蛋白激酶途径(Ornitz和Itoh,2001年). FGF在心脏中胚层的表达通过激活肝脏特异性基因的表达和促进成肝细胞的增殖来调节内胚层对肝或胰腺谱系的承诺(Jung等人,1999年). FGF受体FGFR1和FGFR4通过内胚层表达,FGF1和FGF2被证明可以激活分离的小鼠前肠内胚层中早期肝脏基因的表达。FGFs的肝脏承诺是剂量依赖性的,因为更高的浓度会激活肺特异性基因,而FGFR1和FGFR4的选择性抑制表明,通过Nkx水平测量,FGFR1的抑制会更强烈地干扰肝脏特异性。2(Serls等人,2005年). FGF8也由心脏中胚层表达,促进新生肝祖细胞的生长,揭示了不同FGF在肝脏发育不同阶段的作用(Jung等人,1999年).
一种FGF家族配体,FGF10,已被证明可以调节包括肺在内的其他内皮源性组织中祖细胞的增殖(Nyeng等人,2008年),胰腺(Norgaard等人,2003年),胃(Nyeng等人,2007年)、和肠道(Sala等人,2006年). 在小鼠胚胎第9天,Fgf10型mRNA表达在肝芽附近的横隔间质(STM)中检测到,其表达持续到E14.5,沿着胆管转移到肝表面,然后在E12.5分散在肝脏内,最后在E14.5局限于肝外胆道系统和门静脉(Kelly等人,2001年). 此外,最近的研究表明,来自胚胎星状细胞的FGF信号促进E9.5和E13.5之间的β-catenin激活和肝芽扩张。Fgf10型成肝细胞中β-catenin活性峰值与表达相关(Micsenyi等人,2004年),哪个快递玻璃纤维2b,以及Fgf10型−/−和玻璃纤维2b−/−动物表现出肝芽扩张受损。最后,体外培养E12.5顶部GAL+/+FGF10处理后,小鼠肝脏中β-半乳糖苷酶活性显著增加,这与细胞核易位和典型的β-连环蛋白活性一致(Berg等人,2007年).Fgf10型和玻璃纤维2b与野生型胚胎相比,基因敲除小鼠的肝脏体积减小,细胞凋亡增加,增殖中的成肝细胞磷酸化H istone H3、白蛋白和细胞角蛋白E12.5阳性,在许多方面与β-catenin活性被抑制的肝脏模型中描述的表型相似(Tan等人,2008年). 与FGF活性在发育中肝脏干细胞更新中的作用一致,当肝芽主要由增殖的未分化成肝细胞组成时,在E10、E11和E12小鼠肝脏中检测到FGFR激活,但此后当发生显著分化时,则不存在(Sekhon等人,2004年). 用FGF1、4或8处理体外培养的整个E10小鼠肝脏,可以丰富c-kit、alpha-feto蛋白和CK19阳性细胞的器官,这些细胞都是祖细胞的标记物,并防止导管结构的形成,表明分化受到抑制。此外,在所有三种FGF存在的情况下,Ki67染色的增殖增加,在FGF8存在的情况下,TUNEL染色的细胞凋亡也显著减少。最后,在FGF治疗中还观察到细胞质/核β-连环蛋白染色显著增加,同时膜β-连环素增加(Sekhon等人,2004年). 值得注意的是,FGF8具有最有效的作用,在之前的研究中,FGF家族成员被确定为促进肝祖细胞的扩增(Jung等人,1999年).
另一种能够独立于WNT-激活β-catenin的生长因子是肝细胞生长因子(HGF)(Monga等人,2002年),受体酪氨酸激酶c-MET的配体(Naldini等人,1991a,b条). 免疫荧光标记的MET和β-catenin共同定位在正常成年大鼠肝脏的膜上,免疫共沉淀分析表明,β-catenin-MET复合物独立于β-catenin-E-钙粘蛋白复合物存在于肝细胞膜上。在不含WNT的HGF处理的原代肝细胞培养物中观察到β-catenin的剂量依赖性核移位,同时通过联合免疫沉淀降低MET-β-catentin的结合,酪氨酸激酶结构域缺失的显性阴性MET未见这种效应(Monga等人,2002年). 各种β-连环蛋白酪氨酸残基的突变表明Y654和Y670是MET磷酸化的靶点,对诱导核移位至关重要。非磷酸化Y654F/Y670F突变体在TCF结合和细胞周期进入方面表现出缺陷(Zeng等人,2006年). 上述研究表明,E10体外培养的肝脏在无血清、含WNT3A的培养基中表现出胆道增生,但在WNT5A和HGF的存在下生长和形态发生正常(Hussain等人,2004年). 这表明HGF/Met和Wnt/β-catenin信号及其串扰在肝脏发育中具有重要作用。有趣的是,Met和β-catenin的各自敲除在肝脏表型上具有显著的相似性(施密特等人,1995年;Tan等人,2008年).
进一步研究MET活化与β-catenin活性之间的关系来自一项研究,在CMV启动子的控制下,将表达HGF的裸质粒DNA流体动力学注射到小鼠的尾静脉。与空载体注射小鼠相比,这些小鼠出现了以Met-β-catenin结合减少和β-catentin核易位增加为特征的肝肿大。最有意义的是,在β-catenin缺失小鼠中复制该实验并未显示出肝肿大,而是这些动物特有的肝重量与体重比率持续下降,证实了HGF诱导的肝脏生长刺激依赖于β-catentin活性(Apte等人,2006年). 研究表明,HGF通过β-catenin促进核转位增加和转录激活,同时降低GSK3β活性,这表明HGF/Met信号也可能调节β-catening的稳定(Papkoff和Aikawa,1998年).
其他蛋白质可以通过调节β-连环蛋白与其结合伙伴的亲和力来改变其活性。除了c-Met的靶向作用外,Y654还可以被EGFR和SRC磷酸化(Roura等人,1999年). FYN、FER或MET对残基Y142的磷酸化降低了α-胡萝卜素的结合亲和力(Brembeck等人,2004年)也有证据表明ABL对Y489进行磷酸化,这可能调节钙粘附素亲和力和β-连环蛋白的核移位(Rhee等人,2007年). 尽管迄今为止尚未进行研究,但FGF也可能通过Y654和/或Y142的磷酸化激活β-catenin,促进其与粘附连接的分离,并允许其进入核/细胞质池以影响基因转录。HGF在小鼠胚胎肝芽扩张期间激活MET,可能单独或与在此期间表达的众多WNTs之一结合,负责激活β-catenin活性。除了激酶外,磷酸酶还调节β-连环蛋白磷酸化,同样也可以影响其定位和活性(Lilien和Balsamo,2005年).
出生后肝脏中的β-连环蛋白活性
出生后肝脏的生长和发育也依赖于β-连环蛋白的活性。出生后肝脏出现广泛的细胞增殖,同时β-连环蛋白和核移位显著增加。增加Ctnb1号机组基因表达发生在P15,GSK3β激活和失活的循环模式发生在出生后的发育过程中,GSK3-β失活发生在P10和P20,激活发生在P5和P20。β-连环蛋白在出生后发育过程中与E-cadherin共定位,但与MET的关联直到P20才发生。在出生后第15天出现白蛋白Cre驱动的肝细胞特异性β-连环蛋白缺失的小鼠中,在第15天至第20天之间,相对于野生型,肝脏重量/体重比显著降低,并且这种降低在动物的一生中持续存在(Apte等人,2007年). 出生后,β-catenin主要定位在肝细胞膜上,在中心带肝细胞中有一些额外的细胞质染色,尽管免疫组织化学对核β-catentin定位的认识可能不足,因为在小鼠肝脏中检测它需要苛刻的抗原检索方法,核提取物的免疫印迹分析可能是一种更可靠的检测手段。事实上,成人肝脏中包含的所有其他细胞,如BEC、内皮细胞和星状细胞都表达β-catenin,尽管Wnt信号在这些细胞中的作用才刚刚开始研究(Zeng等人,2007年).
肝脏分区
在成人肝脏中,肝细胞并不相等,肝小叶内沿门静脉-脉络膜轴的位置决定了参与药物代谢、碳水化合物代谢、氨解毒以及胆汁生成和分泌的代谢基因的表达。WNT/β-catenin在这一现象中起着关键作用。活性β-catenin在周周表达,其负调控因子APC在门周表达,存在互补定位模式。诱导肝脏特异性缺失亚太区或通过病毒介导的过度表达抑制WNT信号Dkk1公司揭示β-catenin活性控制代谢基因的区域表达(Benhamouche等人,2006年). 不久之后亚太区缺失后,肝脏显示了一些周缘定位酶的延伸,包括β-catenin靶向谷氨酰胺合成酶(Glul公司)和谷氨酰胺转运体Glt1(Glt1)(Benhamouche等人,2006年). 同样,参与氨和尿素代谢的门脉周围酶谷氨酰胺酶2的表达(Gls2公司),精氨酸酶1(精氨酸1),氨甲酰磷酸合成酶I(Cps一)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(第1包)被压制亚太区氮代谢出现缺失和其他缺陷。此外,表达β-连环蛋白激活突变形式的小鼠,无论是ΔN131-β-连环素的转基因表达还是腺病毒感染的S37A-β-连链蛋白,其代谢基因表达的扰动与亚太区无效小鼠。编码WNT途径抑制剂Dickkopf-1的腺病毒感染野生型小鼠(Dkk1公司)产生静脉周围肝细胞向门脉周围肝细胞的大规模转化(Benhamouche等人,2006年). 此外,β-catenin的缺失,但不是c-myc公司,导致GS表达缺失,并使门周表达的氨甲酰磷酸合成酶I(CPS I)在中心静脉周围的表达延长,这意味着β-连环蛋白在c-myc非依赖性抑制门周代谢基因的表达中起作用(Burke和Tosh,2006年). 最后,虽然肝干细胞的自发分化导致其门脉周围酶的表达,但通过GSK3β抑制剂6-溴代二脲-3′-肟(BIO)的治疗,这些细胞中的β-连环蛋白的稳定性将其基因表达谱转换为静脉周围肝细胞的基因表达谱。
周期性表达的ChIP分析天然气和Cyp1a1细胞并在口周表达Gls2公司和H19型发现TCF家族成员LEF1与启动子上HNF4a结合位点的结合水平调节其转录。ChIP结果表明,β-catenin诱导的LEF1激活调节LEF1对HNF4α抑制活性的抑制,LEF1结合并取代静脉周围肝细胞中具有活性WNT/β-catening活性的启动子上其共有位点上的抑制性HNF4 a。对于门脉周围基因Gls2公司和H19型,在WNT/β-catenin通路活性激活的背景下,在转录抑制过程中,HNF4α被移位,伴随着LEF1的招募,仅限于其自身的共识位点(Colletti等人,2009年).
最近,β-catenin也被证明可以调节静脉周围肝细胞中I期药物代谢细胞色素P450(Cyp)酶和II期谷胱甘肽-s-转移酶的表达(Loeppen等人,2005年;Tan等人,2008年;Giera等人,2010年).
β-连环蛋白在成年肝祖细胞或卵圆细胞生物学中的作用
Wnt/beta-catenin信号在不同物种的肝脏再生过程中起着关键作用。利用肝脏手术切除或中毒性肝损伤等模型表明,β-catenin激活似乎对残余肝脏的最佳再生是必要的。此外,Wnt/beta-catenin信号也被发现存在于祖细胞介导的肝脏再生中,该再生仅在阻止肝细胞增殖的情况下对再生刺激作出反应。实验和临床上都观察到这是对慢性或急性肝损伤的反应(Hu等人,2007年;Apte等人,2008年;Yang等人,2008). 一些信号通路在这些瞬时扩增的祖细胞(也称为卵圆细胞)的出现、扩增和分化中起着重要作用(Erker和Grompe,2007年).
在大鼠经2-乙酰氨基氟治疗后2/3部分肝切除术(pHx)诱导的卵圆细胞激活模型中,pHx后5至10天卵圆细胞中活性核质β-连环蛋白的增加与卵圆细胞增殖的增加相关(Apte等人,2008年;Yang等人,2008). WNT1和FZD2的表达也在这些时候增加,与WNT途径抑制剂WIF1和GSK3β的减少一致(Apte等人,2008年). 最近,还发现Wnt1在卵圆细胞向肝细胞分化中起作用,因此shRNA-介导的Wnt1抑制不仅导致卵圆细胞增殖减少,而且还影响其向成熟肝细胞的分化(Williams等人,2010年). 因此,在发育过程中,Wnt信号在卵圆细胞增殖和分化中的作用可能具有高度的时间和环境依赖性。
在喂食含有3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢可立定(DDC)的饮食的动物中,也观察到小鼠卵巢细胞激活。这种治疗导致胆道和肝细胞损伤,随后出现不典型的导管增生和卵圆细胞反应(Preiseger等人,1999年;汤普森等人,2010年). 还通过使用肝细胞特异性β-连环蛋白条件缺失小鼠研究了DDC损伤后卵圆细胞中的Wnt信号(Tan等人,2006年) (). 与野生型动物相比,用DDC治疗β-catenin缺失小鼠导致卵圆形细胞标记物A6阳性细胞数量减少(Apte等人,2008年). 在另一项研究中,定量逆转录聚合酶链反应和原位杂交鉴定了几种Wnts公司在DDC治疗的门静脉三联体周围和非典型导管反应区域的动物中Wnt 7a、7b、9b 10a,以及11mRNA水平。对TOPGAL转基因β-catenin报告小鼠株进行DDC治疗,证实卵圆细胞/非典型导管细胞中β-catentin/TCF活性增加。此外,在DDC喂养小鼠肝脏分离的卵圆细胞中观察到活性β-连环蛋白和β-连环素/TCF报告活性增加,以应对纯化的WNT3A(Hu等人,2007年). 最后,尾静脉注射表达组成活性(S37Y)β-catenin的裸质粒DNA可诱导大量A6阳性细胞响应DDC治疗(Yang等人,2008).
DDC暴露15天后卵圆细胞中的β-连环蛋白。对照小鼠喂食DDC饮食15天,通过免疫荧光在肝切片中的卵圆细胞(箭头)中显示β-连环蛋白(红色)和A6(绿色)共定位(黄色)。同时,喂食DDC饮食的β-catenin条件性缺失小鼠的肝脏切片缺乏β-catentin(红色),A6阳性细胞(绿色)数量显著减少(箭头)。
有趣的是,在肝硬化和肝癌患者的切片中检测到OV6卵圆细胞抗体染色的细胞,并显示出核/细胞质β-连环蛋白定位,这表明β-连环素在人类肝脏病理学中也驱动卵圆细胞扩张。此外,从人肝癌细胞系分离的OV6+细胞显示出上皮干细胞标记CD133+以及其他一些祖细胞/干细胞标记物的富集,并且在裸鼠中表现出更强的致瘤性和对化疗药物的耐药性。用β-连环蛋白稳定剂治疗可使OV6+细胞的培养物富集,突出了β-连环素在肝肿瘤卵圆形细胞扩张中的潜在作用(Yang等人,2008). 这些观察结果意义重大,因为一部分肝细胞癌可能起源于肿瘤干细胞(Sell和Leffert,2008年)而Wnt/beta-catenin信号转导可能通过多种途径参与肝癌的发生,该信号转导因beta-catenin基因突变而独立参与这种肿瘤类型(蒙加,2009). 最近,在急性坏死性肝炎的增殖肝祖细胞中也检测到Wnt/β-连环蛋白信号的强烈激活(Spee等人,2010年).