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.2009年3月;136(3):1081-90.
doi:10.1053/j.gastro.2008.12.006。 Epub 2008年12月9日。

脊椎动物肝胆发育需要microRNA-30家族

附属公司

脊椎动物肝胆发育需要微小RNA-30家族

尼古拉斯·J·汉德等。 胃肠病学. 2009年3月.

摘要

背景和目标:microRNA(miRNA)在肝脏发育中的功能尚不清楚。为了解决这个问题,我们对小鼠胚胎肝脏中miRNA的表达进行了表征,对斑马鱼幼虫进行了功能性miRNA分析,并确定了新的肝脏miRNA靶点。

方法:将胚胎第15.5天、18.5天和出生后第2天从小鼠分离的肝RNA与小鼠miRNA微阵列杂交。通过Northern杂交和定量逆转录聚合酶链反应证实了微阵列结果。通过原位杂交确定所选miRNA的空间分布。使用反义介导的miRNA敲除对斑马鱼的miR-30a进行功能分析。通过敲除培养细胞后基因表达的微阵列分析确定miR-30a的靶点。

结果:共鉴定出38个差异表达的胎儿肝脏miRNA。发现其中几种miRNA在肝细胞、胆管细胞和肝脏内的非上皮细胞中表现出不同的时间和空间表达模式。其中两种(miR-30a和miR-30c)是导管板和胆管特异性肝miRNAs的第一例。斑马鱼幼虫体内miR-30a的敲除导致胆道形态发生缺陷。miR-30a的几个新发现的靶点是已知的肝脏发育和功能的调节因子。

结论:我们已经鉴定出其时空表达模式暗示其在肝脏发育和/或功能中的功能作用的miRNAs。其中之一,胆汁miRNA miR-30a是斑马鱼胆汁发育所必需的。这是首次证明miRNA在肝脏器官发生中的功能作用。

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数字

图1
图1。胎儿和出生后肝脏miRNA的表达
通过Northern杂交从妊娠中期胚胎、新生儿和成年期小鼠肝脏中分离出5微克总RNA,通过微阵列分析确定肝脏miRNAs的表达模式。所示斑点的暴露时间为:miR-122,10分钟;miR-127,4小时;miR-143、miR-223、miR-30a,24小时;miR-30c,5小时;miR-410,16小时;Val-tRNA,5分钟。
图2
图2。与导管板相关的微RNA
原位杂交法同时检测miR-223 RNA(A,B)、miR-30a(C)或miR-30c(D),免疫荧光法同时检测CK19(A,C,D)或弹性蛋白(B)蛋白,显示门周miR-222表达细胞位于发育中的导管板和血管内皮之间。相反,miR-30a和miR-30c主要表达于导管板本身。比例尺:100μm。
图3
图3。MiR-30a和MiR-30c在正常人体组织的胆管细胞中表达
同时检测人类肝脏中的miR-30a(A)或miR-30c(B)和CK19蛋白,发现两者都在人类肝脏(B)的胆管中表达。miR-30c的表达与miR-30a的表达无明显区别。比例尺:100μm。
图4
图4。胆道闭锁标本中MiR-30a和MiR-30c表达增加
在两名胆道闭锁患者肝移植时获得的肝外植体中双重检测miR-30a(A,B)或miR-30c(C,D)RNA和CK19蛋白。miR-30a和miR-30c在这种疾病中常见的增生性胆管中高度表达。比例尺:100μm。
图5
图5。斑马鱼miR-30a同源基因在肝脏中表达
斑马鱼miR-30a同源物的比色原位杂交显示,肝脏中的网状染色模式(如图所示)与胆管细胞的表达以及鳃弓(BA,箭头所示)和肠道(int)的表达一致。背向上,左前方。
图6
图6。注射针对斑马鱼miRNA30a的ASO的斑马鱼肝内胆管和胆管缺陷
(A) 注射对照寡核苷酸(cont)或抗miR-30a(α30a)GB的ASO的5 dpf仔鱼对PED6的摄取;内脏,肠。(B) 对照组和注射α30a的5 dpf幼虫的细胞角蛋白免疫染色(放大600x)。(C) (B)的示意图显示,ASO注射鱼的末端小管(箭头)数量减少,示意图中显示为较宽的线条。(D) 对照组和注射α30a ASO的5 dpf幼虫的低倍(2500倍)电子显微照片显示胆管细胞(bdc)和肝细胞(hep)。注意整体外观相对相似。(E) 高倍镜(10000x)显示一个典型的泪小管(c),在注射α30a ASO的幼虫中扩张并出现异常。
图7
图7。BMEL细胞miR-30a靶点的鉴定
(A) 通过转染BMEL细胞RNA的定量RT-PCR确认微阵列结果。选择微阵列分析中经α30a转染显著改变的基因。候选基因表达标准化为Hprt(小时)表达,并且结果相对于对照ASO处理细胞中的值1进行表达。(B) 荧光素酶报告子检测miR-30a对候选基因3'-UTRs的调节。将所示的3'-UTR亚克隆到双荧光素酶报告质粒中。荧光素酶活性因转染效率和对缺乏3'-UTR的报告质粒的影响而标准化。在对照ASO处理的细胞中,结果相对于值1表示*p<0.05

中的注释

  • 微RNA侵入肝脏发育。
    罗格勒CE。 罗格勒CE。 胃肠病学。2009年3月;136(3):770-2. doi:10.1053/j.gastro.2009.01.022。Epub 2009年1月23日。 胃肠病学。2009 PMID:19168065 没有可用的摘要。

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