谷氨酰胺补偿代谢促进胶质母细胞瘤对mTOR抑制剂治疗的耐药性

在体外和体内，由于mTOR抑制剂的作用，GBM中GLS和细胞内谷氨酸水平升高。

在刺激葡萄糖摄取和利用的EGFR/PI3K途径中，mTOR在引导可用氨基酸进入蛋白质合成中具有众所周知的作用。谷氨酰胺的摄取似乎也是脂质合成和碳供应的关键，以操作TCA循环。我们在U87胶质瘤细胞系中过度表达EGFR-激活突变（EGFRvIII），这已被证明可以增加mTORC1和mTORC2信号(20,21)。通过对用mTOR抑制剂（雷帕霉素或PP242）处理48小时的U87和U87/EGFRvIII细胞进行气相色谱-质谱（GC/MS）分析，我们确定了91种代谢物，其水平随着变构mTOR抑制物雷帕霉素或者ATP-竞争性mTOR抑制物PP242的反应而显著变化(图2和补充表1)。我们之前已经证明，雷帕霉素对体内模型和使用该药物治疗的患者的GBM细胞系中的mTORC2信号具有最小活性，而PP242同时阻断GBM细胞中的mTORC1和mTORC1信号(12,13,22)。各治疗组代谢物变化的主成分分析（PCA）表明，这三个组有明显的聚类或明显的分离(补充图2，A和B)。关键的差异代谢物是谷氨酸（谷氨酸）、天冬氨酸、柠檬酸（或异柠檬酸）和琥珀酸(补充图2B)。特别是，一些谷氨酰胺水解和TCA循环的中间产物在mTOR抑制剂的治疗下表现出增加，增加了谷氨酰胺有效代谢的可能性(补充图2C)。事实上，在U87/EGFRvIII模型中，两种mTOR抑制剂均显著抑制葡萄糖消耗、乳酸生成和细胞增殖，但没有增加细胞死亡(补充图3，A和B)。与Csibi等人的研究结果一致(23)，细胞内我-U87和U87/EGFRvIII细胞中的谷氨酸升高，使其能够在mTOR靶向治疗中存活(图3A)。此外，我们发现mTOR抑制处理后细胞内αKG、ATP和氨水平升高或至少保持不变，表明谷氨酰胺代谢的代偿性增加(图3B和补充图4，A和B)。这些结果表明GBM细胞可能对mTOR抑制剂产生耐药性。接下来，为了确定mTOR信号的抑制如何影响代谢途径，我们用mTOR抑制剂处理U87和U87/EGFRvIII细胞，以测试糖酵解和谷氨酸解途径中关键酶的基因表达(图3C)。值得注意的是，mTOR抑制剂处理U87/EGFRvIII和较小程度的U87细胞导致GLS公司(图3D)。特别是在2种GLS变体中(7,15)长肾型谷氨酰胺酶的表达(KGA公司)mRNA显著增加，而短谷氨酰胺酶C的表达(GAC公司)mTOR抑制剂治疗后mRNA下降(补充图4C)。葡萄糖转运蛋白1(葡萄糖转运蛋白1)，丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1系列)，和乳酸脱氢酶A(LDHA公司)雷帕霉素或PP242治疗后水平降低，与mTOR抑制糖酵解的作用一致(补充图4D)。最后，为了确定是否可以在体内检测到GLS表达，以应对mTOR靶向治疗，我们在治疗5天后分析了异种移植模型中表达EGFRvIII的肿瘤组织。PP242处理后，GLS公司与对照组相比，表达显著升高(图3E)。用另一种mTOR激酶抑制剂CC214治疗后也发现了类似的结果(22) (补充图5).

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图3

GLS蛋白和谷氨酸水平的代偿性升高使GBM细胞能够存活于mTOR抑制剂治疗。

(A类和B类)细胞内水平我-谷氨酸盐(A类)和αKG(B类)用1 nM雷帕霉素、1μM PP242或对照DMSO处理U87/EGFRvIII GBM细胞48小时。数据表示3个独立实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）<0.001，根据双尾学生的t吨测试。(C类)示意图显示了本研究中靶向的参与谷氨酰胺裂解的酶。二磷酸腺苷；Pi，磷酸盐。(D类)mRNA水平GS公司,GLS公司，溶质结合载体家族A1(SLC1A5型)、和GDH公司在U87和87/EGFRvIII细胞中。用1 nM雷帕霉素、1μM PP242或对照DMSO处理细胞48小时。数据表示3个独立实验的平均值±SEM*P（P）< 0.05; **P（P）<0.01，根据双尾学生t吨测试。(电子)用PP242治疗的EGFRvIII表达U87的异种移植物获得的GLS免疫组织化学图像(n个=2）或控制DMSO(n个=2）持续5天。组织用苏木精复染。比例尺：50μm。从每组的6个独立图像中测量相对染色强度**P（P）<0.01，根据双尾学生t吨测试。另请参见补充图2-5和补充表1。

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图2

比较代谢组学确定谷氨酸是一种潜在的代谢物，可促进对mTOR抑制剂治疗的耐药性。

经1 nM雷帕霉素、1μM PP242和对照二甲基亚砜处理48小时的U87/EGFRvIII GBM细胞中差异表达的代谢物2D层次聚类的热图表示。每列代表一个治疗组，每行代表一种代谢物。

GLS抑制使GBM细胞对mTOR靶向治疗敏感。

由于PP242相对于雷帕霉素对GBM细胞中两种mTOR复合物的活性增强，我们主要使用PP242进行进一步的功能分析(12,13,24,25)。在确认GLS在针对GBM的mTOR靶向治疗中的特定作用之前，我们测试了谷氨酰胺的可用性是否影响PP242介导的细胞死亡。TUNEL分析表明，谷氨酰胺剥夺显著提高了U87/EGFRvIII GBM细胞对PP242介导的细胞死亡的敏感性，这一点已由多聚ADP核糖聚合酶（PARP）裂解分析和TUNEL染色证实(补充图6、A和B)。接下来，我们在U87/EGFRvIII GBM细胞中诱导siRNA-介导的GLS敲除，并评估其对PP242反应的影响。siRNA转染导致GLS基因缺失，抑制了所有受试GBM细胞（U87MG和U87/EGFRvIII）的增殖，增强了EGFRvIII表达肿瘤细胞的抗增殖作用(图4A)。GLS敲除被证实可抑制谷氨酰胺摄取和NH4⁺通过U87和U87/EGFRvIII GBM细胞中GLS的酶活性产生谷氨酰胺(图3C和图4B)。值得注意的是，GLS的敲除显著逆转了mTOR靶向治疗耐药性，有效地使U87-EGFRvIII细胞对PP242介导的细胞死亡敏感，如PARP阳性和TUNEL阳性细胞所示(图4、C和D)。接下来，为了评估GLS的药理抑制可用于使GBM对mTOR靶向治疗敏化的可能性，我们测试了GLS抑制剂化合物968对调节细胞对PP242的反应的作用。化合物968以剂量依赖性的方式减少谷氨酰胺的摄取和谷氨酰胺分解代谢副产物（如氨）的分泌，抑制GLS活性(补充图7A)。在GLS活性受到抑制后，化合物968以剂量依赖的方式显著抑制GBM细胞增殖(补充图7B)。在TUNEL染色试验中，化合物968显著增强了表达EGFRvIII的GBM细胞的PP242介导的细胞死亡，尽管PP242或化合物968本身都没有促进广泛的肿瘤细胞死亡(图4E和补充图8B)。化合物968还增加了经PP242处理的EGFRvIII表达的GBM细胞的PARP裂解(补充图8A)。重要的是，化合物968和PP242的联合治疗并未导致正常人星形胶质细胞（SVGP12）的显著细胞死亡(图4E和补充图8C)，表明正常星形胶质细胞具有不同于GBM细胞的特征，并且GLS抑制在选择性地使GBM细胞对mTOR靶向疗法敏感方面具有潜在的临床用途。为了测试化合物968和PP242对GBM患者衍生肿瘤细胞的作用，我们从GBM患者建立了原代培养细胞（KMG02），EGFR/PI3K轴（p-EGFR[Y1068]、p-AKT[S473]和p-S6[S235/236]）以及GLS呈阳性染色(补充图9A)。TUNEL分析显示化合物968显著增强PP242介导的KMG02细胞死亡(补充图9B)。化合物968还增加了PP242处理的KMG02细胞的PARP裂解(补充图9C)。综上所述，这些结果证明了GLS在通过GBM细胞中的谷氨酰胺代谢介导mTOR激酶抑制剂耐药性中以前未知的作用。

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图4

GLS抑制使GBM细胞对mTOR靶向治疗敏感。

(A类)用2种GLS siRNA和干扰对照siRNA构建物转染U87和U87/EGFRvIII细胞24小时，并换成10%FBS培养基2天。细胞数代表3个独立实验的平均值±SEM。(B类)谷氨酰胺相对摄取量和NH4⁺对照GLS敲除U87和U87/EGFRvIII细胞的产量。数据表示3个独立实验的平均值±SEM*P（P）<0.05，根据双尾学生t吨测试。(C类)使用U87/EGFRvIII细胞的指示抗体进行免疫印迹分析，该抗体带有针对GLS的siRNA结构，或使用PP242或对照DMSO处理2天的对照LacZ。GLS、p-AKT（Ser473）和AKT的图像是使用相同的细胞裂解液从另一个凝胶中获得的。(D类)TUNEL染色的U87/EGFRvIII GBM细胞的代表性图像。用抗GLS的siRNA转染细胞，并用1μM PP242或DMSO处理对照LacZ 2天。用ImageJ软件对TUNEL阳性细胞进行定量。数据表示每组3个独立图像的平均值±SEM**P（P）<0.01，根据双尾学生t吨测试。比例尺：100μm。(电子)用1μM PP242和/或1μM化合物968处理2天的U87/EGFRvIII和SVGP12细胞的TUNEL染色。用ImageJ软件对TUNEL阳性细胞进行定量。数据代表每组3张独立图像的平均值±SEM。Tukey-Kramer诚实显著性检验用于多重比较检验***P（P）< 0.001. 另请参见补充图6–9。

GBM细胞需要GLS以α-KG依赖的方式存活mTOR抑制。

为了确定GLS介导mTOR靶向治疗耐药的下游机制，我们检测了αKG作为下游代谢物的参与。有趣的是，αKG的类似物二甲基αKG（dm-αKG）明显挽救了mTOR和GLS抑制处理的U87/EGFRvIII GBM细胞的活性(图5A)表明凋亡抵抗是通过αKG介导的，而αKG是TCA循环所必需的。为了确定TCA循环中的代谢变化，我们使用PP242和化合物968处理的U87/EGFRvIII GBM细胞，在含有dm-αKG的培养基中，通过GC/MS分析细胞内代谢产物。综合代谢组分析表明，经PP242和化合物968联合处理的细胞中TCA循环代谢物显著减少，包括柠檬酸和异柠檬酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸。重要的是，dm-αKG挽救了TCA循环中αKG下游代谢物、琥珀酸、富马酸和苹果酸水平的下降，这是对mTOR和GLS联合抑制的反应，但αKG上游代谢物的水平、柠檬酸和异柠檬酸没有得到显著挽救(图5B)。这些结果增加了葡萄糖和谷氨酰胺代谢协同调节癌症代谢重编程的可能性，并且GLS可能通过α-KG-依赖性补体驱动氧化TCA循环，使GBM细胞能够存活于mTOR抑制。

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图5

作为对mTOR抑制的反应，GLS以αKG依赖的方式促进GBM细胞的存活。

(A类)在用1μM PP242和1μM化合物968处理3天的U87/EGFRvIII细胞中，测试代谢产物dm-αKG（10mM）拯救生存能力的能力。通过台盼蓝排除法计算细胞死亡。数据表示3个独立实验的平均值±SEM。Tukey-Kramer诚实显著性检验用于多重比较检验**P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001. (B类)GC/MS分析针对用1μM PP242和/或1μM化合物968与正常DMEM或DMEM与dm-αKG（10 mM）处理24小时的U87/EGFRvIII细胞中TCA循环相关代谢物、丙酮酸和草酰乙酸、柠檬酸和异柠檬酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸。数据表示3个独立实验的平均值±SEM。Tukey-Kramer诚实显著性检验用于多重比较检验*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.

细胞系。

如前所述获得U87、U87-EGFRvIII和U87-EGFR等基因GBM细胞系(36)。U251、LN229、T98和A172人GBM细胞系和SVGP12人星形胶质细胞（ATCC）在DMEM（Nacalai Tesque）中培养，DMEM补充10%的FBS（生物工业）和100 U/ml青霉素和链霉素（Nacalae Tesqu），在5%的湿化CO中培养₂37°C培养箱。

抗体和试剂。

获得的抗体针对以下抗体：EGFR（细胞信号，目录2232）、p-EGFR Tyr1068（细胞信号学，目录2236）、p-AKT Ser473（细胞信号化，目录4060）、AKT（细胞信号传导，目录9272）、p-S6 Ser235/236（细胞信号传递，目录4858）、S6（细胞信号传播，目录2217）、PARP（细胞信号转导，目录9542）、，裂解PARP（Cell Signaling，目录5625）、GLS（Abcam，目录ab60709）、GLS1（Sigma-Aldrich，目录HPA036223）、GLS2（Simma-Aldrich，目录HPA38608）、β-actin（Ambion）和EGFR/EGFRvIII混合抗体（Novocastra）。所用试剂为雷帕霉素（LC Laboratories）、PP242（Chemdea）、GLS抑制剂（化合物968，Calbiochem）和dm-αKG（Sigma-Aldrich）。

RNA提取和实时PCR。

使用mirVana miRNA分离试剂盒（Applied Biosystems）提取细胞系、肿瘤样本和正常脑组织的总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）从20 ng总RNA合成第一链cDNA。按照制造商的说明，使用TaqMan基因表达分析（Applied Biosystems）对3μl稀释cDNA进行实时PCR。所有反应均一式三份。18S核糖体RNA作为内源性对照。采用应用生物系统7500实时PCR系统（Applied Biosystems）通过ΔΔCt法获取并分析定量mRNA表达数据。本研究使用了以下使用FAM-MGB染料进行的TaqMan基因表达分析：SLC2A1（SMID:Hs00892681_m1）、LDHA（SMID:Hs00855332_g1）、PDK1（SMID:Hs01561850_m1）、SLC1A5（SMID:Hs01056542_m1），GLS（SMID:%s00248163_m1 SMID:Hs03989560_s1），18S（SMID:Hs99999901_s1）。

质粒和siRNA转染。

使用全血清中的Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）将siRNA转染到GBM细胞系中，24小时后改变培养基。专门针对GLS（目录L-004548-01-0005）的On-TARGETplus SMARTpool siRNAs（Thermo Scientific，Dharmacon Division）和非靶向siRNA对照池在10 nM下使用。

基于免疫组织化学染色和图像分析的评分。

石蜡包埋组织切片取自神户大学医院的病理组织学和组织核心设施。玻片用苏木精复染以显示细胞核。染色强度由2名病理学家和/或2名不知道分子分析结果的神经肿瘤学家独立评分。使用Soft Imaging System软件进行定量图像分析，此前已证明该软件用于在使用靶向药物的临床试验中测量GBM样本中的药物特异性效应(11,12).

代谢物测量。

使用BioProfile 400分析仪（Nova Biomedical）测量培养细胞培养基中的葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸和铵。细胞在各种条件下的新鲜培养基中培养，48小时后测量培养基中的代谢物浓度，并将其标准化为每个样品中的细胞数量。

我-谷氨酸水平。

将培养细胞或snap冷冻组织样品溶解并用磷酸盐缓冲液均质。细胞内我-按照制造商的说明测量谷氨酸水平（Yamasa我-谷氨酸检测试剂盒）。

GC/MS分析。

如前所述，提取并衍生生物样品中的代谢物，并进行了一些修改(37,38)。根据之前报告中描述的方法，使用GC/MSQP2010 Ultra（岛津公司）和熔融石英毛细管柱（CP-SIL 8 CB低渗/MS；30 m×0.25 mm内径，0.25μm膜厚；安捷伦公司）进行GC/MS分析(39,40)。结果数据以CSV格式文件导出，并使用内部分析软件进行分析（AI输出）。该软件使用内部代谢物库进行峰值识别和量化。将所有数据归一化为内标物2-异丙基苹果酸的峰高。为了评估代谢组学实验中的技术差异，每个样品都被提取、衍生化并在3个重复中进行测量。

MRS研究。

对新诊断或复发的胶质瘤GBM患者进行术前MRI和MRS检查。使用3T MRI/MRS扫描仪（Achieva，Philips Medical Systems）获取MR光谱数据。使用8通道头部MRI线圈接收信号，使用正交体MRI线圈传输射频（RF）脉冲。使用双回波PRESS序列获得了单轴定位MR谱。MRS采集参数如下：1.5×1.5×1.5 cm^三，TR/TE=2000/35 ms，128个平均值，1024个复点用于光谱数据。感兴趣的体积（VOI）定位于实体肿瘤的代表性区域，由董事会认证的神经放射学家或技术人员确定。作为对照，还将体素放置在大脑对侧（非肿瘤侧）的同一解剖位置，以获得控制光谱。使用用户依赖的拟合程序（由Steven Provencher开发的LCModel）获得以mM/l VOI绝对单位表示的浓度估计值[http://s-provencher.com/pages/lcmodel.shtml])，它基于单个代谢物的模型光谱库(41,42)。对胆碱（3.22 ppm）、NAA（2.0 ppm）、葡萄糖（3.44 ppm）、乳酸（1.33 ppm）、谷氨酰胺（2.45 ppm）和谷氨酸（2.35 ppm）水平进行定量。还计算了总肌酸（肌酸加磷酸肌酸，3.0 ppm）的代谢物比率，明确假设该水平在正常和许多病理状态下是稳定的(43).

Xenograft模型。

将U87和U87-EGFRvIII细胞植入免疫缺陷BALB/cAJcl-nu/nu小鼠（Clea Japan）进行皮下异种移植研究。对于皮下植入，将培养的指数生长的肿瘤细胞进行胰蛋白酶化，通过台盼蓝排除计数，并在1×10的条件下重新悬浮⁶细胞/100μl，置于Dulbecco的PBS和Matrigel（BD Biosciences）溶液中。通过测量每个皮下肿瘤的垂直直径，用卡尺监测肿瘤生长。每天腹腔注射PP242（5 mg/kg）和/或GLS抑制剂（5 mg/kg/kg）和生理盐水治疗肿瘤。采取适当措施将动物的不适感降至最低，并在肿瘤植入和给药过程中使用适当的无菌手术技术。对濒死或有坏死肿瘤的动物实施安乐死。

统计学。

结果显示为平均值±SEM。PCA使用商用SIMCA-P Plus软件12.0.1版（Umetrics）进行。对多重比较测试进行了Tukey-Kramer诚实显著性测试。与双尾学生进行了其他比较t吨测试，除非另有说明。统计显著性定义为P（P）< 0.05.

我们要感谢神户大学脑瘤转化资源部的所有成员，感谢他们对生物标本和生物储存的支持。我们还要感谢Izumi Takayama（神户大学医学研究生院放射肿瘤学系）帮助进行TUNEL分析，Yukiko Takeuchi（神户学院医学研究生学院循证实验医学部）帮助进行GC/MS分析，以及Ryosuke Doi和Mitsuharu Endo（神户大学医学研究生院生理与细胞生物学系）帮助进行ATP检测。田中康夫部分得到了科学研究拨款（KAKENHI）（24791501）和武田科学基金会的支持。T.Sasayama、K.Hosoda和E.Kohmura也得到了科学研究补助金（KAKENHI）的部分支持（分别为25462258、24592126和25293309）。P.S.Mischel得到了路德维希癌症研究所（Ludwig Institute for Cancer Research）的支持，并获得了国家神经疾病和中风研究所（NS73831）、国家癌症研究所、Ben and Catherine Ivy基金会和Defeat GBM Research Collaborative（国家脑瘤学会的子公司）的资助。