获得性耐药患者衍生模型可以识别有效的癌症药物组合

摘要

基于基因型的患者选择应用靶向治疗对癌症治疗产生了重大影响。有效的靶向治疗，如酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），被广泛用于治疗患有非小细胞肺癌（NSCLC）的患者，这些患者在表皮生长因子受体或ALK公司易位(1–5). 然而，对这些抑制剂的获得性耐药性最终通过多种机制发展，通常在1-2年内[EGFR抑制剂在(6)和ALK抑制剂(7–9)]. 特别是，癌基因中可能发生次级耐药突变，从而阻止相应的TKI（例如EGFR T790M或ALK L1196M）对靶点的抑制。或者，耐药细胞可以发展一种补偿性信号通路或“旁路”，尽管原癌基因受到抑制，但仍能重建关键下游增殖和生存信号的激活(10)]. 随着更多有效克服靶基因二次耐药突变的药物的开发，这些旁路耐药机制可能会继续出现在临床环境中。

当前理解阻力的努力通常集中在两种不同的策略上。一种方法是模拟阻力的发展在体外使用敏感的细胞系模型，暴露于特定的靶向治疗，直到出现耐药性。第二种方法侧重于对耐药活检进行遗传分析，以确定可能导致耐药的新的遗传异常。然而，这两种方法都有不足之处。虽然在体外衍生的耐药细胞易于进行功能研究，尚不清楚哪些模型与临床相关，并且它们永远不能用于为个别患者的治疗决策提供信息。此外，现有的适合基因的细胞系很少可用于开发此类耐药模型（例如，现有的EGFR突变体不到10个，EML4-ALK细胞系不到5个）。因此，这些线可能只模拟潜在阻力机制的子集。相反，研究耐药活检的遗传学具有优势，即所发现的基因改变实际上发生在临床上。这些研究可以促进假设是什么导致了阻力，甚至投机如何治疗个别患者。然而，由于组织是不活动的，这种假设不能直接在耐药肿瘤细胞上进行测试。此外，许多抗药性癌症并不存在明显指向治疗策略的基因异常。在本研究中，我们描述了一个发现平台，该平台将获得性耐药癌症的遗传学与从相同耐药患者肿瘤中系统开发的细胞系的药理学询问相结合。这允许发现和评估临床相关耐药机制的治疗策略。

临床标本耐药细胞系的建立

最近的技术进步，包括Schlegel及其同事利用辐照饲养细胞开发的方法，促进了直接从患者标本中开发细胞系的能力(11). 如所示表S1非小细胞肺癌细胞系在患者样本（积液和活检）中的成功率约为50%，其中活检样本的成功率为38%。值得注意的是，大多数失败与样本中的低癌细胞数有关（见下文）。对于其中许多样品，在饲养细胞上建立细胞活性，然后在鉴定和筛选之前将这些细胞转化。如所示表S2，致癌突变(表皮生长因子受体或ALK公司)患者肿瘤中存在的细胞在衍生细胞系中得到了可靠的鉴定。

为了在这些获得性耐药患者衍生模型中确定有效的药物组合，我们在前期工作的基础上确定获得性耐药的旁路机制(10). 在这种类型的耐药性中，原始驱动癌基因和次级旁路轨道冗余地维持下游信号传导，如PI3K和MAPK途径，以促进细胞存活和增殖。这些癌症对主要驱动癌基因的单剂抑制具有抵抗力，并且对获得性旁路的单剂抑制剂具有类似的抵抗力，因为在任何一种情况下，非靶向通路都维持下游信号传导。然而，同时抑制这两条通路会抑制下游信号传导，导致生长停滞和细胞死亡(图S1A) (12–15). 因此，靶向相关旁路通路的药物与原发性驱动癌基因抑制剂联合给药时是有效的，但作为单一药物给药时相对无效(图S1B). 基于这一原则，为了发现有效的治疗策略并深入了解耐药的潜在机制，我们进行了一项筛选，将原始TKI（靶向驱动癌基因）与既定小组中的每种药物结合在一起。

我们组建了一个由76名目标特工组成的小组(表S3)针对细胞增殖和存活的一系列关键调节器，包括生长因子和发育信号通路、凋亡调节器、转录和蛋白质折叠机制以及DNA损伤传感器(表S4). 该药物小组包括先前确定的旁路通路抑制剂以及其他几个临床靶点。在存在和不存在固定浓度的TKI的情况下，每种药物的效力均在10000倍范围内进行测试(图S2A). 在添加主要TKI后，测定GI50（获得比未处理状态少50%细胞所需的药物浓度）和AUC（剂量-反应曲线下的面积）的结果变化。

为了评估我们策略的潜力，我们最初研究了五种先前建立的后天抵抗力模型在体外（即通过将敏感细胞长期暴露于TKI在体外)具有已知的电阻旁路轨道。在这些模型中，我们的方法以高度特异性鉴定了已知的耐药机制：例如，在先前表征的具有MET扩增的EGFR突变细胞系中(12)，MET抑制剂是屏幕上确定的唯一点击(图S2B、C). 在四个受试细胞系[HCC827 GR6(13)，HN11级(16)，SNU638 C1(17)和H3122 PFR3(7)]靶向已知旁路通路的药物是GI50和AUC变化最大的药物之一(图S3A–D). 第五种型号[A431 GR(16)]IGFR1抑制剂的作用不太显著，但概括了先前观察到的联合作用(图S3E). 因此，在这些先前研究的模型中，对76个药物小组进行无偏见的筛选，成功地确定了已知旁路通路的抑制剂。因此，我们将该方法应用于55种具有未知抗性机制的获得性抗性模型。其中20个模型直接来自ALK抑制剂（n=9）或EGFR抑制剂（n=11）进展的患者。剩下的行是派生的在体外(表S5). 为了将基因分析产生的信息与药理学询问进行比较，还通过下一代测序分析了患者衍生模型，以确定耐药的潜在基因原因(表S6、S7,数据库S1、S2).

患者衍生耐药非小细胞肺癌模型中的有效药物组合

在存在或不存在上述主要靶点抑制剂的情况下，对55种获得性耐药性模型中的每一种进行了76种化合物的测试（图1A). 对于驱动癌基因（即EGFR或ALK）中存在门控耐药突变的患者衍生耐药模型，将克服这些突变的下一代抑制剂用作组合筛查中的主要TKI。对初始筛选结果进行分析，以确定GI50和AUC变化的特定阈值，这些变化最有可能对生存能力产生强烈影响，并最大限度地发挥体内疗效（见材料和方法和数据库S2、S3和S4). 对MGH170-1BB细胞株进行筛选和评估的过程在图1A–C这些细胞来源于一名患有表皮生长因子受体对多种EGFR-TKIs产生耐药性的突变型肺癌(表S2,图1B). 屏幕清楚地识别出MET抑制剂是命中的(图1C)和MET抑制剂有效地使这些耐药细胞对EGFR抑制重新敏感(图1D左：屏幕格式，右：作为单一制剂或在MET抑制剂克里唑替尼的固定浓度下对吉非替尼的剂量反应）。EGFR和MET抑制剂的组合在一系列测试浓度范围内具有协同作用，平均存活率比Bliss独立模型预测的9种测试浓度低25%（参见表S8用于协同计算）。事实上，EGFR和MET抑制剂联合治疗可有效消除耐药细胞(图1E). 随后对该患者癌症石蜡包埋活检的评估表明遇见放大(图1G)对相应的MGH170-BB细胞系进行定量PCR，证实MET扩增(图1H). 因此，对来自患者标本的细胞进行无偏见的药理学询问明确表明，联合治疗得到了患者标本遗传分析的支持。

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图1

患者衍生细胞系中的屏幕示意图和概念验证

A类。屏幕工作流示意图。获得性耐药细胞系模型是在临床上对EGFR抑制剂或ALK抑制剂产生获得性耐药后，直接从患者的活检中获得的。筛选药物作为单一试剂进行测试，并在10种浓度（10000倍稀释范围）中存在单一固定浓度的主要TKI。72小时后，用CellTiter-Glo测定细胞活力。B。MGH170-1BB细胞系的相差显微镜检查，该细胞系来源于EGFR突变型肺癌转移灶，对EGFR抑制剂具有获得性耐药性。比例尺，100μmC、。MGH170-1BB细胞系的屏幕数据表示。y轴表示添加吉非替尼后产生的折叠变化GI50（GI50单药/GI50组合）。每个条形图都是单个药物的结果。当从单一药物到组合药物的AUC下降百分比大于10%时，条形图为彩色编码蓝色。当GI50偏移>4且AUC变化>10%时，药物被定义为“命中”（见材料和方法）D。左图：MET抑制剂crizotinib与1μM吉非替尼（红色）联合使用比单独使用（黑色）更有效。右图：Crizotinib（1μM）使MGH170-1BB细胞对吉非替尼再敏感。误差线为平均值+/-SEM。E。暴露于指示药物7天的MGH170-1BB细胞的长期增殖试验。细胞用结晶紫染色。F、。患者在接受厄洛替尼治疗期间病情进展后，对转移性骨病变的活检样本进行FISH分析。比例尺代表10μm。MET基因用红色表示，EGFR基因用绿色表示。G.公司。定量PCR分析显示与正常DNA相比，MGH170-1BB中MET过度表达。来自HCC827 GR6的DNA，具有MET扩增(13)，作为参考。误差线为平均−/+SEM。此实验重复3次。

在某些情况下，药理学询问允许评估非特征化基因变体的功能相关性。例如，以前未描述的FGFR3公司在来源于对EGFR TKIs获得性耐药患者的MGH156-1A细胞系中，变异被确定为导致耐药的关键因素(图S4A和表S2). 筛选和随后的后续研究明确表明，FGFR抑制剂使这些细胞对EGFR抑制剂重新敏感。这种组合还抑制了已知的调节增殖和存活的关键信号事件(图S4B–E). 细胞系和相应活检的遗传分析均显示FGFR3突变，Y649C，位于酪氨酸激酶结构域(表S6). 在此期间FGFR3公司以前没有观察到突变(http://www.cbioportal.org/public-portal)它与激酶结构域中反复出现的激活突变相邻。因此，在这个模型中，结合肿瘤材料的遗传分析和耐药肿瘤细胞的药理学评估，可以确定可行的治疗策略。此外，这一发现表明FGFR激活是一种真诚地该患者获得性抗EGFR抑制的机制。

在筛选的60个模型中，共鉴定出201个点击，平均每个细胞系3.4个点击（范围0到12）。在60个细胞系中的50个中至少发现了一次撞击(图S5和​和2A）。2安培). 已知具有重叠特异性的药物在细胞系中具有重叠活性，证明了数据集的稳健性（例如，参见图2A、2B和第5章). 值得注意的是，EGFR抑制剂往往在ALK和MET驱动的耐药株中都被击中，这与以前发表的报告一致(7,17). 因为通过激活PI3K途径重新激活PIK3CA公司突变和旁路RTK在获得性耐药癌症中常见(18)PI3K抑制剂在耐药细胞株的一个子集中被发现并不奇怪。重要的是，对细胞系的遗传分析不足以告知哪些癌症对这种组合敏感。值得注意的是，在大多数测试模型中，PI3K抑制剂不足以对原始TKI重新敏感(图2A,第5章). 确定了其他意料之外的药物组合。特别是，极光激酶抑制剂与EGFR抑制结合在许多表皮生长因子受体-突变细胞系。类似地，polo-like激酶抑制剂（BI2536）在5个EGFR-驱动的细胞系中被击中。每个抗性细胞系的完整命中情况如所示图S6。在在体外获得性耐药模型（具有一对敏感的“亲本”细胞系，耐药细胞来源于该细胞系），我们还试图确定与亲本细胞系相比，耐药模型是否对任何单一药物治疗产生了更高的敏感性(图S7). 该分析表明，在绝大多数情况下，耐药模型对单一药物治疗不敏感，这进一步支持了开发联合治疗的概念(图S7).

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图2

在独立抵抗模型中表示选定的屏幕点击

答：。图中显示了含有所示癌基因的细胞系的点击模式。每列代表一个细胞系，每行代表一个被以下药物抑制的靶点：Afatinib（EGFR）、AZD0530（SRC）、BYL719（PI3K）、ABT-263（BCL）、Dovitinib或BGJ-398（FGFR）、MK2206（AKT）、OSI906（IGFR）、BI2536（PLK）、AQD6244（MEK）、ZD1152-HQPA（Aurora kinase B）、MGCD265（MET）。每种药物都按照指示进行了彩色编码。B。每个型号的所有命中药物的数量和概况。每个方框代表一种药物，药物按靶点进行颜色编码。白色方框表示命中与不在所列目标中的药物相对应。对于来源于单一亲本系的抗性系，除了PC9的情况外，只提出了一个代表性模型，其中PC9 GR1和PC9 GR2都是由于仅在PC9 GR2中存在T790M突变而提出的。

确定耐药机制和联合治疗ALK公司-阳性肺癌

患者衍生的评估ALK公司-阳性模型确定了先前未描述的抵抗机制。MGH034-2A细胞系来源于一名患有ALK阳性癌症的患者的活检，该癌症对ceritinib（LDK378）产生了耐药性，后者是美国食品和药物管理局最近批准的第二代ALK抑制剂(19,20) (图3A). MEK抑制剂AZD6244与铈替尼联合使用是一个强有力的打击(图3B、3C顶面板，协同效应，生存能力平均比Bliss预测的低45%(表S8). 此外，AZD6244处理也导致MGH034-2A对铈替尼的显著再敏感(图3C，底部面板）。据我们所知，以前没有报告表明MEK抑制剂使耐药的ALK阳性癌细胞对ALK抑制剂重新敏感。此外，在本研究中检测的其他ALK阳性患者衍生或实验室衍生模型中均未观察到MEK抑制剂致敏(图S8A)，说明了当前方法识别特定患者有效组合的潜力。长期生存能力测试表明，联合用药对细胞生存能力有显著影响，与药物治疗前的细胞数量相比，细胞数量明显减少(图3D). 因此，联合用药需要抑制PI3K、MAPK和mTORC活性，上调BIM并促进大量凋亡(14) (图3E,S8B型).体内，两种单一药物均无效，但联合用药可使肿瘤显著消退(图3F). 重要的是，细胞株的下一代测序（NGS）分析显示MAP2K1 K57N突变(表S7)之前曾报道为肺腺癌中MEK激活事件(21)虽然既不与激活的RTK突变相关，也不与获得性抗任何TKI相关。值得注意的是，该细胞系还含有JAK3 V722I变异体，JAK3的激活等位基因(22). 尽管如此，JAK3特异性抑制剂tofacitinib并没有出现在屏幕上(图S5)并且不会使MGH034-2A细胞或其他ALK细胞系对ALK抑制重新敏感(图S9A). 事实上，这些细胞没有表达明显水平的JAK3(图S9B、C). 该患者随后死亡，尸检获得的10个耐药病灶的NGS分析表明，11个病灶中的7个病灶中存在MAP2K1 K57N突变（值得注意的是，在另一个病灶中发现了PIK3CA突变）(图3H). 重要的是，MAP2K1 K57N突变出现在进展迅速的病变中，导致呼吸衰竭，导致患者死亡。尸检显示JAK3突变是种系变异，支持JAK3活性不驱动耐药性的功能数据。这些结果表明，如果在癌症对铈替尼产生耐药性后使用这些药物，MEK和ALK抑制剂的联合应用可能会对该患者产生治疗益处。重要的是，这些结果还表明，功能评估增加了仅由遗传分析提供的信息。单独对肿瘤进行基因分析，就像通常在临床上进行一样，不会区分针对MAP2K1 K57N突变和不太重要的JAK3 V722I突变。

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图3

MEK活化是抗铈替尼的机制

答：。MGH034-2A型号的衍生示意图。B。MGH034-2A细胞系的屏幕数据表示。y轴表示因添加铈锡（0.3μM）（GI50单剂/GI50组合）而产生的折叠变化GI50。当从单一药剂到组合药剂的AUC下降百分比大于10%时，条形图的颜色编码为蓝色。C、。上图：塞利替尼（0.3μM）对MGH034-2A中AZD6244效应影响的初步筛选数据。底部：在存在和不存在固定浓度的MEK抑制剂AZD6244（1μM）的情况下，显示了对西替尼的剂量反应曲线。D。MGH034-2A细胞的活性测定表明，与药物接触开始时的细胞数量相比，使用载体、铈替尼（300 nM）、AZD6244（1μM）或这两种药物的组合治疗6天后，细胞数量发生了变化。E。MGH034-2A的Western blot分析。用载体、铈替尼（0.3μM）、AZD6244（1μM）或这两种药物的组合处理细胞24小时。用所示蛋白的抗体分析裂解液。F、。用小鼠体内生长的MGH034-2A皮下异种移植物测定体内根据指示治疗时，通过测量肿瘤体积的变化来确定疗效。n=每组6只小鼠。G.公司。胸部的轴向CT图像显示了患者对铈替尼有反应后（治疗5.5周）和进展时（治疗9.5个月后）的疾病负担。右下叶的进展部位用箭头表示。H。患者尸检中发现的MAP2K1和PIK3CA突变的等位基因频率表。

SRC信号转导ALK阳性非小细胞肺癌获得性耐药

多种SRC家族激酶抑制剂在几种患者衍生的ALK阳性耐药非小细胞肺癌模型中持续有效(图2). 特别是，AZD0530（萨拉卡蒂尼）在9个经测试的患者衍生ALK系中的6个中获得成功(图2A). AZD0530在屏幕上大受欢迎的模型对单一代理AZD5530的敏感性不显著，这表明，与其他情况一样，这些细胞系并没有切换到完全不同的依赖性。另一方面，在ALK抑制剂存在的情况下，这些耐药ALK阳性细胞系对AZD0530高度敏感(图4A). 此外，还观察到AZD0530和ALK抑制剂之间的药物协同作用（在所有浓度下，五种模型的存活率平均比预期低20%，重复测试三次，与Bliss的最大差异为18%-45%(表S8). 另外两种药物（达沙替尼和KIN001-113）能有效抑制SFK(23,24)AZD0530是热门车型(图2B,第5章). 然而，由于AZD0530具有更有利的特异性(25)，我们在随后的研究中使用了这种药物。AZD0530被击中的每个型号（如中箭头所示图4A)AZD0530对ALK抑制显著敏感(图4B). 值得注意的是，其他ALK驱动的模型也显示了敏感性的变化，AZD0530表明SRC激酶广泛参与ALK抑制剂反应的可能性。有趣的是，AZD0530在任何突变型中都没有成功表皮生长因子受体或HER2型癌症放大，9例中只有1例遇见放大的癌症(图S5).

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图4

SRC抑制在多个模型中恢复对ALK抑制剂的敏感性

答：。将AZD0530的GI50在每个筛选模型中表示为单一代理或与主要TKI结合。被点击的模型是彩色编码的红色。AZD0530得分为点击的细胞系的GI50由箭头连接。阴影区域表示在筛选的所有品系中，对于单剂值，前10%敏感模型中的GI50值。B。每种ALK+患者衍生的获得性抗克里唑替尼或铈替尼模型的GI50。对照细胞系模型（MGH006-1A、H3122、SU-DHL-1、KARPAS299、NB-1）和获得性抗性（MGH06-1A PFR1、MGH006-1 A PFR2、H2228 PFR1，H3122 PFR1和H3122 PFR3、H3122x4.2）对克雷唑替尼的敏感性作为比较标准。将敏感性模型（H3122、H2228、MGH051-1B、H3122 PFR2、MGH021-2cl4、MGH006-1A、MGH026-1A、MGH039-1A）和获得的对西替尼的抗性模型（MGH021-5、H3122 LDKR1、H3122 LDKR2、H3122 LDKR2、H3122 LDRK4）作为比较标准。每种型号的GI50均为单剂（黑色），并与AZD0530（1μM）（红色）结合使用。给出了三个实验的平均GI50。箭头表示屏幕识别的点击。C、。给出了MGH010-1A型（耐克里唑替尼）对克里唑替尼的剂量-反应曲线。左侧面板显示了在没有或存在AZD0530（1μM）（红色）的情况下，单剂克里佐替尼（黑色）的剂量反应。中间的面板显示了克里唑替尼对野生型SRC（黑色）或激酶头SRC（K295R，红色）慢病毒过度表达细胞的影响。右侧面板显示GFP慢病毒表达（黑色）或两种SRC-靶向shRNAs中的任何一种（蓝色和红色）的影响。D。4个ALK株系（MGH010-1A、MGH025-1A、MGH049-1A、MGH 045-1A）的六天存活率测定。与治疗开始时的细胞数相比，每个面板显示了使用载体、ALK抑制剂（克里唑替尼1μM或铈替尼300 nM）、AZD0530（1μM）或组合治疗后细胞数的百分比变化。

接下来，我们旨在确定AZD0530的相关目标。激酶头SRC K295R的过度表达(26)，以及使用两种shRNAs中的任何一种单独敲除SRC，有效地再现了AZD0530的作用，表明在AZD0.530靶点（包括多个SFK）中，SRC抑制足以使细胞对ALK抑制重新敏感(图4C). 我们观察到，当与ALK抑制剂结合时，多个ALK驱动模型对SRC和EGFR抑制剂都敏感。然而，AZD0530的活性似乎不是由EGFR抑制直接或间接驱动的，因为AZD0.530没有抑制ALK阳性MGH025-1A细胞中EGFR的激活，而ALK阳性细胞是由AZD5530致敏的(图S10A). 此外，一些细胞系，如MGH010-1A，被AZD0530致敏，但EGFR抑制剂不致敏(图2A,S10B型). 接下来，我们研究了ALK和SRC联合抑制对来自患者活检的三种耐药ALK阳性模型的影响：MGH010-1A和MGH025-A（耐克雷唑替尼，无ALK耐药突变）和MGH049-1A（耐铈替尼，没有ALK耐药变异(27)). 在所有三种模型中，当使用任一药物作为单一药物治疗时，细胞在6天时生长，但与治疗前的细胞数量相比，联合治疗导致细胞活性丧失(图4D)和强烈的凋亡细胞死亡（S11A）。与这些结果一致，ALK-TKI未能完全抑制下游信号传导（AKT、MAPK或S6K），除非在这些抗性模型中存在AZD0530(图5A和S11B型).

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图5

ALK抑制和SRC信号

答：。MGH025-1A的Western blot分析。细胞用载体、克里唑替尼（1μM）、AZD0530（1μM）或这两种药物的组合处理24小时。用所示蛋白的抗体分析裂解液。B。用克里唑替尼（300 nM）或铈替尼（300nM）治疗24小时的患者衍生耐药ALK模型的Western blot分析。制备裂解液并用所示抗体进行印迹。C、。使用指定的ALK抑制剂治疗24小时后，基因表达的折叠变化（Log2）。上图：用GO术语“细胞外基质”注释的上调基因。底部：用GO术语“细胞周期”注释的下调基因（仅前30个基因）。D。小鼠体内生长的MGH025-1A皮下异种移植物按如下方式处理：Vehicle（n=4只小鼠）、crizotinib 25 mg/kg daily（n=6只小鼠）和AZD0530 50 mg/kg dail（n=5只小鼠），或两种药物的组合（n=8只小鼠）。误差线为平均值−/+SEM。星号表示Dunn多重比较测试的P<0.0001。

在AZD0530有效的每种患者衍生ALK模型中（包括MGH034-2A，该模型勉强未能满足我们对AZD5530的点击阈值），ALK抑制导致SRC活性的强烈上调，如SRC底物帕罗西林的磷酸化所测(图5B). 因此，ALK抑制可能导致SRC信号的上调，可能是通过释放通常协调ALK和SRC活动的负调控信号。相反，在EGFR抑制剂治疗后的EGFR突变型癌症中，我们并没有一致地观察到通过对帕罗西汀测量的SRC活性的增加(图S11C)与AZD0530在EGFR突变癌中的无疗效一致。此外，在ALK驱动的模型中，SRC信号也通过抑制ALK下游的信号通路而上调。有趣的是，尽管在个别模型中，ALK调节的下游通路不同，但ALK调控的通路往往是抑制SRC信号的通路。例如，当ALK抑制主要影响PI3K信号传导而不影响MEK活性时，PI3K抑制上调SRC信号传导(图S12A). 此外，当ALK抑制抑制MAPK和PI3K信号时，SRC信号被PI3K或MAPK信号强烈上调(图S12B). 总的来说，这些结果与ALK活性在ALK驱动的癌症中广泛抑制SRC活性的模型相一致。

为了进一步表征ALK抑制对这些模型的影响，我们在存在或不存在ALK抑制剂的情况下对每个ALK阳性患者衍生模型进行了24小时的基因表达分析。ALK抑制诱导表达的基因中最丰富的基因本体是细胞外基质和基底膜（Benjamini-Hochberg校正的p值1.75E-04和2.31E-04）(图5C,数据库S6–S8). 众所周知，SRC信号是整合素介导信号和细胞外信号转导的焦点，这些结果进一步支持了以下发现：在ALK阳性肺癌中，当ALK信号受到抑制时，SRC活性增加。

最后，我们测试了ALK-TKIs和AZD0530联合使用的疗效体内采用小鼠异种移植模型。在MGH025-1A中（来自一名ALK阳性且对克雷唑替尼耐药的患者），单药克雷唑替尼治疗34天后导致肿瘤进展。然而，AZD0530和克里唑替尼联合使用可在60天内产生持续、深刻的反应(图5D). 值得注意的是，当AZD0530被添加到克里唑替尼进展的异种移植物治疗中时，肿瘤复发(图S13A). 为了测试AZD0530对筛选出协同效应的耐药模型的特异性，我们在HCC827 GR6线路上进行了测试，该线路有MET旁路，对AZD5530没有影响。在该模型中，AZD0530与吉非替尼的联合用药与吉非替尼加克里唑替尼（一种有效的MET抑制剂）相比无效(图S13B). 因此，AZD0530的作用对于在屏幕上发现联合疗效的模型来说是特别的。

由于我们在大量患者衍生的ALK阳性耐药模型中观察到SFK抑制剂的显著活性，我们还确定了ALK抑制剂与AZD0530的联合是否可能延迟相对敏感模型中获得性耐药的出现。我们检测了MGH045-1A细胞系，这是一种建立于患者肿瘤对克里唑替尼耐药的模型，因为获得了ALK激酶域门控蛋白残基（L1196M）的突变(表S2) (27). Ceritinib可以克服L1196M突变，在该细胞系的筛选中用作主要TKI，AZD0530是一个亮点(图2A). 该细胞系对新一代ALK抑制剂ceritinib相对敏感，可有效抑制L1196M(27). 治疗6天以上在体外单剂ceritinib有效地抑制了细胞生长，但certinib和AZD0530的联合使用导致细胞活力几乎完全丧失(图4D). 因此，ALK抑制和AZD0530都需要完全抑制关键下游信号事件(图S13C).在体内，如前所述，单药ceritinib减缓肿瘤生长(27)，但这种结合导致了更持久的反应(图S13D). 这进一步证明了一个观点，即初始治疗结合SRC和ALK抑制剂可以帮助ALK阳性肺癌患者产生更持久的反应。

对ALK阳性模型中1000-gene NGS小组发现的突变进行分析，未能发现SRC家族激酶和其他已知SRC活性调节因子的突变(表S7). 因此，药理学方法确定了一种单靠基因组分析无法轻易预测的药物组合。

讨论

总之，我们开发了直接从患者标本中获得的EGFR和ALK抑制获得性耐药性的细胞培养模型，以快速识别能够克服耐药性的组合。这些初步研究表明，在50%的收集标本中成功建立了非小细胞肺癌模型。然而，我们相信，通过使用专门用于细胞系生成的活检，可以进一步提高成功率。目前，活检被优先用于标准病理分析，细胞系是从任何剩余组织中生成的。因此，样本的质量并不理想。事实上，在大多数（24/39）“失败”中，我们分析的样本中含有的癌细胞不到20%。尽管存在这些障碍，但在大约一半的病例中成功开发了细胞系模型。因此，如果活检主要是为了这个目的而分离的，在IRB批准的方案的支持下，我们相信这种方法可能会被探索作为一种诊断方法来指导治疗决策。我们还预计，这种方法将推广到其他固体和液体肿瘤恶性肿瘤。

这里提出的方法的稳健性由以下成功率证明体内研究。所有五个测试模型（MGH034-2A(图3)，MGH045-1A(图S13)、MGH025-1A(图5D)，PC9 PFR2(图S14)和PC9 GR1(图S15)证明了实质性回归体内使用发现的活动组合。重要的是，对患者衍生样本的功能评估可以提供遗传分析无法提供的见解。例如，由于SFK或其调节因子中未发现突变，遗传分析无法轻易预测SRC抑制对耐药ALK阳性癌症的影响。此外，我们的结果说明了患者衍生细胞的功能评估如何补充遗传分析。例如，FGFR抑制剂在先前未经特征化的模型中有效FGFR3公司突变(图S4). 在缺乏功能数据的情况下，突变的生物学后果将是不确定的。

通过使用该药理学平台询问患者衍生的耐药性模型，我们发现了几种以前未描述的药物组合表皮生长因子受体突变体和ALK公司-在后续研究和体内我们推测，未来可以探索类似的方法，作为一种诊断测试，以确定针对个别患者的治疗策略[在机构审查委员会（IRB）批准的方案的支持下]。在当前的研究中，我们在细胞完全建立后对其进行筛选，这通常需要2-6个月的时间，这使得这种方法作为常规诊断测试并不理想。然而，当前程序结果的稳健性为使用新技术对活细胞进行筛选奠定了基础，这些活细胞是在活组织检查数周内获得的，可以在活组织切片中仍存在基质的情况下筛查癌细胞。事实上，对来自特定患者的耐药癌症活检的细胞进行这种功能筛选可能会为选择最有可能对特定患者有效的实验治疗提供信息，从而推动真正个性化癌症治疗的未来。

补充材料

致谢

参考文献和注释