辅活化因子SRC-2依赖性代谢重编程介导前列腺癌生存和转移

转录重编程支持脂肪生成。

为了了解前列腺癌细胞中SRC-2依赖性脂肪生成的机制，我们通过定量实时PCR（qRT-PCR）对参与糖脂代谢、TCA循环和谷氨酰胺代谢的酶（源自KEGG）进行了靶向基因表达分析。SRC-2缺失对代谢基因的表达有广泛影响，其中2个基因-脂肪酸合成酶(FASN公司)和硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD公司)-在SRC-2沉默后显著降低(补充表1)。FASN是一种多功能酶，可以催化乙酰辅酶a和丙二酰辅酶a合成长链脂肪酸，而SCD是一种去饱和酶，通过将双键结合到长链脂肪酸中来合成不饱和脂肪酸(11)。FASN和SCD与包括前列腺癌在内的各种恶性肿瘤的进展有关(11)但调控其在癌细胞中表达增加的确切机制尚不清楚。我们发现前列腺癌细胞中SRC-2表达的缺失和增加改变了FASN和SCD水平(图2，E–G、和补充图4，A–D)因此，我们着手进一步确定SRC-2在这2个基因转录调控中的作用。虽然已知SRC-2是AR的辅激活子，但我们在AR阳性细胞（LNCaP和C4-2）和AR阴性细胞（PC-3）中观察到了SRC-2依赖性FASN和SCD转录调控。为了进一步了解这一点，我们使用基因集富集分析（GSEA）方法研究了雄激素调节基因在LNCaP-siSRC2基因签名中的富集。我们比较了LNCaP细胞中LNCaP-siSRC2基因签名与雄激素诱导的（100 nM DHT）基因签名(29)也带有LNCaP-siAR基因签名。siSRC2调节基因未富集雄激素诱导的基因特征（标准化富集分数[NES]=–0.87，q个=1）或对于siAR响应签名（NES=–0.9，q个= 0.95) (补充图5，A和B)。相反，雄激素诱导的基因签名在siAR基因签名中显著丰富（NES=–2.99，q个<0.001）(补充图5C)。这些数据支持SRC-2并非完全通过AR发挥作用的观点，其与其他转录因子的关联可能解释了为什么SRC-2在侵袭性前列腺癌中过度表达到如此高的水平。

SRC-2 ChIP测序（ChIP-seq）数据分析(17)显示SRC-2在FASN公司和SCD公司启动子，与近端启动子区的固醇调节元件结合蛋白1（SREBP-1）固醇调节元素（SREs）重叠(30)。直接测试SRC-2和SREBP-1对FASN公司和SCD公司表达，我们使用FASN公司（-220至+25个基点）(31)和SCD公司（-1280至+174 bp）启动子结构。与内源性FASN和SCD表达的效应相吻合，SRC-2强烈激活两个启动子的转录，更重要的是与SREBP-1转录因子结合(图3，A和B)。然而，AR单独或与SRC-2联合未能激活荧光素酶驱动的FASN公司AR阴性PC-3细胞中的启动子，再次表明SRC-2独立于AR发挥作用(补充图5D)。同样，SRC-2单独或与SREBP-1联合沉默(图3C)大大削弱了FASN公司PC-3细胞中的启动子活性(图3D)表明SRC-2协同激活SREBP-1在FASN公司和SCD公司发起人。最后，ChIP分析证实了近端SRC-2和SREBP-1的强烈占据FASN公司启动子与未服务上游区域检测到的启动子的比较(图3E)。有趣的是，SRC-2消融显示SREBP-1在FASN公司发起人(图3E)这表明补充SRC-2作为辅激活子可能有助于SREBP-1在染色质上的稳定。总之，这些数据证实SRC-2转录调控脂肪酸生物合成基因主要是通过协同激活SREBP-1，而不依赖于AR。

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图3

SRC-2协同激活SREBP1，促进脂肪生成。

(A类)在仅存在载体SREBP-1、SRC-2或SRC-2和SREBP-2的组合的情况下，瞬时转染FASN-荧光素酶构建物（-220至+25 bp）的HeLa细胞中的荧光素素酶报告子分析(n个= 6). (B类)在仅存在载体SREBP-1、SRC-2或SRC-2和SREBP-2的组合的情况下，用SCD-荧光素酶构建物（-1280至+174 bp）瞬时转染HeLa细胞的荧光素素酶报告子分析(n个= 6). (C类和D类)在含有对照siRNA（siNT）、SRC-2-siRNA（siSRC-2）、SREBP-1-siRNA（siSREBP-1）或SRC-2和SREBP-2的组合的情况下，对转染FASN-荧光素酶构建物的PC-3细胞进行Western blot分析，然后进行荧光素素酶报告物分析。使用UVP Vision Works LS软件通过密度测定法分析每个波段的半定量水平，并用数字表示每个车道下归一化为肌动蛋白的相对值（与未经处理的相比）。完整的未切割凝胶如补充材料所示。(电子)来自稳定C4-2细胞shNT和sh18的SRC-2和SREBP-1的ChIP显示这两种蛋白在FASN公司发起人。测试的扩增子要么来自近端启动子区域（-140到-40 bp），要么来自转录起始点的非上游区域（-2000 bp）。IgG抗体用作对照，数据以输入染色质的百分比表示(n个= 4). 示意图显示了FASN公司发起人。数据表示平均值±SEM*P（P）Tukey多重比较测试的双向方差分析结果<0.05(电子)和**P（P）<0.001（学生）t吨测试(A类,B类、和D类).

SRC-2抑制锌转运蛋白ZIP1（SLC39A1）以激活ACO酶活性。

接下来，我们研究了SRC-2促进α-酮戊二酸还原羧化生成柠檬酸盐的机制，如同位素标记研究所示。谷氨酰胺代谢产生柠檬酸的酶的基因表达分析表明，SRC-2耗竭后没有任何显著变化(补充图6A)。然而，令人惊讶的是，我们观察到ACO酶活性急剧下降(图4A)，但不具有IDH或柠檬酸合酶（CS）活性(图4、B和C、和参考。32)与对照组C4-2细胞相比，SRC-2缺失的C4-2细胞。ACO通过以下途径催化柠檬酸盐立体异构化为异柠檬酸盐顺式-这种可逆反应是由细胞内锌浓度变构调节的(33)。有趣的是，在正常前列腺上皮细胞中，ACO活性因锌含量的增加而受损，而在前列腺肿瘤细胞中，由于锌转运蛋白ZIP1（SLC39A1）的丢失，这种阻滞被逆转(34)。我们推测SRC-2是前列腺肿瘤中ZIP1表达降低的遗传原因，从而间接调节ACO活性。事实上，我们发现邮政编码1除DU145外，正常前列腺细胞的表达明显高于大多数被检测的肿瘤细胞系(补充图6B)SRC-2的强制表达降低了内源性邮政编码1表达式(图4D)通过直接与近端启动子区结合(图4E)和抑制基因转录(图4F)。支持这一观察结果，我们发现邮编1SRC-2–KO中的表达(Ncoa2号机组^–/–)小鼠前列腺与WT同窝小鼠前列腺水平的比较(补充图6C)。为了验证ZIP1是否调节从头合成脂肪酸，我们测量了体外表达ZIP1的C4-2细胞中脂肪酸的质量同位素分布。ZIP1的过度表达从[5-¹³C] 谷氨酰胺，表明ZIP1介导的ACO阻遏阻碍了碳从谷氨酰胺流向脂肪酸(图4G)。这些发现表明，SRC-2刺激前列腺细胞ACO酶活性，至少部分是通过抑制ZIP1表达生成柠檬酸盐促进脂肪生成(补充图6D)。总之，这些数据表明，SRC-2通过还原羧基化途径介导的谷氨酰胺碳的使用是前列腺癌细胞（而非正常细胞）唯一获得的支持脂肪生成的代谢适应。

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图4

SRC-2抑制锌转运蛋白ZIP1的转录以刺激ACO活性。

(A类–C类)ACO、IDH和CS在稳定C4-2细胞shNT、sh18和sh19中的酶活性(n个= 5). (D类)qRT-PCR分析SRC2公司和拉链1(SLC39A1型)稳定的C4-2细胞shNT和sh18以及表达SRC-2腺病毒的C4-2 shNT细胞中的基因表达(n个=4/组）*P（P）Tukey多重比较测试的双向方差分析结果<0.05。(电子)来自C4-2细胞的SRC-2的ChIP显示SRC-2在邮政编码1近端启动子（-175-70bp）与起始位点的-5000bp上游区域相比。(F类)在单独存在载体（ZIP1荧光素酶）或SRC-2构建物（ZIP1-luc+SRC-2）的情况下，瞬时转染空pGL3载体（空荧光素酶）和pGL3-ZIP1-Luciferase构建物（-246至+82 bp）的HeLa细胞中的荧光素报告酶检测(n个= 6). (G公司)[5中硬脂酸盐标记的质量同位素分布-¹³C] 体外表达人ZIP1（Adv ZIP1）或控制病毒（Adv GFP）的C4-2细胞中的谷氨酰胺(n个= 3). 本研究中使用的质谱法未能检测到较高的脂肪酸同位素。数据表示平均值±SEM*P（P）<0.05和**P（P）<0.001（学生）t吨测试(A类,电子、和F类)，使用Holm-Sidak多重比较测试G公司。

谷氨酰胺摄入刺激SRC-2功能。

接下来，我们研究了引导SRC-2促进谷氨酰胺依赖性脂肪生成的上游信号事件。最近的研究表明谷氨酰胺是一种有效的信号分子(35)尤其是在营养紧张的环境中，因为这种分子刺激营养吸收和能量代谢(36)。当我们增加谷氨酰胺浓度时，我们观察到2个SRC-2靶基因的表达增加，FASN公司和SCD公司随后在SRC-2缺失细胞中受阻(图5A和补充图7A)。出乎意料的是，我们观察到SRC-2蛋白水平大幅增加(图5A)，但不包括mRNA水平(补充图7A)在富含谷氨酰胺的培养条件下，表明SRC-2在谷氨酰胺刺激的前列腺癌细胞中的翻译后调节。

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图5

谷氨酰胺刺激诱导SRC-2的mTORC1依赖性磷酸化。

(A类)Western blot分析含或不含谷氨酰胺（2 mM）生长的稳定C4-2细胞shNT、sh18和sh19中的FASN、SCD、SRC-2和肌动蛋白。(B类)HA–SRC-2免疫沉淀，然后进行Western免疫印迹，以使用磷酸化丝氨酸/苏氨酸（p-Ser/Thr）抗体检测SRC-2的磷酸化状态。从表达GFP腺病毒或SRC-2腺病毒的C4-2细胞获得输入裂解物，随后用增加浓度的谷氨酰胺（0.2 mM、2 mM和4 mM）刺激，然后用DMSO或mTORC1抑制剂torin（250 nM）处理。Actin用于规范化输入加载控制。用密度计分析磷酸化SRC-2的半定量水平，并用数字表示每个车道下归一化为肌动蛋白的相对值（与车道2中的值相比）。(C类)Western blot分析显示3种不同的siRNA对mTOR表达的影响。(D类)用非靶向siRNA或3种不同的mTOR siRNA转染表达SRC-2腺病毒的C4-2细胞，然后用或不用谷氨酰胺（2 mM）处理。免疫沉淀HA–SRC-2，然后进行Western免疫印迹检测SRC-2的磷酸化状态。GFP腺病毒作为阴性对照。(电子)用谷氨酰胺（2mM）或不用谷氨酰胺（2mM）刺激表达HA标记的WT SRC-2或磷酸化缺陷突变体S499A、S699A和S493A的C4-2细胞。HA用于免疫沉淀WT SRC-2或突变体，然后进行Western免疫印迹以检测SRC-2的磷酸化状态。肌动蛋白用于规范化输入负荷控制（HA–SRC-2）。肌动蛋白用作对照以使蛋白质负载对照正常化，GFP腺病毒用作对照病毒。完整的未切割凝胶如补充材料所示。

翻译后修饰，如磷酸化，有可能激活并增加辅活化子SRC家族的蛋白质周转(37)，最近的报告已经确定PI3K-AKT和mTORC1是可能被营养吸收激活的激酶(11,38)。因此，我们检测了用以PI3K-AKT和mTORC1为靶点的不同激酶抑制剂处理的谷氨酰胺刺激C4-2细胞中SRC-2蛋白的表达，并与葡萄糖刺激细胞中的效果进行了比较。在谷氨酰胺刺激的条件下，与DMSO处理的细胞中检测到的水平相比，mTORC1抑制剂torin下调了SRC-2蛋白水平(补充图7B)，SRC-2信使表达无明显变化(补充图7C)。然而，我们并没有在高糖/低谷氨酰胺条件下观察到这种效果，相反，用PI3K抑制剂沃特曼（WORT）治疗显示SRC-2蛋白水平有所降低(补充图7B)。令人惊讶的是，众所周知的mTORC1抑制剂雷帕霉素未能模拟都灵的作用，这表明SRC-2可能是其他人推测的mTORC的雷帕霉素不敏感底物之一(39)。同样，PI3K/mTORC1的双重抑制剂BEZ-235在两种培养条件下均未对SRC-2蛋白的稳定性产生任何影响。

增加谷氨酰胺治疗浓度可刺激mTORC1激酶活性(35)如我们的研究中mTORC1底物S6K1和4E-BP1的磷酸化所示(补充图7D)谷氨酰胺处理的C4-2细胞中HA-SRC-2的免疫沉淀显示SRC-2丝氨酸/苏氨酸磷酸化呈剂量依赖性增加，随后被都灵处理逆转(图5B)。为了验证mTORC1在谷氨酰胺刺激下负责磷酸化SRC-2，我们使用3种特异的siRNA诱导了mTORC的遗传抑制(图5C)并观察到C4-2细胞中磷酸化SRC-2水平降低(图5D)。先前用于确定mTOR底物的蛋白质组学筛选已确定SRC-2上的3个潜在位点：S499、S699和S493(40,41)。因此，我们进行了定点突变以产生丝氨酸-丙氨酸磷酸化缺陷突变体，发现SRC-2上的S699位点在谷氨酰胺刺激下主要被mTORC1磷酸化，而S499表现出部分效应(图5E)。这些数据表明，谷氨酰胺刺激翻译后通过mTORC1依赖性磷酸化修饰SRC-2。接下来，我们研究了SRC-2上mTORC1依赖性磷酸化增强SRC-2蛋白水平的机制。为此，我们在低谷氨酰胺（0.2 mM）或高谷氨酰胺（2.0 mM）浓度培养的C4-2细胞中进行了环己酰亚胺蛋白降解实验。谷氨酰胺刺激显著增加了SRC-2蛋白的稳定性和半衰期，这由环己酰亚胺时间依赖性处理决定(补充图8A)但这种增加的SRC-2蛋白稳定性被mTORC1抑制剂torin完全抑制(补充图8B)。这些发现表明，SRC-2上的谷氨酰胺-mTORC1依赖性磷酸化通过增加SRC-2蛋白质的半衰期，从而提高SRC-2蛋白表达水平，从而使SRC-2稳定。

最后，我们研究了mTORC1抑制是否影响SRC-2的转录活性。谷氨酰胺信号诱导的SRC-2驱动FASN公司启动子活性(图6A)以及加强对SRC-2的招聘FASN公司和SCD公司发起人(图6、B和C)，并且这种谷氨酰胺依赖性SRC-2活性被托林显著阻断(图6，A–C)。据报道，谷氨酰胺通过α-酮戊二酸以依赖RAG的方式促进mTORC1活化(35)，我们使用细胞可渗透的α-酮戊二酸类似物辛基-α-酮戊二酸来逆转SRC-2磷酸化中的低谷氨酰胺条件。如所示图6D谷氨酰胺刺激增加SRC-2磷酸化，而都灵治疗降低SRC-2的磷酸化。相反，α-酮戊二酸类似物辛基-α-酮戊二酸部分逆转了SRC-2磷酸化过程中的低谷氨酰胺水平，表明谷氨酰胺依赖性mTORC1激活以RAG依赖性方式刺激其下游靶点SRC-2的磷酸化。此外，mTORC1抑制剂torin也能重现在SRC-2消融条件下观察到的降低的血脂水平(补充图9，A–E)。综上所述，这些数据表明肿瘤细胞摄取谷氨酰胺以mTORC1依赖的方式激活SRC-2(图6E)反过来，转录调节FASN和SCD的表达，从而促进脂肪生成。

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图6

谷氨酰胺刺激增强SRC-2的转录活性。

(A类)用FASN-荧光素酶构建物转染表达GFP腺病毒或SRC-2腺病毒的PC-3细胞，并用高糖（11 mM）/低谷氨酰胺（0.2 mM）或高谷氨酰胺（2 mM）-低葡萄糖（5 mM）浓度刺激，然后用DMSO或torin（250 nM）处理。然后进行荧光素酶分析以测量FASN公司启动子活性，数据归一化为总蛋白(n个= 4). (B类和C类)来自C4-2细胞的SRC-2的ChIP显示SRC-2在FASN公司和SCD公司启动子在有或无都灵（250 nM）的情况下刺激谷氨酰胺（2 mM）。图中显示了测试的扩增子。IgG抗体用作对照，数据以输入染色质的百分比表示(n个= 3). (D类)HA–SRC-2免疫沉淀，然后进行Western免疫印迹，以使用磷酸化丝氨酸/苏氨酸抗体检测SRC-2的磷酸化状态。从表达GFP腺病毒或SRC-2腺病毒的C4-2细胞获得输入裂解物，随后用增加浓度的谷氨酰胺（0.2 mM和2 mM）刺激，然后用DMSO或mTORC1抑制剂torin（250 nM）处理。使用细胞可渗透辛基-α-酮戊二酸来缓解低谷氨酰胺水平对SRC-2磷酸化的影响。Actin被用来规范化加载输入。完整的未切割凝胶如补充材料所示。(电子)示意图描述了拟议的谷氨酰胺/mTORC1信号通路，其中SRC-2是调节协同激活SREBP-1的转录功能的关键下游介体。数据表示平均值±SEM*P（P）<0.05和**P（P）<0.001（学生）t吨使用Holm-Sidak多重比较测试。

SRC-2定义了前列腺癌细胞的生物能量学。

为了研究SRC-2的表达是否定义了肿瘤细胞的代谢状态，我们分析了SRC-2扰动后前列腺癌细胞的生物能量参数。与对照shNT细胞相比，SRC-2消融的C4-2和PC-3细胞显示出显著降低的基础代谢率（参考图中的0至20分钟时间范围）(图7A和补充图10A)。虽然寡霉素治疗降低了耗氧量（参考25至40分钟的时间范围），但添加解偶联剂羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）显著提高了耗氧率（OCR），表明最大呼吸容量（参考45至65分钟的时间框架）前列腺癌细胞中(图7A和补充图10A)。然而，与对照（shNT）细胞相比，SRC-2缺失细胞的最大代谢率显著降低，表明其在调节前列腺癌细胞生物能量学方面的重要性(图7A和补充图10A).

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图7

SRC-2定义了人类前列腺癌细胞的代谢和能量程序。

(A类)稳定C4-2细胞shNT、sh18和sh19中基础和最大OCRs的实时测量(n个=3/组）*P（P）<0.05和**P（P）通过Tukey多重比较检验的双向方差分析，与shNT相比<0.001。(B类和C类)在DMSO对照组中测量稳定C4-2细胞shNT、sh18和sh19的基本OCR和最大OCR(B类)或FCCP处理(C类)在高葡萄糖（11 mM）/低谷氨酰胺（0.2 mM）或低葡萄糖（5 mM）和高谷氨酰胺（2 mM）浓度下培养的细胞(n个=3/组）。方框图和胡须图显示了最小到最大值（胡须）、25%和75%四分位数（方框）以及中间值（水平线）**P（P）<0.001（双尾学生）t吨测试。(D类)在完整培养基中培养的稳定C4-2细胞shNT、sh18和sh19的细胞内ATP水平(n个=3/组）。方框和胡须图显示了最小到最大值（胡须）、25%和75%四分位数（方框）以及中间值（水平线）*P（P）<0.05和**P（P）通过单因素方差分析得出<0.001。(电子)克隆形成存活试验显示，在2周的营养应激期间存活下来的稳定表达shNT、sh18和sh19克隆的C4-2细胞数量。(F类)克隆存活试验中观察到的菌落总数电子数据表示平均值±SEM*P（P）<0.05和**P（P）<0.001（学生）t吨测试。

接下来，我们测量了在不同营养条件下培养的肿瘤细胞的代谢率。前列腺癌细胞（shNT）暴露于高谷氨酰胺/低葡萄糖水平时，其基础细胞数均较高(图7B和补充图10B)和最大代谢率(图7C和补充图10C)与暴露于高糖/低谷氨酰胺水平的细胞相比，表明谷氨酰胺代谢在维持强大的能量学程序中的重要性。相比之下，SRC-2消融细胞的基底细胞显著降低(图7B和补充图10B)和最大代谢率(图7C和补充图10C)与对照细胞相比，增殖率降低(补充图10，D–F)。我们还观察到最大代谢率(图7C)和增殖能力(补充图10，E和F)SRC-2缺失细胞暴露在高谷氨酰胺/低葡萄糖浓度下与在高葡萄糖/低谷氨酰胺浓度下培养的对照细胞相似，表明SRC-2的缺失模拟了谷氨酰胺缺失的代谢状态。正如预期的那样，前列腺癌细胞中SRC-2的基因抑制导致细胞内ATP池显著减少，这表明细胞处于代谢缺陷状态(图7D)。集落形成分析反映了这些影响，因为SRC-2缺失的C4-2和PC-3细胞存活率低(图7，E和F、和补充图10、G和H)。总之，这些发现证实了SRC-2协调肿瘤细胞的代谢功能，并促进前列腺癌细胞的生存，即使在营养紧张的条件下也是如此。

试剂和质粒

激酶抑制剂从以下来源获得：雷帕霉素（钙生物化学）；都灵1号（托克里斯）；BEZ235（Selleck Chemicals）；WORT（Sigma-Aldrich）；α-酮戊二酸辛酯（Cayman Chemical）；和BPTES抑制剂（美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学Takashi Tsukamoto赠送）。使用了以下抗体：SRC-2（BD Biosciences and Bethyl Laboratories）；SCD（Abcam）；FASN、mTORC1采样器套件和HA-Tag（细胞信号技术）；和磷酸-氨基酸/苏氨酸（BD Biosciences）。使用以下质粒：pCR3.1-SRC-2和pcDNA3.1-FLAG-SREBP-1a（Addgene）；pGL3-ZIP1和FASN萤光素酶（Addgene）；和SCD萤光素酶（SwitchGear Geno­mics）。pGL3-hZIP1（–246/+82）结构是Peter Makhov（美国宾夕法尼亚州费城Fox Chase癌症中心）赠送的礼物(50).

动物

所有动物实验均按照贝勒医学院动物护理研究委员会的规定进行。SRC-2–KO的生成(Ncoa2号机组^–/–)之前已经描述过老鼠(51)和年龄匹配的雄性同窝小鼠。在肿瘤研究中，使用6至7周龄雄性裸鼠（Harlan Laboratories）进行实验性肺转移分析，使用6到7周龄的雄性Fox Chase SCID小鼠（Charles River Laboratory）进行前列腺原位异种移植实验。

慢病毒介导的SRC-2敲除细胞生成

慢病毒介导的shRNA表达可产生SRC-2表达降低的稳定细胞。表达靶向SRC-2（2个克隆：186064和199063）或非靶向对照（对照：shNT）的shRNA序列的pGIPZ载体是从OpenBiosystems获得的，病毒是在贝勒医学院（CBASS-BCM）核心设施的细胞检测筛查服务处生成的。在开始任何功能或示踪实验之前，在嘌呤霉素（1μg/ml）存在下选择稳定细胞的多克隆混合群体进行3代以上的传代。

荧光素酶检测

使用荧光素酶报告试验（Promega）和Berthold 96-well平板阅读器进行荧光素酶分析。荧光素酶值归一化为总蛋白水平。

炸薯条

使用EZ ChIP试剂盒（EMD Millipore）进行ChIP分析，并进行了一些修改。简单地说，在15厘米的培养皿中培养稳定的C4-2细胞，直到80%的细胞融合，并用谷氨酰胺刺激或不刺激都灵（250 nM），然后进行染色质剪切和qPCR。

代谢组学分析

液质联用

代谢物的色谱分离使用QQQ质谱仪（安捷伦科技公司）在线反相分离或正相分离进行。

基于MS的原位小鼠肿瘤代谢组检查样品制备

将原位小鼠组织储存在–140°C的液氮中，直至分析。对于代谢组提取，将10mg组织在含有[15N]的1:4冰冷水/甲醇混合物中匀浆₂色氨酸。然后依次以3:1的比例添加冰镇氯仿和水，并分离有机溶剂（甲醇和氯仿）和水溶剂（水/甲醇/氯仿/水，比例为1:4:3:1）。使用3kDa分子过滤器（Amicon Ultracel 3-kDa膜；EMD Millipore）对水提取物进行脱蛋白，并在真空下干燥含有代谢物的滤液（EZ-2 Plus；Genevac）。在MS之前，将干燥提取物重新悬浮在由适当流动相组成的相同体积的注射溶剂中，并进行LC-MS。

靶向质谱同位素标记和分析

营养素标签¹³C从剑桥同位素实验室购买。C4-2细胞在常规培养基中的6孔板中生长，直至80%融合，然后隔夜饥饿，然后添加2.0 mM L[U-¹³C类₅]谷氨酰胺，[1-¹³C] 谷氨酰胺，或[5-¹³C] 谷氨酰胺补充有含有10%透析FBS和1%PS的RPMI[-]谷氨酰胺，或添加11 mM D[U-¹³C类₆]葡萄糖补充RPMI[-]葡萄糖、10%透析FBS和1%PS。收集培养液，用PBS冲洗细胞，用液氮快速冷冻每个处理中等量的细胞。将细胞刮入0.5 ml的1:1水/甲醇混合物中，超声1分钟（两个30秒脉冲），然后与450μl冰镇氯仿混合。然后将所得匀浆与150μl冰水混合，并再次旋转2分钟。将匀浆在-20°C下培养20分钟，并在4°C下离心10分钟，以分离水层和有机层。在自动环境速度真空系统（Thermo Fisher Scientific）中，将水层和有机层结合并在37°C下干燥45分钟。在500μl冰镇甲醇/水（1:1）溶液中重新配制提取物，并在4°C下通过3-kDa分子过滤器（Amicon Ultracel 3-kDa-膜）过滤90分钟，以去除蛋白质。滤液在37°C下在快速真空中干燥45分钟，并在-80°C下保存，直至MS分析。在MS分析之前，将干燥提取物重新悬浮在含有0.1%甲酸的50μl甲醇/水（1:1）溶液中，然后使用多重反应监测（MRM）进行分析。使用6490 QQQ三重四极杆质谱仪（安捷伦科技公司）和1290系列高效液相色谱系统，通过选择性反应监测（SRM），注入10微升并进行分析。代谢物在正离子和负离子模式下都是靶向的：电喷雾源电离（ESI）电压在正离子模式下为+4000 V，在负离子模式中为-3500 V。每个检测到的代谢物大约有9到12个数据点。为了靶向TCA通量，使用Luna Amino色谱柱（4μm，100A 2.1×150 mm）通过正相色谱将样品输送至质谱仪。为了确定脂肪酸流量，使用苯基己基柱（3μm，100A 2.1×150mm）通过反相色谱将样品输送至质谱仪。对于¹³C标记实验，SRM按预期执行¹³靶向LC-MS/MS中不同形式的C掺入。使用以下公式计算质量同位素分布（MID）：[分数掺入=(¹³C类/¹³C类+¹²C） ×100]，并根据自然丰度进行校正。还原羧化通量的变化是通过比较[1-¹³C] 谷氨酰胺–或[5]-¹³C] 谷氨酰胺标记细胞。脂肪生成乙酰辅酶A的部分贡献是通过对来自[5]的棕榈酸MIDs进行回归建模来确定的-¹³C] 谷氨酰胺标记细胞。

酶活性

根据制造商的协议，使用试剂盒测量IDH（MAK062；Sigma-Aldrich）、CS（CS0720；Sigma-Aldrich。简单地说，将细胞接种在15厘米的培养皿中，直到80%融合。使用添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（EMD Millipore）的试剂盒中提供的裂解缓冲液在冰凉条件下裂解细胞。酶活性测定使用等量的蛋白质。

代谢组数据分析

标准化数据来自Sreekumar A等人(46)。我们执行了基于排列的P（P）值（10000个样本标签排列）来定义不同类别中代谢物的重要性。使用R语言的方框图进一步绘制数据。

GSEA公司

GSEA是使用GSEA软件包执行的(53)。NES和调整q个根据1000个排列基因的随机排列，使用GSEA方法计算值。数据保存在NCBI的基因表达综合数据库（GEO{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE63539”，“term_id”：“63539“}}GSE63539标准).

统计

除非另有说明，否则所有结果均表示平均值±SEM，并使用双尾学生模型进行不同组之间的统计比较t吨使用Tukey的多重比较修正进行测试或双向方差分析。对于所有统计分析P（P）≤0.05被认为具有统计学意义，实验重复至少3次。数据分析使用GraphPad Prism软件版本4.0/6.0（GraphPad-software）。

我们感谢BCM的以下同事和核心机构对本研究的帮助：Nancy Weigel（有益的讨论）；朱伯凯、何斌（ChIP-seq分析）；Bian Ka和Vasanta Putluri（技术援助）；Pradip Saha（海马实验）；组织培养核心设施（CBASS）以及病理学和组织核心设施。BCM的小鼠代谢核心（MMC）和糖尿病研究中心由国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（NIDDK）资助，NIH拨款P30 DK079638。这项工作得到前列腺癌基金会挑战奖的支持（给B.W.O'Malley）；NIDDK，NIH（5P01DK059820，发给B.W.O'Malley）；德克萨斯州癌症预防研究所（CPRIT）（RP100348，致B.W.O'Malley）；太空科学促进中心综合奥密克戎奖（授予B.W.O'Malley）；CPRIT多投资者研究奖（CPRIT-MIRA）（RP101251-P02，授予B.W.O'Malley，RPN20092和1R01CA133458，授予A.Sreekumar）；以及美国国立卫生研究院国家癌症研究所（NCI）（1U01CA167234至A.Sreekumar）。