感谢您将题为“小分子ISRIB逆转eIF2α-磷酸化对翻译和应激颗粒形成的依赖性影响”的工作发送至电子生活你的文章已经由Randy Schekman（高级编辑）和三位评论员进行了评估，其中一位是我们的评审编辑委员会成员。

在我们做出这一决定之前，评审编辑和其他评审人员讨论了他们的意见，评审编辑收集了以下意见，以帮助您准备修改后的提交文件。

所有三位评审员都认识到您试图进一步描述ISRIB应用于应激细胞的后果的重要性，以及这项研究作为重要进展的潜力。你选择的方法通过核糖体分析评估mRNA翻译和通过成像评估应激颗粒形成的影响，同样被认为适合这项任务。然而，随后的个别审查和协商过程发现了与数据的可解释性和得出的结论的有效性有关的重要问题。这些问题相当普遍，审稿编辑不可能单独决定修订版是否适合出版。因此，如果你决定按照以下规定修改你的论文，请记住，它需要所有三位审稿人再次审核。

1） 关于Ribo-Seq实验的详细信息缺失：每个样本有多少个映射读取和多少个重复？对数据集可能不足的担忧，由于人们认为这些数据元素的读取密度是详细呈现的(图1–补充图1例如）相当低。

2） RNA转录物丰度的显著性数字尚未报道。

3） RPF分析的单基分辨率的全部功率并没有用于消除应力和ISRIB对ATF4和ATF5中uORF翻译的影响。应该可以将读取分配给uORF或主ORF，即使它们重叠，因为读取帧不同。

4） 该论文的中心结论是，ISRIB消除了应激对翻译调控的影响，ISRIB等同于消除ISR的突变，但这些数据并不支持。在应激和ISRIB处理的样品中，核糖体参与的mRNA数量不同(图2C)与压力较大的PERK相比^-/-细胞（此处用于ISR抑制系统的基准，图2A). 这些实验可能会被一个方法学问题进一步混淆，因为图2C用衣霉素治疗1小时，而图2A持续30分钟。这些问题需要进行一些详细的处理。

5） ISRIB对图像中应力颗粒形成的影响似乎令人信服。但这些需要用适当的统计工具进行量化和分析。

评审员的个人意见如下。

1号审核人

这份手稿在2013年出版的基础上提供了新的实验电子生活关于ISR抑制剂化合物ISRIB作用机制的文章。

作者对他们最初的研究中使用的技术进行了补充，为他们的模型提供了额外的支持，即ISRIB在诱导eIF2磷酸化后起到抵消下游信号事件的作用。这里采用了两种实验策略：1）细胞核糖体谱分析（Ribo-Seq），以检查对ISR及其抑制的整体翻译控制反应；2）通过免疫荧光和活细胞GFP进行细胞成像，以检查应激颗粒和P体的外观，P体是细胞应激的标志物。这两项分析似乎证实并扩展了原始研究中报告的结果，但尚未确定抑制剂ISRIB使ISR无效的机制。

我主要担心的是报告数据的稳健性。在目前的版本中，这不可能进行全面评估。

1） 对于RNA和Ribo-Seq实验，没有关于测序深度的信息。每个样本进行了多少次映射读取和多少次复制？

2） 核糖体占有率的显著变化在补充表中有报告，但RNA转录物丰度的变化没有报告。这些数据也应该添加到手稿中。

3） 对于报告的Ribo-Seq折叠更改，如何处理读取映射到重叠ORF？如图1–补充图1，显示覆盖重叠的uORF（绿色）和主ORF（蓝色）的读数。

4） 读取的密度数据是否在图1–补充图1报告单个代表性样本、重复（如果完成）的总读取次数或多个重复的平均读取次数？除ATF4外，显示的任何基因的读取密度都不是很高。

5） 作者能否确认并评论CHOP mRNA注释uORF和主ORF之间存在RPF？

6） 一个可能出乎意料的发现是，应激后uORF RPF明显增加。作者选择不详细阐述这一点。所描述的通常的翻译控制模型通常显示出要么全有要么全无的极端反应，但uORF上仍有核糖体在应激条件下可能更频繁地被跳过，这一点也不奇怪。也许一个重要的控制措施是在ATF4和5中跳过uORF2的核糖体的比例。这可以量化，因为重叠ORF区域的Ribo-Seq读取数据应该在单独的读取帧中。应该可以将读取分配给uORF或主ORF。作为压力介导的翻译控制措施，作者可以量化翻译控制ORF键中RPF的数量和比例。对于ATF4和ATF5，ORF/uORF2读数将给出相对平移控制的替代读数。

7） 显示eIF2磷酸化相对于总eIF2的印迹应在Ribo-Seq研究中使用的每种类型的细胞中（正负）。这可以添加到使用不同时间点的ATF4印迹中。

8） 用于免疫荧光实验和GFP实验图3图4和图4–图补充1，每个实验都需要量化比每个代表性图像中所示数量更多的细胞。例如，在三个独立实验中的每一个100个细胞中，细胞（正负）误差中包含应力颗粒或P体的比例是多少（视情况而定）。这样的分析可以对观察结果的重要性进行统计处理。

9） 在这里使用的时间内，ISR和ISRIB对普遍定期审议其他方面的影响是什么。采样时间是否太早，无法观察XBP1剪接和核糖体结合的变化？如果是，则应说明这一点，如果不是，则显示XBP1读数会有所帮助。

2号审核人

在这份手稿中，作者研究了ISRIB的作用，ISRIB是一种靶向综合应激反应（ISR）的小分子，在两个实验系统中发挥作用：核糖体分析和应激颗粒形成。通过核糖体分析对ISR的研究基本上证实了早期的研究。ISRIB和应激颗粒的作用令人惊讶且新颖，但其潜在机制尚不清楚。虽然这项研究可能很有趣，但仍有一些重要问题需要解决。

主要问题：

在整个手稿中，数据和结论之间存在脱节。我在这里只强调主要的几点：

1） 本文的中心结论之一是，ISRIB消除了eIF2α磷酸化的影响。作者写道：“ISRIB处理的细胞在内质网应激下的翻译输出与具有遗传消融ISR的细胞非常相似”。这与数据相矛盾。事实上，这两个数据集之间存在重大差异(图2A和2C). 我建议提供一份完整的ISRIB治疗后发生变化的基因列表，并研究这些变化，因为这可能会揭示ISRIB的功能和/或靶点。

支持ISRIB引起的变化(图2)实际上是可以控制的，ISRIB带来了更多变化(图2)比Tm(图1A). ISRIB函数的秘密可能隐藏在此数据集中。这需要记录和利用。

一个相关问题：作者得出结论，“ISRIB对翻译、转录或mRNA稳定性没有一般的非靶点效应。”

这再次与数据相矛盾。此外，“偏离目标”在这里是不合适的，因为我们不知道ISRIB的目标是什么。

2)图3B：PERK墨迹上的垂直线是什么？在顶部印迹的第一和第二泳道之间以及在底部印迹的第九和第十泳道之间。

3)图3A：最好能看到分辨率更好的图像，以了解eIF3α的定位，这看起来非常有趣。我仍然在一些细胞中看到Ars+ISRIB上的一些应力颗粒，但在大多数细胞中，信号太强，无法分析。最好能看到分辨率更好的图像以及对效果的一些定量评估。

4） 压力颗粒的消失是手稿令人印象深刻的发现，但这一切是怎么发生的呢？由于所用条件缺乏一致性，以及没有提供足够的控制，很难跟踪可能发生的情况。从本文和前一篇文章来看，似乎ISRIB作用于ATF4翻译的上游，并且依赖于eIF2α-P（但不影响后者）？这需要进一步探讨，以了解正在发生的情况。

图4C：最好是用凝胶展示效果，因为作者已经有了图片。欣赏翻译中的质的变化是很有趣的。这与核糖体分析所见相符吗？

5） 讨论范围很广，与当前数据集无关。讨论的第一句话是不正确的，因为还有其他ISR的反对者。我建议修改讨论的两种选择：要么将讨论重点放在当前数据集上，要么提供与讨论一致的额外数据（mTOR信号和ISR、记忆和应激颗粒、记忆和核糖体图谱数据）。

6)图1B：我不理解这个面板。这需要澄清。

3号审核人

这项研究提供了一个重要的扩展，验证了化合物ISRIB是典型eIF2α磷酸化依赖性综合应激反应的高度特异性抑制剂。鉴于原始报告发表于电子生活，本文最适合作为一个相关的研究进展。

最重要的发现是，核糖体足蛋白分析和mRNA测序的无偏见工具揭示了ISRIB对mRNA翻译的影响，仅限于消除一小组（总共五个）翻译上调的mRNA的翻译诱导。在这方面，ISRIB通过干扰上游激酶（PERK-KO）的作用或通过阻止顺式（eIF2α^第51A页).

ISRIB引入的ISR中的一个全面缺陷的进一步支持是，应激颗粒（这些是在经历高水平磷酸化eIF2α的细胞中聚集的mRNA结合蛋白和翻译因子的神秘集合）被ISRIB快速分解。

顺便说一句，本文对ISR的研究做出了重要贡献：通过确认其已知的正调控目标（ATF4、ATF5、CHOP、GADD34）由有偏搜索拼凑而成，构成了一个几乎完整的列表；唯一的新加入者是SLC35A。并提请注意，ISR对它们的翻译诱导并不意味着短抑制uORF上的足迹丢失（正如调节翻译再激活模型所预测的那样）。

对这些补充评论的一个重要警告是，该评论员缺乏判断RNA序列和核糖体足迹技术有效性的专业知识，并在这方面遵从其他评论员的专业知识。

ISRIB对基线翻译缺乏任何可测量的影响是令人惊讶的，因为有证据表明ISR具有基础活性：例如PERK_KO、eIF2a_S51A和ATF4_KO细胞都对氨基酸补充有很强的基线需求（可能表明ISR有助于基线ATF4介导的基因表达）。作者不妨就此发表评论。

所有三位评审员都认识到您试图进一步描述ISRIB应用于应激细胞的后果的重要性，以及这项研究作为重要进展的潜力。你选择的方法通过核糖体分析评估mRNA翻译和通过成像评估应激颗粒形成的影响，同样被认为适合这项任务。然而，随后的个别审查和协商过程发现了有关数据可解释性和得出结论有效性的重要问题。这些问题相当普遍，审稿编辑不可能单独决定修订版是否适合出版。因此，如果你决定按照以下规定修改你的论文，请记住，它需要所有三位审稿人再次审核.

通过现在传递一个与家长直接相关的更集中的信息电子生活论文中，我们认为这些变化大大提高了本文的清晰度和质量，并使其更适合作为研究进展。

我们对原稿进行了以下主要修改：

1） 为了使该论文与之前的出版物更好地一致，我们排除了小鼠胚胎成纤维细胞产生的Ribo-Seq和mRNA-Seq数据。由于MEF和HEK293T细胞之间在动力学和UPR诱导程度上的固有差异，我们现在只关注后者生成的核糖体剖面数据。如我们之前的报告所述电子生活手稿（10.7554/eLife.00498），在HEK293T细胞中，我们观察到与ISRIB联合治疗后ATF4翻译诱导和大量翻译下调的完全阻断，使其成为我们研究ISRIB全基因组效应的细胞系选择，我们包括该细胞类型中报告的所有条件下Ribo-Seq和配对mRNA序列数据的生物复制。所有基因的重复数和mRNA丰度之间的相关系数在新的补充图中提供。

2） 我们仅将uORF核糖体占用纳入两个最高表达的ISR翻译靶点，我们在mRNA和Ribo-Seq数据的读取中获得了足够的覆盖率。我们删除了内质网应激图上uORF核糖体的占有，因为与翻译应激诱导的基因中uORF的翻译和重新扫描机制有关的新见解将需要大量的进一步实验，并将扩展到这项工作的范围之外。本研究进展的主要目标是进一步表征小分子ISRIB的生物效应。

3） 我们已经量化了所有应力颗粒数据。

根据要求，我们将标题改写为“小分子ISRIB逆转eIF2α磷酸化对翻译和应激颗粒组装的影响”。

1） 关于Ribo-Seq实验的详细信息缺失：每个样本有多少个映射读取和多少个重复？对数据集可能不足的担忧，由于人们认为这些数据元素的读取密度是详细呈现的(图1–补充图1例如）相当低.

对每种情况重复进行HEK293T细胞的Ribo-Seq和mRNA-Seq数据（生物复制）。图1–图补遗7包含每个复制样本的读取数、映射的读取数以及映射到ORF的读取数。我们将为所有数据集准备一份GEO提交文件。

我们现在只在沿着基因的核糖体足迹和mRNA读取密度图中包括ATF4和SLC35A4这两个最高表达的ISR靶点（现在图1–补充图3)，我们有足够的保险范围。

2） 未报告RNA转录物丰度的显著性数字.

我们包括了图1–图补充9中测试的所有条件下所有转录物的平均归一化计数。

3） RPF分析的单基分辨率的全部功率并没有用于消除应力和ISRIB对ATF4和ATF5中uORF翻译的影响。应该可以将读取分配给uORF或主ORF，即使它们重叠，因为读取帧不同.

由于本手稿中的所有Ribo-Seq数据都是使用环己酰亚胺冷冻翻译核糖体生成的，这可能导致5'UTR核糖体占有率的人为增加，因此我们没有定量分析uORF占有率的变化。在压力和ISRIB处理时小心地去卷积uORF占用将需要进一步的实验（包括使用翻译起始抑制剂处理来生成文库）。该分析超出了当前研究进展的范围。

4） 该论文的中心结论是，ISRIB消除了应激对翻译调控的影响，ISRIB等同于消除ISR的突变，但这些数据并不支持。在应激和ISRIB处理的样品中，核糖体参与的mRNA数量不同(图2C)与压力较大的PERK相比^-/- 小区（这里用于ISR抑制系统的基准， 图2A). 这些实验可能会被一个方法学问题进一步混淆，因为 图2C 用衣霉素治疗1小时，而 图2A 持续30分钟。这些问题需要详细处理.

我们排除了MEF数据，并且由于细胞系之间观察到的差异，我们不再对PERK进行基准测试^-/-或eIF2α作为ISR抑制系统。重要的是，我们发现ISRIB全面阻断了HEK293T细胞中绝大多数mRNA的翻译上调，包括公认的ISR翻译靶点ATF4、ATF5、CHOP和GADD34。之前提交的手稿和当前的手稿都包含了针对每种情况的翻译上调mRNA列表。

5） ISRIB对图像中应力颗粒形成的影响似乎令人信服。但这些需要用适当的统计工具进行量化和分析.

我们量化了所有应力颗粒数据，并将相应的量化面板添加到图2和图3在每个图形图例中显示相应的统计信息。

评审人员的个人意见如下.

1号审核人

[…]我主要担心的是所报告数据的稳健性。在目前的版本中，这不可能完全评估.

1） 对于RNA和Ribo-Seq实验，没有关于测序深度的信息。每个样本进行了多少次映射读取和多少次复制?

我们包括了所有条件下所有Ribo-Seq和mRNA-Seq数据的生物复制。图1–图补遗7包含读取映射信息，图1-图补遗8显示重复之间的相关系数。

2） 核糖体占有率的显著变化在补充表中有报告，但RNA转录物丰度的变化没有报告。这些数据也应该添加到手稿中.

RNA转录物丰度如图1–补充图9所示。

3） 对于报告的Ribo-Seq折叠更改，如何处理读取映射到重叠ORF？如 图1–图补充1，显示覆盖重叠uORF（绿色）和主ORF（蓝色）的读数.

我们删除了原稿中uORF的Ribo-Seq-fold更改。

4） 读取的密度数据是否在 图1–补充图1 报告单个代表性样本、重复（如果完成）的总读取次数或多个重复的平均读取次数？除ATF4外，显示的任何基因的读取密度都不是很高.

读取密度表示两个复制的总读取数。我们只包括ATF4和SLC35A4，它们具有足够高的整体读取密度，可以得出有力的结论。

5） 作者能否确认并评论CHOP mRNA注释uORF和主ORF之间是否存在RPF?

数据已被删除。

6） 一个可能出乎意料的发现是，应激后uORF RPF明显增加。作者选择不详细阐述这一点。通常描述的翻译控制模型通常显示出一个全有或全无的极端反应，但毫不奇怪，uORF上仍有核糖体，在压力条件下可能会更频繁地被跳过。也许一个重要的控制措施是在ATF4和5中跳过uORF2的核糖体的比例。这可以量化，因为重叠ORF区域的Ribo-Seq读取数据应该在单独的读取帧中。应该可以将读取分配给uORF或主ORF。作为压力介导的翻译控制措施，作者可以量化翻译控制ORF键中RPF的数量和比例。对于ATF4和ATF5，ORF/uORF2读数将给出相对平移控制的替代读数.

手稿中不再提供数据。面对下游ORF转换，对剩余uORF占用率的分析需要进行广泛的额外研究。

7） 对于Ribo-Seq研究中使用的时间点，显示eIF2磷酸化相对于总eIF2的印迹应在每种类型的细胞中使用（正负）处理。这可以添加到使用不同时间点的ATF4印迹中.

ATF4印迹已被去除，因为它与MEFs数据有关。我们已经报道了HEK293T细胞中eIF2α磷酸化和ATF4生成的时间进程图3–补充图1原始版本的电子生活论文（10.7554/eLife.00498）。通过Western blot分析，仅在Tm处理1小时后，我们没有检测到磷酸化eIF2α磷酸化或ATF4生成，这是用于核糖和mRNA-seq分析的条件。Ribo-Seq分析是一种比Western blotting更敏感的方法，可以检测ER应力引起的早期翻译变化。

8） 用于免疫荧光实验和GFP实验 图3 和图4–图补充1，每个实验都需要量化比每个代表性图像中所示数量更多的细胞。例如，在三个独立实验中的每一个100个细胞中，细胞（正负）误差中包含应力颗粒或P体的比例是多少（视情况而定）。这样的分析可以对观察结果的重要性进行统计处理.

将定量添加到应力颗粒数据中。

9） 在这里使用的时间内，ISR和ISRIB对普遍定期审议其他方面的影响是什么。取样时间是否太早，无法观察到XBP1剪接和核糖体结合的变化？如果是，则应说明这一点，如果不是，则显示XBP1读数将有所帮助.

在分析的时间点上，检测XBP1 mRNA剪接的变化还为时过早。在图3–补充图1原始版本的电子生活论文（10.7554/eLife.00498）中，我们观察了Tm对HEK293T细胞中XBP1s的诱导作用。XBP1的产生滞后于ATF4翻译上调，在Tm处理1小时时未检测到。我们在之前的手稿中还报告，ISRIB治疗或阻断UPR的PERK分支不会改变IRE1和XBP1剪接的激活，但通过IRE1-GFP病灶形成和XBPl剪接来测量，它延长了该分支的激活（图5C和图5-图补编2）。

2号审核人

[……]虽然这项研究可能很有趣，但仍有一些重要问题需要解决.

主要问题:

在整个手稿中，数据和结论之间存在脱节。我只强调这里的主要内容:

1） 本文的中心结论之一是，ISRIB消除了eIF2的影响α磷酸化。作者写道：“ISRIB处理的细胞在内质网应激下的翻译输出与具有遗传消融ISR的细胞非常相似”。这与数据相矛盾。事实上，这两个数据集之间存在重大差异(图2A和2C). 我建议提供ISRIB治疗后发生变化的基因的完整列表，并研究这些变化，因为这可能会阐明ISRIB的功能和/或靶点.

我们删除了MEF数据，因此不再比较ISR消融细胞和ISRIB处理细胞。在提交的两份原件中电子生活研究进展和修订稿中，我们提供了一份在所有报告条件下显著且实质性翻译上调的基因列表（Tm、Tm+ISRIB和ISRIB单独）。我们仔细分析了在Tm+ISRIB存在下翻译上调的基因。不幸的是，它们都是具有未知功能的假设蛋白质，因此无法阐明ISRIB的功能。这些未表征的基因中的一些在单独存在ISRIB的情况下也被下调。

支持ISRIB引起的变化(图2)实际上是可以控制的，ISRIB带来了更多变化(图2)比Tm(图1A). ISRIB函数的秘密可能隐藏在此数据集中。这需要记录和利用.

如上所述，ISRIB变更已记录在案。与Tm治疗相比，ISRIB引起的变化较小。

一个相关问题：作者得出结论，“ISRIB对翻译、转录或mRNA稳定性没有一般的非靶点效应。”这再次与数据相矛盾。此外，“偏离目标”在这里是不合适的，因为我们不知道ISRIB的目标是什么.

我们已经从文本中删除了偏离目标的内容。核糖体和mRNA全基因组分析数据表明，ISRIB全面阻断UPR激活和eIF2α磷酸化驱动的翻译效应，不会导致mRNA水平或翻译的整体和虚假变化。

2) 图3B：PERK墨迹上的垂直线是什么？顶部挡块的第一和第二车道之间以及底部挡块的第九和第十车道之间.

所有车道在污点中都是相邻的。胶片被重新扫描，线条不再存在。

3) 图3A：最好能看到分辨率更好的图像，以了解eIF3α的定位，这看起来非常有趣。我仍然在一些细胞中看到Ars+ISRIB上的一些应力颗粒，但在大多数细胞中，信号太强，无法分析。最好能看到分辨率更好的图像以及对效果的一些定量评估.

对所有应力颗粒数据进行了定量评估。免疫荧光数据eIF3α本文中使用的所有压力源都已经发表过了。

4） 压力颗粒的消失是手稿令人印象深刻的发现，但这一切是怎么发生的呢？由于所用条件缺乏一致性，以及没有提供足够的控制，很难跟踪可能发生的情况。从这篇论文和上一篇论文来看，ISRIB似乎在ATF4翻译的上游起作用，并依赖于eIF2α-P（但不影响后者）？这需要进一步探讨，以了解正在发生的情况.

使用不同应激源的目的是区分磷酸化eIF2α依赖性（thapsigargin和亚砷酸盐）和独立性（泛胺A和马布里斯塔诺）应激颗粒的形成。正如ISRIB使细胞抵抗eIF2α磷酸化作用的能力所预期的那样，小分子只能阻止磷酸化eIF2β依赖性应激颗粒的形成。ATF4是eIF2α磷酸化的下游，因此也被ISRIB阻断。该药物的作用机制有待确定其分子靶点。

图4C：最好是用凝胶展示效果，因为作者已经有了图片。欣赏翻译中的质的变化是很有趣的。这与核糖体分析结果相符吗?

我们已将凝胶纳入图3–补充图2.活细胞成像和³⁵在表达G3BP-GFP的U2OS细胞中，使用高效的雌激素受体（thapsigargin）进行S-蛋氨酸掺入和回收实验。它与核糖体足迹分析中使用的细胞类型或内质网应激源（膜霉素）不同。

5） 讨论范围很广，与当前数据集无关。讨论的第一句话是不正确的，因为还有其他ISR的反对者。我建议修改讨论的两个选项：要么集中讨论当前数据集，要么提供与讨论相关的附加数据（mTOR信号和ISR、记忆和应激颗粒、记忆和核糖体分析数据）.

我们对讨论进行了实质性改写。然而，据我们所知，ISRIB确实是第一个也是迄今为止唯一已知的ISR抑制剂。尽管存在特定eIF2α激酶的抑制剂（PERK和PKR抑制剂），但ISRIB是唯一一种可以通过使细胞对eIF2β磷酸化产生抗性来阻断所有eIF2γ激酶下游信号传导的分子。存在一种ISR激动剂salubrinal，可延长eIF2α磷酸化。也存在一种HRI激活剂，它也可以作为表达HRI的细胞中ISR的激动剂。

6) 图1B：我不理解这个面板。需要澄清.

此图已删除。

3号审核人

[……]ISRIB对基线翻译缺乏任何可测量的影响令人惊讶，因为有证据表明ISR具有基础活性：例如PERK_KO、eIF2a_S51A和ATF4_KO细胞都对氨基酸补充有强烈的基线要求（可能表明ISR有助于基线ATF4介导的基因表达）。作者可能希望对此发表评论.

HEK293T细胞仅用ISRIB处理一小时，因此ISR激活的基础水平可能不如长期消融PERK（PERK^-/-)，ATF4（ATF4^-/-)或非磷酸化eIF2α（eIF2^S51A/S51A型).