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科学数据。2014; 1: 140031.
2014年9月16日在线发布。 数字对象标识：10.1038/数据2014.31
预防性维修识别码：项目经理4322573
PMID：25977788

通过SWATH-MS量化10000人类蛋白质的分析库

乔治·罗森伯格，1,2 青竹角，1,三 郭天南，1 汉内斯·洛斯特，1,2 佩特里·库沃宁，1 本·C·柯林斯，1 莫里茨·海塞尔，1,4 刘燕生（Yansheng Liu），1 艾蒂安·卡隆，1 安东·维查尔科夫斯基，1 马可·法尼，1 奥尔加·T·舒伯特，1,2 波亚·法里迪，1,5 亚历山大·埃布哈特，1 马里埃特·马通多，1 亨利·林，6 塞缪尔·巴德，7 大卫·S·坎贝尔，7 埃里克·W·多伊奇，7 罗伯特·莫里茨，7 斯蒂芬·泰特，8和吕迪·阿贝尔索德a、，1,9
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

数据引用
补充资料

摘要

质谱是深入可靠地研究人类蛋白质组的首选方法。靶向质谱法可靠地检测和量化复杂生物基质中预先确定的蛋白质组，并用于依赖多个样品中蛋白质定量准确和可重复测量的研究。它需要一次性，先验的为每个靶蛋白生成特定的测量分析。SWATH-MS是一种质谱法，它结合了数据相关性采集（DIA）和靶向数据分析，与选择性反应监测（SRM）相比，极大地扩展了样品中靶向蛋白质的吞吐量。在这里，我们提供了一份涵盖10000多个人类蛋白质的高度特异性分析概要，并能够在从研究或临床样本中获得的SWATH-MS数据集中对其进行靶向分析。该资源支持对UniProtKB/Swiss-Prot注释的50.9%的所有人类蛋白质进行可靠检测和量化，因此有望在基础和临床研究中得到广泛应用。数据可通过ProteomeXchange（PXD000953-954）和SWATHAtlas（SAL00016-35）获得。

背景和摘要

科学很大程度上依赖于可重复性和定量准确的测量。在分子生命科学中，技术进步将构成活细胞的分子的大规模测量推向了前沿。例如，下一代测序（NGS）技术已经使完整基因组和转录组的常规定量分析在许多实验室成为现实。相比之下，蛋白质是细胞功能效应分子的主要类别，其分析仍然具有挑战性，而且一般无法实现。

在大多数实验室中，复杂样品中的蛋白质通过免疫分析进行检测和定量，其中特定试剂（通常是抗体）用于生成信号，指示样品中特定蛋白质的存在和数量。大规模项目，以人类蛋白质图谱项目为例1商业努力试图为每种人类蛋白质生成特定的亲和试剂，并使其广泛可用。毫无疑问，这些试剂的可用性有可能对生命科学研究产生重大影响。然而，目前只有蛋白质组的一个子集可以通过亲和试剂进行常规测量，因此，许多关于蛋白质的文献知识都集中在蛋白质组的相对较小的子集上，即亲和试剂容易获得的部分2此外，这些试剂中至少有一些质量未知且可疑三，限制了所获得结果的效用。因此，生命科学研究将大大受益于人类蛋白质组经验证的高质量分析的普遍可用性。

质谱（MS）已成为深入可靠地研究人类蛋白质组的首选方法。特别是，以数据依赖采集模式（DDA）运行的液相色谱-耦合串联质谱（LC-MS/MS）在复杂样品中蛋白质的鉴定方面取得了显著进展。已实现人类细胞系的全蛋白鉴定和定量4–6，4–6，4–6目前正在努力确定20300个蛋白编码基因中至少一个蛋白产物的特征。HUPO以染色体为中心的人类蛋白质组项目就是这样一个例子7到目前为止，它可以检测到约14000个蛋白质的至少一个肽8最近，Kim的两项独立研究等。9和威廉等。10报告了分别对2000和16800多个LC-MS/MS测量值进行的累积分析，得出了分别对应于17294和18097个人类蛋白编码基因的已识别肽图谱。然而，这些研究中实现的高蛋白质组覆盖率取决于MS分析之前的蛋白质或肽分馏技术，如强阴离子交换（SAX）或非凝胶电泳（OGE），在多个仪器进样中分配样品复杂性，并整合大量LC-MS/MS测量结果。生成和分析深层蛋白质组数据集的高技术复杂性和成本以及众所周知的技术权衡11迄今为止，已禁止将这项强大的技术分发给大量实验室12并限制了实验室内部和跨实验室生成的数据集的再现性13–15，13–15，13–15从而限制了其影响的广度。

我们和其他人提出，靶向质谱具有使基于质谱的蛋白质组学民主化的潜力，即使大多数或所有蛋白质在大量实验室中可靠地检测和量化16.在HUPO人类蛋白质组项目的保护伞下17，我们启动了一个项目，使靶向技术和相关的测量分析普遍可用。在靶向蛋白质组学中，以典型的定量质谱技术-选择性反应监测（SRM）为例，也称为多重反应监测（MRM），通过必须生成的特定质谱分析准确量化预定的蛋白质组先验的每个靶蛋白一次。为了支持基于SRM的蛋白质定量，已经创建了广泛的分析库，在某些情况下，还创建了蛋白质组范围的分析库和对多个样本中相同分析的经验测量，以判断这些分析的性能18–21，18–21，18–21，18–21并且可以自由访问(http://www.srmatlas.org，http://www.peptideatlas.org/passel网站/). 而SRM和相关方法的最新实现在高性能质谱仪上进行平行反应监测（PRM）22它们仍然是性能最好的定量MS方法，但由于可在一次注射中定量的蛋白质数量相对较少（50–100），以及需要在数据采集之前为每个样品指定目标蛋白质这一事实，它们受到了限制。

最近，我们引入了SWATH-MS，这是一种新的质谱技术，它将数据相关采集（DIA）与高分辨率质谱仪上的目标数据提取相结合23在DIA模式下，仪器在预定的质量荷电范围内对所有前体离子进行断片(米/z)范围和获得复杂的产物离子光谱，包含所有同时碎片化前体的碎片离子。通过快速递归地扫描连续的相邻前体离子窗口（称为线束），可以获得完整的前体离子米/z涵盖了胰蛋白酶化肽的范围，因此，在用户定义的保留时间（RT）内所有前体的片段离子光谱与米/z窗口随时间记录。这导致了在片段离子强度和保留时间维度上都是连续的数据集，并且基本上代表了所分析的蛋白质样品的数字记录。在这些数据中，可以通过应用目标数据提取策略来识别和量化特定肽，该策略产生的信号类似于SRM获得的信号，其中，在色谱时间内记录与目标肽唯一相关的片段离子信号集，并将结论峰群用作样品中目标肽的决定性鉴定和定量的证据。数据分析取决于先验的分析，从用于SWATH-MS采集的同一高分辨率仪器中最佳生成的目标肽片段离子光谱得出。与需要在数据采集之前确定靶向肽的SRM不同，SWATH-MS数据集是独立记录的，然后可以使用靶向分析策略永久地重新定义。使用免费或商用软件（OpenSWATH24，天际线25、PeakView（AB SCIEX，Concord，加拿大）或Spectronaut（Biognosys AG，Schlieren，瑞士））和蛋白质组特异性分析库SWATH-MS可用于在与SRM相当但吞吐量更高的性能指标下进行蛋白质定量23，24。

迄今为止，大多数使用SWATH-MS的研究都依赖于生成样本特异性分析文库，这些文库是从分馏或浓缩样本中获得的，在采集SWATH-质谱之前，在DDA模式下操作的同一仪器上注射23，24，26–29，26–29，26–29，26–29在这里，我们提出了一个通用的大规模人类分析库，以支持通过SWATH-MS进行蛋白质定量。它针对在AB SCIEX TripleTOF 5600+系统上获取的SWATH-质谱数据集的目标数据分析进行了优化。它由1164312个转换组成，识别139449个蛋白型肽和10316个蛋白质。它是由331个来自不同细胞系、组织和亲和力富集蛋白样品的组分的测量结果合并而成的。分析包括前体和片段离子米/z标准化RT和相对离子强度，使该资源易于使用最先进的分析软件进行数据分析。我们进一步证明，使用组合分析库获得的结果和生物学结论与使用样本特异性分析库得到的结果和生物结论具有可比性，并且适用于实验室。我们预计，这一资源将大大有助于在研究和实验室中对人类蛋白质组样品进行简化和可重复的分析。

方法

示例概述

为了获得人类蛋白质组的广泛代表性，我们分析了一系列人类细胞和组织类型的蛋白质样品。分析的具体样本类型总结如下表1（有关完整注释，请参见补充表1)包括人体细胞系、肾脏、肠道、单核细胞、中性粒细胞和人体血液等组织。为了增加低丰度蛋白质分析文库的内容，我们还添加了从亲和纯化蛋白质复合物获得的光谱。图1演示了实验工作流。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为sdata201431-f1.jpg

用于生成分析库的数据采集和数据分析工作流。(一)数据采集：对不同细胞系和组织类型进行采样，然后进行（可选）蛋白质分馏、蛋白水解消化（使用胰蛋白酶或使用PCT的lys-c/胰蛋白酶）、（可选）肽分馏和发现蛋白质组学模式下的LC-MS/MS分析。(b条)数据分析：使用四种不同的搜索引擎进行序列数据库搜索，并使用Trans-Proteomic Pipeline对结果进行统计评估和合并。使用MAYU进行错误发现率（FDR）控制。使用SpectraST将识别的肽用于生成一致的RT归一化光谱库。使用spectrast2tsv.py和OpenSWATH工具ConvertTSVToTraML选择分析。

表1

组合分析库内容的概述。
样品类型 蛋白质分馏 蛋白质水解 肽分馏 MS注射
CL表示细胞系，T表示组织，表示样本来源。完整的示例注释在中提供补充表1。    
HEK293（CL）AP（激酶）胰蛋白酶无12
HEK293（CL）AP（14-3-3）胰蛋白酶无29
HEK293（CL）秒胰蛋白酶无81
HEK293（CL）无胰蛋白酶OGE公司11
HEK293（CL）无胰蛋白酶无1
U2OS（CL）无百分比无13
赫拉（CL）无百分比无9
U2OS和HeLa（CL）无胰蛋白酶OGE公司24
NCI60（CL）无百分比无13
NCI60（CL）无胰蛋白酶OGE公司24
CAL51（中心线）无胰蛋白酶无5
CAL51（中心线）无胰蛋白酶1D通用电气2
THP1（氯）无胰蛋白酶OGE公司27
LNCaP（CL）公司无胰蛋白酶SAX公司6
LNCaP（CL）公司无胰蛋白酶无1
肾脏（T）无胰蛋白酶1D通用电气15
肾脏（T）无百分比无16
大肠（T）无胰蛋白酶OGE公司24
肌肉（T）无百分比无三
肺（T）无百分比无2
血浆（T）无胰蛋白酶SAX公司8
单核细胞（T）无胰蛋白酶无1
中性粒细胞（T）无胰蛋白酶无1
纯化血小板（T）无胰蛋白酶无三
总计 331    

细胞培养、组织采样和蛋白质水平分离

细胞培养

HEK293细胞样品基本上按照之前的描述生成30。

HeLa和U2OS细胞从ATCC中获得，并在添加了100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10%胎牛血清的谷氨酸MAX-1（Invitrogen，Carlsbad，CA）的DMEM中在37°C、5%CO条件下生长2，在加湿培养箱中。

NCI60和LNCaP细胞是从国家癌症研究所（NCI NIH）的发展治疗计划（DTP）中获得的冷冻、非活性细胞颗粒。

CAL51细胞在缺乏精氨酸和赖氨酸（Invitrogen）的RPMI 1640培养基中生长，并补充10%胎牛血清（Invit罗gen，26400-044）（FBS）。培养基中添加100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2 mM L-谷氨酰胺（Gibco）。如前所述生成THP1细胞系样本31。

患者标本

肾组织样本(n个=18）在手术时收集，由Silke Gillessen博士、Markus Joerger博士和Wolfram Jochum博士（瑞士圣加仑坎通斯皮塔尔）提供。

肠道组织样本(n个=18）由Marko Kalliomaki博士（芬兰图尔库大学医院）提供。样本是在诊断性结肠镜检查期间从9名患者中采集的。

肺组织样本(n个=12）由荷兰格罗宁根大学医学中心的Wim Timens博士及其同事提供。

肌肉组织样本(n个=12）由Carsten Jacobi博士（瑞士诺华制药公司）提供。

血浆样本取自32名健康女性献血者，在进一步处理之前混合在一起。根据制造商的协议，使用多重亲和去除系统（MARS Hu-14自旋盒；安捷伦科技）去除血浆中14种最丰富的血浆蛋白。用3000 Da分子量截止过滤器（Pall公司）交换耗尽的样品，并在用胰蛋白酶和LC-MS分析消化之前，在6 M尿素和0.1 M碳酸氢铵中变性。

单核细胞和中性粒细胞样本是从活动性结核病患者中分离出来的，由Stefan Kaufmann博士（德国柏林马克斯普朗克感染生物学研究所）提供。

来自健康捐赠者的纯化血小板由Ohad Medalia教授（瑞士苏黎世大学）提供。纯化和蛋白质消化基本上如前所述32。

所有临床标本均在IRB批准和接受的方案下获得。所有取活检样本的患者均获得书面知情同意。

亲和力纯化

之前公布的14-3-3β网络亲和纯化样本数据集包括在内27此外，为了生成光谱库，根据相同的协议生成并合并了人激酶毒饵下拉列表。

尺寸排除色谱法（SEC）

如前所述，对循环HEK 293 wt细胞进行基本裂解27但裂解缓冲液中没有添加亲和素。通过15分钟的超速离心（100000×克在30 kDa分子量截止膜（Amicon Ultra-15，Millipore，MA，USA）上，将Beckman Coulter Optima TLX超离心机）和裂解缓冲液交换至SEC缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl），在1:2，1:5和1:5的三个稀释和再浓缩步骤中，比例为1:50。根据OD280的判断，将蛋白质浓缩至25-30 mg/ml，然后在蛋白质水平分级之前，在16.9 krcf、4°C（Eppendorf 5418R）下离心5分钟，将其从沉淀物中清除。SEC在安捷伦1100毫升流HPLC系统（安捷伦，加利福尼亚州，美国）上进行，使用Yarra-SEC-4000柱（孔径500Å，尺寸300×7.8mm，Phenomenex，加利福尼亚州，美国），在50mM HEPES pH 7.5，150mM NaCl中，温度控制在4°C，流速为500 ul/min。1注射μg浓缩裂解液，将其分馏到注射后10–25分钟收集的80个组分中。将两次连续运行合并，得到最终组分，以便通过LC-MS/MS进行消化和分析。

MS肽样品制备

为了最大化单个样本的蛋白质组覆盖率，使用不同的物理化学方法（如非凝胶电泳或离子交换色谱）对样本进行分级。在本研究中，我们包括来自HEK293细胞系的SEC和OGE分离样品、来自血浆和LNCaP细胞系的SAX分离样品以及来自THP1和NCI60细胞系的OGE分离样本。

蛋白质水解

蛋白质样品用5 mM TCEP还原，并在过夜胰蛋白酶化前用10 mM碘乙酰胺烷基化。使用压力循环技术（PCT）协议对一些样品进行胰蛋白酶解，如下所述（如表1). SEC组分中的蛋白质在69°C下孵育10分钟后变性，在1%（v/v）脱氧胆酸钠存在下还原、烷基化并消化过夜。通过将pH降低到2来灭活胰蛋白酶，并将肽固定在C18柱上。多次洗涤后，洗脱肽（50%乙腈/0.1%甲酸），并在SpeedVac离心机中蒸发溶剂。重新悬浮后，样品在MS分析之前进行短暂的超声波处理。

PCT辅助裂解和消化

压力循环技术（PCT）33在环境和超高水平之间应用静水压循环来诱导细胞裂解，并实现对生物分子相互作用的精确热力学控制。使用Barocycler®NEP2320（PressureBioSciences，Inc，South Easton，MA）处理所有PCT处理过的样品。简而言之，在Barocycler程序下，组织或细胞系样品在含有8 M尿素、100 mM碳酸氢铵并辅以完整蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的缓冲液中进行溶解（组织样品：50 s 45 kpsi和10 s 14.7 psi的60个循环；细胞系样品：在35°C下120个周期，20 s 45 kpsi和10 s 14.7 psi）。然后将整个细胞/组织裂解物在冰上超声25 s，间隔1 min，共4次。通过离心去除组织碎片或未破碎的细胞（如有）后，蛋白裂解物在蛋白水解消化之前被还原并烷基化。依次添加Lys-C（酶底物比1:50）和胰蛋白酶（1:30）以消化蛋白质。在50 s 25 kpsi和10 s 14.7 psi的PCT方案下加速消化（细胞系样品：25 s 25 kpsi，10 s 14.7psi，持续45分钟），在此条件下Lys-C和胰蛋白酶保持活性。Lys-C消化在6 M尿素中进行45个周期，而胰蛋白酶消化在进一步稀释的尿素（1.6 M）中进行90个周期（细胞系样品：24 s 25 kpsi，10 s 14.7 psi，90 min）。随后，在使用SEP-PAK C18滤筒进行C18脱盐之前，将三氟乙酸（TFA）添加至最终pH值约为2（Waters Corp.，Milford，MA，USA）。

非凝胶电泳（OGE）

经过消化和脱盐步骤后，清洁的肽在OGE缓冲液中重新溶解，该缓冲液含有5%（v/v）甘油、0.7%ACN和1%（v/v）载体两性电解质混合物（IPG缓冲液pH 3.0–10.0，GE Healthcare）。肽在3100 OFFGEL（OGE）分馏器（安捷伦科技）上使用24 cm pH值3–10 IPG条带（GE Healthcare）在最大8000 V、50μa和200 mW的条件下分离，直到达到50 kVhr。回收所有馏分后，在C18反相MicroSpin柱（The Nest Group Inc.）上对其进行脱盐，并根据以下MS注射方案进行混合：

高铁293

池1（分数1-2）、池2（分数3）、池3（分数4）、池4（分数5）、池5（分数6-7）、池6（分数8-9）、池7（分数10-11）、池8（分数12-16）、池9（分数17-18）、池10（分数19-21）、库11（分数22-24）。

NCI60面板

池1（分数1-2）、池2（分数3）、池3（分数4）、池4（分数5）、池5（分数6-7）、池6（分数8-9）、池7（分数10-11）、池8（分数12-15）、池9（分数16-19）、池10（分数20-21）、池11（分数22）、池12（分数23-24）。

THP-1型

没有进行池操作。24个组分中的每一个组分注射一次，但第3、4、9和22组分注射两次。

1D凝胶电泳（1D GE）

根据蛋白质的分子量，使用SDS-PAGE将18个肾组织样本池分解为15个凝胶组分34在使用标准方案进行质谱分析之前，这些组分在凝胶中单独消化35。

强阴离子交换（SAX）

在基于移液管的阴离子交换器上分离总共50μg的肽，该阴离子交换器按照StageTip原理组装，将6层3M Empore阴离子交换盘（Varian，1214−5012）堆叠到200μl的微量移液管尖端中，如前所述36简单地说，平衡缓冲液由20 mM乙酸、20 mM磷酸和20 mM硼酸组成，用NaOH滴定至所需的pH值。肽在pH 11下加载，然后用pH 8、6、5、4和3的缓冲液分别通过7000×离心洗脱馏分克每次。流通部分和五个pH-洗脱部分均在C18 StageTips上捕获。

RT归一化肽

为了进行RT归一化和分析，根据供应商说明，在MS注射之前，将iRT试剂盒中的肽（瑞士纹影公司Biognosys AG）添加到所有样品中37。

用于谱库生成的DDA质谱

为了生成光谱库，使用了AB SCIEX TripleTOF 5600+系统质谱仪。它的操作基本上如前所述23，24：所有样品均在Eksigent纳米LC（AS-2/1Dplus或AS-2/2Dplus）系统和SWATH-MS启用的AB-SCIEX TripleTOF5600+系统耦合下进行分析。HPLC溶剂系统由缓冲液A（2%乙腈和0.1%甲酸在水中）和缓冲液B（2%水和0.1%乙酸在乙腈中）组成。样品在一个直径75μm的PicoTip发射器（新目标）中分离，该发射器装有20 cm的Magic 3μm，200μm C18 AQ材料（Bischoff色谱法）。以300 nl/min的流速从色谱柱中洗脱负载材料，洗脱梯度如下：线性2–35%B 120 min，线性35–90%B 1 min，等容性90%B 4 min，线性90–2%B 1 min和等容性2%溶剂B 9 min。质谱仪在DDA top20模式下操作，500和150MS1和MS2扫描的采集时间分别为毫秒，动态排除时间为20秒。碰撞能量扩散为15 eV的滚动碰撞能量用于破碎。

光谱和分析库生成

所有原始仪器数据（数据引用1）均按上述方法定心和处理24，27。分析库是根据以下协议生成的：TPP38（4.6.0）和SpectraST39（5.0）用于鸟枪蛋白质组学分析。使用X！单独搜索数据集！串联40（2011.12.01.1）带有k-score插件41、Myrimatch42（2.1.138），OMSSA43（2.1.8）和彗星44（2013.02r2）针对UniProtKB/Swiss-Prot注释的完整非冗余规范人类基因组45（2014_02），带有20 270个ORF和附加的iRT肽和诱饵序列。氨基甲酰（C）用作固定改性剂；氧化（M）是唯一的变量修饰。母体质量误差设置为±50 p.p.m.，碎片质量误差设为±0.1 Da。然后使用肽噬菌体对搜索标识进行合并并进行统计评分46和iProphet47TPP内部38.马玉48（1.07）用于选择iProphet临界值0.999354，导致蛋白质FDR为1.03%。SpectraST在库生成模式下使用CID-QTOF设置，并在导入时根据iRT Kit肽序列进行iRT标准化（-c_IRTirtkit.txt-c_IRR），并连续生成共识库49脚本spectrast2tsv.py（msproteomicstools 0.2.2；https://pypi.python.org/pypi/msproteomicstools网站)然后用于生成具有建议设置的asay库：-l 3502000-s b，y-x 1,2-o 6-n 6-p 0.05-d-w swat32.txt-k openswath。OpenSWATH（OpenMS/development，修订版：03377b6）工具ConvertTSVToTraML将TSV文件转换为TraML，并使用OpenSWATH工具OpenSwathDecoy Generator将诱饵附加到TraML分析库中，如前所述24在相反模式下，相似阈值为0.05 Da，身份阈值为1。分析库（数据引用2）进一步转换为与OpenSWATH、PeakView、Skyline和Spectronaut兼容的表格格式。

DIA质谱（SWATH-MS）

对于SWATH-MS数据采集（数据引用3），基本上按照之前所述操作相同的质谱仪和LC-MS/MS设置23，24，使用有效隔离宽度为25 Da的32个窗口（窗口左侧额外重叠1 Da），停留时间为100 ms，以覆盖400–1200的质量范围米/z在每个周期之前，采集MS1扫描，然后开始MS2扫描周期（400–425米/z第一次扫描的前体隔离窗口，424–450米/z第二次。。。1,174–1,200 米/z最后一次扫描）。每个窗口的碰撞能量是使用以窗口中间为中心、扩散为15 eV的2+离子的碰撞能量来设置的。

SWATH-MS数据分析

OpenSWATH公司

OpenSWATH（OpenMS/develove，版本：03377b6）分析工作流（OpenSwathWorkflow）的改进开发版本(http://www.openswath.org)用于所有数据分析。参数的选择与之前描述的参数类似24：min_rsq:0.95，min_coverage:0.6，min_upper_edge_dist:1，mz_extraction_window:0.05，rt_extracon_window:600，extra_rt_extriction_windows:100。

预言家（0.9.2）(https://pypi.python.org/pypi/pypeamotor)在OpenSwathWorkflow输出上运行，调整后包含前面描述的分数（xx_swath_prelim_score，bseries_score、洗脱模型fit_score、强度核心、同位素相关核心、同位素覆盖核心、库corr、库rmsd、log_sn_score和质量开发核心、质量开发核心加权、正常得分、xcorr_colation、xcorr洗脱加权、xcorr-shape和xcorr_shape_weighted.yseries_score）24和蛋白型肽，仅支持MAYU输出和30倍半监督学习迭代。这生成了一个OpenSWATH肽识别列表，一个仅包含目标肽和蛋白质以及假靶：诱饵比率（无法检测到的靶与诱饵的比率）的FASTA库，用于与MAYU直接分析。

使用MAYU（1.07），最大mFDR为0.1200 mFDR步长，并计算假靶：诱饵比率，以计算与所选蛋白质FDR对应的分析水平q值（m_score）截止值。对每次单独分析和过滤的肽和蛋白质鉴定进行所有进一步分析。

峰值视图

如Lambert所述，使用PeakView（AB SCIEX）重新处理之前收集的AP-SWATH样本数据集等。28基本上，原始数据是使用样本特定分析库或组合分析库进行处理的，提取峰面积并使用PeakView SWATH微型应用程序进行评分。提取并过滤峰面积以去除所有肽，这些肽在所有测量中没有FDR小于1%的单一测量。

如前所述，通过最可能的比率归一化和折叠变化测定处理提取的峰面积28。将样本特异性分析库的折叠变化分析结果与组合分析库的褶皱变化结果进行比较。

数据记录

数据记录1

用于生成组合分析文库的质谱发现蛋白质组学数据（仪器原始文件、质心mzXML和pepXML报告中确定的肽）已保存到ProteomeXchange Consortium(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过PRIDE合作伙伴存储库51数据集标识符为PXD000953（数据引用1）。

数据记录2

光谱库（SpectraST格式）和分析库（CSV、TraML）可用于SWATHA特拉斯的不同SWATH-MS数据分析工具，数据集标识符为SAL00016-35（数据引用2）。

数据记录3

用于验证样本特异性和联合分析文库的质谱SWATH-MS数据（仪器原始文件、mzXML和OpenSWATH报告中确定的肽）已存入ProteomeXchange Consortium(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过PRIDE合作伙伴存储库50数据集标识符为PXD000954（数据引用3）。

技术验证

分析库饱和度分析

大规模基于MS-的蛋白质组学实验容易在肽和蛋白质水平上积累错误识别。因此，严格过滤这些数据集至关重要，尤其是为了生成分析库。我们应用了在马余实施的战略48在蛋白质水平上将分析库调整为1%的FDR，从而产生iProphet47概率截止值为0.999354。在这个截止点，真阳性蛋白鉴定的数量已经达到饱和(图2a). 这与真阳性肽鉴定的数量相反，真阳性肽的数量可能会进一步增加，但代价是接受更多的假阳性蛋白鉴定(图2b). 这一结果与其他大规模数据集的观察结果一致，在这些数据集中，真正可检测的蛋白质通常具有许多与同一蛋白质冗余匹配的相关肽。另一方面，假阳性识别并不显示这种冗余，因此需要非常严格地控制错误率，从而导致大量假阴性识别51。

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联合分析库的统计数据以及与其他人类蛋白质组绘图工作的比较。(一)真阳性（红色）和所有蛋白质鉴定（蓝色）作为蛋白质FDR的功能。该图表明，真正阳性的蛋白质鉴定数量在蛋白质FDR截止值为0.05时饱和。在不太严格的FDR截止点的其他鉴定主要是假阳性蛋白鉴定。(b条)真阳性（红色）和所有肽鉴定（蓝色）作为蛋白质FDR的功能。该图表明，真阳性肽鉴定的数量与肽鉴定的总数密切相关，并且在蛋白质FDR截止值的典型水平内未达到饱和。(c（c）)每个样本类型的PSM数量对分析库有贡献。多个PSM可以构成一个一致的光谱，并且每个MS注射单独计数。NCI60细胞系组的贡献最大，HEK293细胞、肠道组织和THP1细胞各占所有光谱的10%以上。(d日)UniProtKB/Swish Prot策划的人类蛋白质的重叠，这是一个用蛋白质水平证据和所提供的联合测定文库（CAL）注释的子集。在蛋白质水平上，分析库提供了68.2%的蛋白质覆盖率和证据，同时提供了额外802个蛋白质的分析。与UniProtKB/Swiss-Prot相比，分析库包含20264个蛋白质的50.9%。

从DDA数据集中识别的蛋白质数量在很大程度上取决于所搜索序列数据库的冗余度。具有高度序列冗余的数据库可能会扩大蛋白质鉴定，因为实质上相似或不可区分的蛋白质被视为单独的物种。因此，不建议使用UniprotKB/TrEMBL或国际蛋白质指数（IPI）等冗余蛋白质数据库来生成分析库，因为它们增加了生成随机单次命中识别的可能性48，52在本研究中，我们使用UniprotKB/Swiss-Prot作为蛋白质注释的基础，该注释被认为是领先的通用精选蛋白质序列数据库45，53并且只包含非冗余条目。

组合分析库（CAL）包含16种不同样品类型的进样，每个样品对一致性光谱库的相对贡献在1到37%之间。总的来说，NCI60细胞系小组、HEK293和THP1细胞系以及肠道和肾脏组织样本是主要的贡献者，在所有超过阈值的一致性肽谱匹配（PSM）中，它们共同占近90%(图2c). 这种大范围的覆盖主要是由于蛋白质和肽水平上的广泛分离以及每种样本类型的MS注射数量众多。

与蛋白质组发现现状的关系

近年来，一些研究和项目旨在绘制完整的人类蛋白质组，其中包括HUPO染色体中心人类蛋白质组项目（C-HPP）7，8，其试图表征每个人类蛋白质编码基因的至少一种蛋白质产物54已经对几个人类细胞系的蛋白质组进行了详尽的鉴定4–6，4–6，4–6最近，人类蛋白质组草图已经出版，占84%9或92%10注释过的人类基因组。

我们将联合分析文库中包含的蛋白质与UniProtKB/Swiss-Prot（2014_05版）注释的蛋白质进行了比较，并将其中注释的蛋白质与蛋白质水平的证据进行了比较55。我们将UniProtKB/Swiss-Prot标识符的非冗余规范列表映射到组合分析库中包含的蛋白型肽识别的蛋白质。图2d表明在蛋白质水平上，我们的文库在用蛋白质水平证据注释的13956种蛋白质中达到68.2%的覆盖率，同时为另外802种蛋白质提供了分析。与UniProtKB/Swish Prot相比，组合分析文库包含所有20264种蛋白质的50.9%。表2提供了组合分析库内容的概述。

表2

组合分析库的分析统计。
蛋白质型 蛋白型+共享
描述了以蛋白质FDR 1%过滤的蛋白质、肽、前体和过渡的数量。联合分析库提供了所有靶点和诱饵分析，但所有下游分析只考虑了蛋白型分析。  
蛋白质10,31611,588
肽类139,449146,576
前驱体194,052204,545
过渡1,164,3121,227,270

SWATH-MS靶向数据分析组合分析库的适用性

使用HeLa和U2OS细胞株的全细胞消化样本进行分析，以比较组合（CAL）和样本特异性分析库（ss-HeLa/ss-U2OS）的性能。首先，我们通过从三次重复注射未分离的肽样品中获取DDA数据集（也包含在组合分析库中），从各个细胞系的裂解液中生成样本特异性分析库。对于HeLa细胞，产生的样本特异性分析文库包含2583个蛋白质、16096个肽、18124个前体离子序列和108744个跃迁。对于U2OS细胞，该文库包含2610个蛋白质、15334个肽、17360个前体和104160个跃迁。对于这两种细胞系，数据被过滤到1%的蛋白质FDR，并且所有进一步的分析只考虑了蛋白质型分析。两种细胞系的肽和蛋白质水平与联合分析文库的重叠均超过99%(图3a). 两个样本特异性文库之间的重叠在肽水平上超过70%，在蛋白质水平上大约80%。这两个库分别用于分析使用OpenSWATH在DIA模式下采集的相同样本24如上文所述，使用分析水平的q值阈值（m_score）来估计蛋白质FDR。

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使用不同蛋白型分析文库通过SWATH-MS鉴定肽和蛋白质的数量。(一)描述了组合分析文库（CAL）和样本特异性分析文库中包含的蛋白型肽及其重叠。样本特异性文库之间的肽水平重叠超过70%，蛋白质水平重叠约80%。样本特异性文库中包含的239个肽不包括在CAL中，因为它们不符合CAL更严格的质量标准(b条)描述了肽FDR依赖性的真阳性肽识别数。使用组合文库，肽FDR低于1%（灰色虚线）时，真阳性肽鉴定的数量与样本特异性文库相匹配。(c（c），d日)HeLa的真阳性蛋白鉴定数(c（c）)或U2OS(d日)描述了依赖于蛋白质FDR的单个、普通注射中的全细胞裂解物。报告了所有鉴定或非单次命中（NS）的蛋白质FDR截止值。与HeLa和U2OS的样本专用库相比，CAL在典型的错误率控制水平下提供了类似的灵敏度。CAL的非单一命中识别通常在较低的蛋白质FDR截止值下提供较高的灵敏度。灰色虚线表示蛋白质FDR截止值为1%。(e（电子）)肽FDR依赖性中肽鉴定的再现性。颜色表示3个技术复制品中的1个（绿色）、2个（蓝色）或3个（红色）的再现性。ss-HeLa（顶部）和CAL（底部）都能够在同一肽FDR的所有重复物中检测到相似数量的分析。CAL仅能在一个或两个重复中检测到更多低强度肽。(如果)在1%肽FDR条件下，在所有三个重复中确定的前体总跃迁强度的变异系数（CV）分布。5%（U2OS）至10%（HeLa）的中位数变异系数与预期的技术变化非常吻合，并且在样本特异性和组合分析库之间非常相似。

在蛋白质FDR为1%的情况下，当使用整个组合分析文库或样本特异性分析文库时，样本中的真阳性蛋白质鉴定数量非常相似(图3c、d). 然而，与样本特异性分析库确定的非单一点击数相比，组合分析库提供的蛋白质水平覆盖率增加了49–59%(表3). 这种明显的差异可以通过使用组合分析库与样本特异性分析库相比较确定为真阳性的肽的数量来解决。因为组合测定文库能够在1%的肽FDR下检测超过35%的肽(图3b)，排除单个点击可以检测更多蛋白质。总的来说，这些数据表明，在典型的FDR控制水平下，组合分析库以更高的灵敏度识别肽。

表3

组合和样本特异性分析库的识别统计。
蛋白质FDR 卡尔·赫拉
  ss希拉
校准U2OS
不锈钢U2OS
保护 激励 保护 激励 保护 激励 保护 激励
报告了使用组合（CAL）和样本特异性（ss）分析文库在常用蛋白质FDR截止值处HeLa和U2OS细胞系全细胞裂解物的SWATH-MS数据集中鉴定的蛋白型肽和蛋白质的数量。报告了所有鉴定或非单次命中（NS）的蛋白质FDR截止值。MAYU报告了联合分析文库和样本特异性分析文库的真阳性蛋白（prot）和肽（pep）鉴定结果。        
1%2,41714,9302,35314,6352,61715,6082,45214,360
2%2,73017,2942,46715,4162,98918,3212,54114,982
5%3,24621,1282,51415,6723,48621,8932,55215,003
NS 1%2,60823075个1,75014,9992,80324,0091,76314,599
NS 2%2,8042500美元1798年15,5372,96525,4971,81515,002
NS 5%3,11128,0021,82015,6683,24128,4421,81914,999

根据HeLa样品的肽FDR的依赖性，三个技术复制品中肽鉴定的再现性如所示图3e。在所有三个样本中识别的肽数量对于组合库和样本特异库都是相似的。然而，CAL仅在一个或两个重复中检测到更多的肽。对CAL和样本特异性文库在1%FDR下对这些肽的进一步评估表明，它们主要是低强度肽（CAL:1/3（在3个重复中的1个中检测到）33433±38083（每个前体片段离子强度总和的平均值±标准差），2/3（39504±39440），3/3（89935±140914）；黑拉酵母菌：1/3（35865±38467），2/3（39440±52346），3/3（97226±152470））。在所有三个重复中，这些低强度肽映射的大多数蛋白质（CAL:77.4%；ss-HeLa:82.0%）也被不同的高强度肽检测到。这表明，这些分析没有导致假阳性蛋白质鉴定，而是能够测量相同蛋白质的其他肽，并且CAL和样本特异性分析库的分析在靶向蛋白质组学实验中的鉴定再现性方面非常相似。由于样品的复杂性和DDA算法的局限性，这些分析不存在于特定于样品的分析库中，DDA算法只选择最强烈的前体进行裂解。

发现前体水平量化信号的变异系数（CV）与低于20%的重复之间的预期技术变异很好地对应24(图3f). 此外，使用组合库和样本特异库的量化信号的CV对于两种细胞系非常相似，表明保守可靠的量化性能。

组合分析库对不同样本类型和实验室的可移植性

为了测试生成的分析库的可移植性，我们使用了来自组合分析库的特定蛋白质分析子集，用于重新分析Lambert的CDK4 AP-SWATH数据集等。28。此数据集是在用于生成此处显示的分析库的同一类型仪器上生成的。然而，用于生成样本特定库的SWATH-MS数据和DDA数据是在不同的实验室、不同的时间点和使用不同的色谱条件获得的。使用原始样本特异性文库或此处报告的组合文库中包含的相应分析，我们测定了野生型和突变CDK4状态（R23C、R23H）之间蛋白质的折叠变化。图4显示了使用来自组合库的分析的原始分析和再分析的比较和重叠。不同分析库之间的蛋白质折叠变化测量值具有可比性。因此，数据表明，即使数据是在不同的时间和不同的实验室获得的，组合库中包含的分析也可以成功地用于进行蛋白质定量。对组合中的肽与作为原始出版物一部分创建的样本特异性分析文库中的肽进行对比研究表明，在大多数情况下，不同文库之间的蛋白质覆盖率相当。在CD2A1和CDN2C等不同分析文库的蛋白质表达谱不同的情况下，折叠变化的差异可归因于文库中存在的肽数量的差异。这些结果表明，此处显示的组合分析库中包含的分析可在不同的实验设置之间移植。

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将组合分析库（CAL）应用于独立采集的数据集（CDK4 AP-SWATH，Lambert等。28)并与样本特异性分析库（ss）进行比较。指出了用晶须进行标准差比较的野生型（WT）和突变体（R24C或R24H）的折叠变化。与样本特异性分析库相比，CD2A1和CDN2C组合库中包含的分析包含更少且不同的肽，因此折叠变化较小。结果表明，使用组合分析库可以从使用不同实验设置、数据采集和数据分析策略进行的SWATH-MS实验中检索到可比较的定性和定量结果。

使用说明

分析库在SWATH-MS数据中的应用

应用分析库搜索SWATH-MS数据集有两种不同的方法。第一种方法是选择性搜索预定的蛋白质组，第二种方法是使用整个库全面搜索SWATH-MS图谱。在第一种情况下，可选择感兴趣的肽或蛋白质作为先前的信息，例如来自早期蛋白质组学或转录组学测量或来自文献。因此，可以相应地过滤组合分析库，以便查询转换列表仅包含这些目标蛋白质或肽的分析。为了简化这一步骤，我们提供了SWATHA特拉斯上特定蛋白质和肽的联合分析库查询。这些分析可以在Skyline等软件中使用25或PeakView进行数据分析和可视化。

在第二种情况下，没有预先选择目标肽或蛋白质，整个分析库用于通过OpenSWATH等自动化软件搜索SWATH-MS图24。由于整个组合文库包含10000多个蛋白质的分析，典型的短梯度单SWATH-MS图谱通常可以识别2000–5000个蛋白质，因此整个分析文库针对的大多数蛋白质要么不存在于样品中，要么无法检测到。为了避免由于多重比较问题导致的假阳性，使用MAYU等工具根据肽或蛋白质FDR适当设置分数截止值至关重要48此方法取决于目标经济方法的正确应用56我们发现，特别是对于这里介绍的非常大的分析库，生成诱饵分析是至关重要的，这些诱饵分析保证与目标分析不同，并且代表完整样本。为了使即使是高度重复或回文肽序列也能产生诱饵跃迁，我们发现序列的完全反转满足这些要求。

通过将整个组合分析库应用于上述HeLa SWATH-MS数据集，说明了多重比较问题的效果。在分析中，MAYU测定的分析FDR约为0.0036%，导致蛋白质FDR为1%。相比之下，对于样本特异性文库，同样的蛋白质FDR达到了约0.6%的分析FDR。这种差异部分与鸟枪蛋白质组学数据库搜索中的观察结果有关，即搜索非常大的数据库，例如基因组数据库的六帧翻译，会增加随机PSM的可能性。然而，这种情况与序列数据库搜索不同，因为目标方法试图检测可变数量的实验观察离子色谱图中的特定信号组。

提供了OpenSWATH的更新版本(http://www.openswath.org)直接使用MAYU进行蛋白质FDR评估。

所提供的数据是在Eksigent nanoLC（AS-2/1Dplus或AS-2/2Dplus）系统与AB SCIEX TripleTOF 5600+系统耦合的情况下获得的，因此组合分析库针对这种仪器进行了优化。然而，该分析库也可以应用于其他高分辨率仪器上采集的DIA数据。在这种情况下，可检测分析的预期比例取决于仪器在破碎方法和液相色谱方面的相似性。特别是，当将qTOF-CID光谱（如本文所示）与离子阱HCD光谱进行比较时，片段模式的保守性很高，表明分析具有良好的可移植性57，58此外，这里使用的标准化保留时间是一个无量纲值，可以使用峰值标准转换为不同的LC设置37最后，mProphet采用的半监督学习方法59以及OpenSWATH、Spectronaut和Skyline等相关软件调整了碎片或保留时间减少对鉴别评分函数的影响，以保持准确分离真假检测分析。

根据显示的数据生成自定义分析库

定制的分析库可以针对特定的样本类型、蛋白质组和蛋白质组背景进行优化。对于蛋白质组分析等特殊应用，可以通过额外搜索光谱数据以进行翻译后修饰（如磷酸化）或使用不同的蛋白质序列数据库（例如，包含蛋白质亚型的数据库）来生成自定义分析库。建议应用可扩展的分析库生成工作流，以控制错误率。作者（舒伯特，O.T.，吉列，L.C.，柯林斯，B.C.，纳瓦罗，P.，罗森伯格，G.，沃尔斯基，W.E.，拉姆，H.，阿莫迪，D.，麦克莱恩，B.，马利克，P.&艾伯索尔德，R.）正在准备一份为生成大规模分析库提供详细说明的手稿。特别是对于修改，需要评估和说明正确现场分配的置信度。60。

组合测定文库的转换是根据一种方案选择的，该方案能够将定性和定量的可比较结果作为样品特异性测定文库(图3和​和4）。4). 本研究中使用的软件工具可以自动检测具有许多干扰跃迁的分析，并影响灵敏度而非选择性，因此不会增加假阳性的数量24。由于组合分析库包含对86.5%所有蛋白质的一个以上蛋白型肽的分析，因此在大多数情况下，可以使用不同的肽进行定量。然而，对于某些应用，特别是当分析非常复杂的人体样品或差异位点修饰的蛋白质组时，可以根据独特离子特征（UIS）概念改变过渡选择61.使用SRMCollider等工具62，可以为给定的背景蛋白质组选择转换（例如，基于先前识别的蛋白质），以最小化与其他共洗脱肽的潜在干扰。此外，SWATH-MS能够使用对同一肽的不同分析进行迭代再分析，因此可以使用经验标准针对特定样本类型优化组合分析库。

人体分析库的扩展

这是合并的人类SWATH-MS分析库的第一版，将添加更多扩展。类似于HUPO人类蛋白质组项目和绘制人类蛋白质组的最新研究9，10，满足SWATH-MS分析库生成要求的数据可以在ProteomeXchange等公共存储库中收集63随着涵盖人类蛋白质组扩展部分的新数据集可用，可以定期生成新的分析库。如本研究所示，扩展不会影响分析库子集的结果，但可以对人类SWATH-MS数据集进行更完整和可比较的靶向分析。

其他信息

如何引用本文：罗森伯格（G.Rosenberger）。等。通过SWATH-MS量化10000人类蛋白质的分析库。科学。数据1:140031 doi:10.1038/sdata.2014.31（2014）。

补充材料

补充信息：
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单击此处查看。（18K，拉链）

致谢

G.R.由瑞士联邦技术与创新委员会CTI（13539.1 PFFLI-LS）资助。H.L.R.由苏黎世联邦理工学院资助（ETH-30 11-2）。P.K.得到了芬兰文化基金会的支持。E.C.得到了玛丽·居里欧洲内部奖学金的支持。M.F.得到了欧洲分子生物学组织长期奖学金的支持。M.M由TRIREME资助。H.L.由香港特别行政区政府研究资助委员会的一般研究基金（#602413）资助。S.L.B得到了瑞士国家科学基金会（PBZHP3 143482）的资助。R.L.M.、D.S.C.和E.W.D部分由《美国复苏和再投资法案》的联邦资金支持，该资金来自国家人类基因组研究所、国家卫生研究院、国家普通医学科学研究所的拨款RC2 HG005805，拨款号为2P50 GM076547/系统生物学中心，GM087221和S10RR027584。R.A.由欧洲研究委员会高级拨款Proteomics v3.0（ERC-2008-AdG_20080422）、SystemsX.ch的PhosphonetX项目和瑞士国家科学基金会（3100A0-107679）资助。我们要感谢Sharon Rashi Elkeles对CAL51细胞的产生，感谢苏黎世联邦理工学院ITS科学IT服务部门对实验室内部计算基础设施的支持和维护，感谢EBI的PRIDE团队对ProteomeXchange Consortium数据存储的支持。

脚注

S.T.是AB SCIEX的员工，该公司在本文所涵盖的领域开展业务。AB SCIEX为R.A.研究小组提供了部分支持，为其提供了原型仪器。R.A.持有Biogonosys AG的股份，该公司在本文涵盖的领域开展业务。其余作者声明没有竞争性的经济利益。

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