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EMBO分子医学。2014年10月；6(10): 1263–1278.
2014年8月20日在线发布。 数字对象标识：10.15252/emmm.201404084
预防性维修识别码：项目经理4287931
PMID：25143352

河盲症药物伊维菌素和相关大环内酯抑制人类癌症WNT-TCF通路反应

爱丽丝·梅洛蒂,* 克里斯托夫·马斯,* 莫妮卡·库夏克,* Aiala Lorente-Trigos公司, 伊莎贝尔·博尔赫斯,和阿里尔·鲁伊兹·阿尔塔巴†
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补充资料

摘要

典型WNT-TCF信号的组成性激活与多种疾病有关，包括肠癌和肺癌，但临床上没有WNT-TCF拮抗剂。我们对WNT-TCF应答阻滞剂进行了重新定位筛选，旨在重述显性阴性TCF所提供的基因阻断。我们报道，伊维菌素抑制WNT-TCF靶点的表达，模拟dnTCF，其低浓度效应可通过TCF的直接激活来缓解副总裁16伊维菌素抑制各种人类癌症类型的增殖和增加凋亡。它以冈田酸敏感的方式抑制C末端β-CATENIN磷酸形式和CYCLIN D1的水平，表明其作用涉及蛋白磷酸酶。体内，伊维菌素选择性抑制TCF依赖性但非TCF依赖性的异种移植物生长，无明显副作用。对单一半合成衍生物的分析强调了色拉菌素，促使其临床测试和大环内酯化学空间的探索。鉴于伊维菌素是一种安全的抗寄生虫药物，超过2亿人使用它来对抗河盲症，我们的结果表明，它还可以作为治疗性WNT-TCF通路反应阻断剂来治疗WNT-TCC依赖性疾病，包括多种癌症。

关键词：癌症、伊维菌素、TCF、WNT、异种移植

介绍

对调节胚胎发生和成体组织稳态的细胞-细胞通信信号通路的识别，以及在过度增殖或退化性疾病中的改变，导致了特定通路调节剂可能是有效的治疗剂的想法。例如，已发现多种散发性人类癌症含有过度活跃的典型WNT信号，导致β-CATENIN的组成性激活，β-CATEN是一种关键的多价蛋白，在多个位点被磷酸化修饰。特别是，早期结肠癌通常表现为肿瘤抑制因子腺瘤性息肉病大肠杆菌（APC）的功能丧失，APC是β-CATENIN破坏复合物的关键成分，或者β-CATEN的N末端功能获得突变使其对APC耐药。在这两种情况下，这都会导致典型的WNT途径激活以及由此产生的靶基因调控（在Kinzler和Vogelstein中进行了综述，1996; 麦当劳等,2009; 瓦伦塔等,2012; 瓦尔纳特等,2010). 其他癌症也显示出活跃的典型WNT途径；这些包括肺癌、胃癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌以及黑色素瘤和胶质瘤（例如阮氏等,2009; 坎多斯等,2013;http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/universal/).

在正常胚胎发生和体内平衡中，典型的WNT途径被分泌的WNT配体激活，这些配体以高度受控的上下文依赖方式和精确的数量产生。WNT活性在细胞质中转导，使APC破坏复合体失活，并导致活化的β-CATENIN移位到细胞核，在细胞核中与DNA-结合的TCF/LEF因子协同调节WNT-TCF靶点和随后的基因组反应（例如Kinzler和Vogelstein，1996; Shitashige公司等,2008; 麦当劳等,2009; Clevers&Nusse，2012; 瓦伦塔等,2012).

在没有WNT配体的情况下，APC破坏复合物在其N末端区域（包括通过CK1和GSK3β激酶在Ser33/Ser37处）磷酸化细胞质β-CATENIN，以进行蛋白酶体降解。如果没有活性核β-CATENIN，则不会激活阳性WNT-TCF靶点。相反，在活跃的WNT信号传导下，β-CATENIN逃避细胞质降解，并在其C末端被磷酸化，例如在Ser552和Ser675位置，被各种激酶磷酸化，包括AKT、PAK、PKA，可能还有AMPK。这种C末端磷酸化被发现对β-CATENIN与TCF因子（Hino）的转录功能至关重要等,2005; 牛磺酸等,2006; 方等,2007; 赵等,2010; 朱等,2012年a). 这些发现表明，除了APC销毁复合体的活动损失外空气污染指数β-CATENIN在C末端位点的磷酸化是癌症中WNT-TCF信号传导的完全激活和随后的WNT-TCF反应所必需的。

通过药物抑制WNT信号传导的尝试，已识别出许多在核心信号级联中不同水平发挥作用的小分子（例如Lepourcelet等,2004; 科廷和洛伦齐，2010; 阿纳斯塔斯和月亮，2013; 看见http://www.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/smallmolecules网站). 其中包括豪猪蛋白酶和坦基酶抑制剂，它们分别促进正常WNT配体分泌或细胞质转导（Huang等,2009; 道奇牌汽车等,2012; 瓦勒等,2012; 刘等,2013). 然而，在配体功能或细胞质转导水平以下激活WNT信号，例如在APC丢失的情况下（见上文），似乎会使上游水平的通路阻断效应复杂化。到目前为止，临床上还没有批准的WNT信号抑制剂，新的先导化合物的临床试验很长，成本很高，成功率不到1/20。

因此，我们使用成熟的转录报告分析（Barker&Clevers，2006)由活化的APC敏感性N端突变β-CATENIN（N'Δ45β-CATEN）驱动的TCF活性。然而，为了寻找肿瘤中WNT-TCF反应的阻断剂，我们进行了两个关键的修改：i-一个可靠的动态范围，由活化的β-CATENIN作为激活极，活化的β-CATENIN加显性阴性TCF（dnTCF）作为抑制极，以及dnTCF活性对任何命中的基因阻断的非模拟必要条件。

我们发现阿维菌素家族的大环内酯在人类癌细胞中具有特异性抗WNT-TCF反应活性，临床批准的化合物伊维菌素（EMEA和FDA批准）是低摩尔浓度下的特异性WNT-TCC反应阻滞剂。

伊维菌素和其他大环内酯是耐受性良好的药物，已用于治疗数百万人的河盲症（Thylefors，2008; 特劳雷等,2012)和其他寄生虫感染（坎贝尔等,1983; 冈萨雷斯等,2012; 诺兰和洛克，2012). 伊维菌素的这些作用被归因于其对寄生虫配体门控氯离子通道（Hibbs&Goauux，2011; Lynagh&Lynch，2012). 我们描述的低剂量伊维菌素的WNT-TCF反应阻断表明其作用与氯离子通道的解除无关。它的低浓度效应通过TCF转录活性的直接构成激活而得到抑制，并涉及C末端磷酸化β-CATENI形式和细胞周期蛋白D1水平的抑制，CYCLIN D1是癌基因和阳性细胞周期调节因子的关键靶点。此外，阿维菌素单分子衍生物Selamectin是一种广泛用于兽医的药物（Nolan&Lok，2012)，在纳米摩尔范围内的效力是其10倍。最后，伊维菌素体内对TCF抑制敏感的人结肠癌异种移植物的疗效，无明显副作用。全身伊维菌素抑制肺癌生长的能力体内特别支持使用伊维菌素和其他大环内酯，如一般的Selametin，作为WNT-TCF通路反应阻断剂，以对抗WNT-TCC依赖的人类疾病，包括肠癌、乳腺癌、皮肤癌和肺癌。

结果

在模拟dnTCF作用的人类癌细胞中鉴定阻断WNT-TCF通路反应的药物

我们使用了由APC不敏感的N’Δβ-CATENIN驱动的TCF活性的转录报告基因分析，来测试一组临床试验测试的小分子（Microsource 1040文库）（图​（图1A）。1A） ●●●●。优化的分析包括人类293T细胞中的多重TCF结合位点萤火虫荧光素酶报告子，其五倍的动态范围由活性N'Δβ-CATENIN的最大刺激和N'△β-CATEN+dnTCF的最大抑制决定（参见Varnat等,2010)（图​（图1A）。1A） ●●●●。所有分析还包括正常化的Renilla荧光素酶对照（见材料和方法）。突变TCF-结合位点报告基因对一般转录的非特异性影响控制不是简化筛选的一部分，但通过rt-qPCR检测看家基因的内源性转录直接解决了这一问题（见下文）。主屏幕的命中率为2.6%，抑制活性>55%（图​（图1B）。1B） ●●●●。这排除了3.3%的被认为对细胞有毒的化合物，因为它们抑制的荧光素酶活性低于dnTCF提供的活性。

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小分子β-CATENIN-TCF拮抗剂的鉴定
  1. 流程图概述了导致选择具有抗β-CATENIN/TCF和抗肿瘤活性的小分子的顺序测定。基于小分子在人类293T细胞中的中-高通量发光分析中的活性，首次从1040 USP批准的文库中选择小分子，该分析使用N末端截短的N'Δ45β-CATENIN和多聚酶TCF结合位点→荧光素酶报告子。然后将阳性化合物提交给使用人类癌细胞的一系列选择步骤，包括从上到下：（i）在BrdU掺入试验中抑制癌细胞增殖；（ii）通过qRT-PCR在癌细胞系和原代癌细胞中测定的TCF靶基因特征的抑制；（三）以TCF活动为主的上位救援；（iv）体内通过将IP注射到携带皮下癌异种移植物的NMRI裸鼠中来评估命中率。
  2. TCF报告者检测293T细胞中萤火虫/Renilla荧光素酶水平的定量图，该细胞由库化合物测试产生。上面的插图显示了库中的点击数分布，下面的图表显示了低于45%的27次点击的放大倍数（占化合物总数的2.5%），而TCF报告子加上N’Δβ-CATENIN和DMSO控制（黑点）的水平相当于100%。每个板中的其他对照如下：TCF报告者单独作为阴性对照（紫色方块），TCF报告器加N’Δβ-CATENIN加dnTCF作为阳性对照（红色菱形）。1040种化合物首先在10μM下在独立平板中分别筛选，一式两份，结果用其平均值（蓝色三角形）进行评分和表示，并注明单个值（如顶部和底部条形图所示）。未显示完全得分低于dnTCF活性水平（红钻石）的有毒化合物。在所有检测中，萤火虫荧光素酶活性均通过Renilla荧光素素酶报告值进行标准化，Renilla-荧光素酶由普遍存在的病毒胸苷激酶启动子驱动。
  3. MicroSource 1040列表中的前9个候选拮抗剂及其代码、使用的微摩尔浓度、名称、一般已知特性和TCF-荧光素酶报告活性的抑制以及293T和结肠癌Ls174T细胞中BrdU掺入情况的表。这两个值都显示为DMSO控制的减少百分比，如底部所示（等于100%）。请注意，在选定的9个点击中，只有4个（红色）会减少BrdU的掺入，从而使人类结肠癌细胞的增殖减少50%以上。
  4. 抗BrdU抗体（红色）标记和DAPI（蓝色）染色后的Ls174T细胞免疫化学标记显微照片，以显示细胞复制程度（BrdU掺入，红色）和总细胞数（细胞核染色为蓝色）。以DMSO作为对照（顶部）和4B5（底部）在10μM下处理48小时的结果。比例尺=50μM。
  5. 通过RT-qPCR测定7基因WNT-TCF特征的人类结肠癌Ls174T细胞mRNA表达值的热图。所有值均为个体基因表达Ct值与看家基因Ct值归一化后实验值与对照（仅DMSO处理）比值的百分比。作为阳性对照，作为我们的遗传基准，显示了转染24小时后dnTCF表达驱动的表达水平。在治疗后12小时收集药物治疗的样本。表达变化突出显示如下：深蓝色：抑制在55%或以下。浅蓝色：抑制低于80%。红色：增强150%以上。只有4B5（红色箭头）跟踪dnTCF生成的完整签名更改。

屏幕上的前九名候选人（图​（图1B，1B年，补充图S1）-显示高于dnTCF给出的基线水平的标准化TCF-尿囊酶报告活性的最高抑制水平，然后选择并测试其对人类Ls174T结肠癌细胞增殖的抑制作用，因为这是WNT-TCF依赖性的（van de Wetering等,2002). BrdU掺入分析表明，与DMSO处理的对照细胞相比，所选九种化合物中只有四种抑制了50%以上的细胞增殖（图​（图1C1C和D），二次命中率为-0.4%。

三级分析测量了Ls174T细胞中典型WNT-TCF靶基因的既定队列的mRNA水平（van de Wetering等,2002; 哈齐斯等,2008)治疗12小时后，突出早期反应。与对照细胞相比，dnTCF4阻断WNT-TCF（在整个研究中用作遗传基准）产生了一种基因表达模式，包括下调和上调基因（图​（图1E）。1E） ●●●●。表达水平由“看家”基因的表达水平标准化TBP（待定）和HMBS公司（见材料和方法）。这些基因的表达不受候选化合物的影响，从而对一般转录效应提供了额外的控制。

在4种假定的拮抗剂中，只有一种4B5（阿维菌素B1）完美地追踪了dnTCF4诱导的基因表达谱（图​（图1E，1E级，箭头）。4G11（奥苯咪唑）产生了类似的信号，但未能抑制LGR5级延伸至4B5（图​（图1E）。1E） ●●●●。虽然它含有部分WNT-TCF拮抗剂活性，但商品化的氧苯达唑在很大程度上是不活跃的（B.Petcova、CM和ARA，数据未显示）。与Ls174T细胞一样，4B5治疗改变了原发性人类局部结肠癌TNM4 CC14细胞的TCF靶点和细胞增殖（未检测到突变空气污染指数或β-阳离子)原发性结肠癌肝转移mCC11细胞（Varnat等,2009)以剂量依赖的方式（补充图S2）。屏幕的最终点击率为0.1%。

阿维菌素、伊维菌素和色拉菌素及相关大环内酯对人癌细胞的抗增殖活性

4B5代表防腐剂阿维菌素B1，属于16个成员的阿维菌素大环内酯家族，来源于阿维链霉菌它是一种含有>80%阿维菌素B1a（5-O-去甲基-阿维菌丁a）和<20%B1b（5-O--去甲基-25-de（1-甲基丙基）-25-（1-甲基乙基-阿维菌素A1）（S3）的发酵混合物。伊维菌素是一种经临床批准的阿维菌素B1衍生物（22,23二氢阿维菌丁B1a的含量大于90%，22,23双氢阿维菌丁B1b的含量小于10%）（图​（图2A，2年，补充图S3），用于人类防治昆虫和蠕虫感染，包括由以下原因引起的河盲症卷尾蛇（蒂尔福斯，2008; 特劳雷等,2012).

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伊维菌素、色拉菌素和相关大环内酯的抗增殖和促凋亡作用，以及WNT-TCF靶点的阻遏
  1. 伊维菌素和色拉菌素的化学结构。注意，伊维菌素是一种发酵混合物，有两种主要形式，用R表示。
  2. BrdU合并IC表50s、 根据补充图S3所示的三倍数据，用PRISM计算。Stromectol™是当地药店的伊维菌素的商业名称。如前所述，显示了多种人类癌症类型和多种人类结肠癌细胞的结果。
  3. 活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3百分比表+不同药物浓度处理后不同细胞类型的细胞。
  4. WNT-TCF靶点mRNA表达水平的热图显示为不同处理下细胞内务处理基因正常化Ct值与DMSO处理的对照DLD1或Ls174T细胞正常化Ct值的比值。无控制变更显示为值1。深蓝色：表达抑制在0.6或以下。红色：表达增强1.5倍以上。
  5. 如（D）所示的热图显示了与同时采集的DMSO对照同胞细胞相比，用5μM伊维菌素、多拉菌素、莫西捷汀或Bryostatin治疗12小时后，两种结肠癌细胞类型中三个TCF靶点的表达变化。

伊维菌素表现出类似的IC50关于BrdU公司在体外横跨几种人类结肠癌细胞（IC50：1–2.4μM）阿维菌素-阿维菌丁B1（IC）的商业名称50：0.8–2μM）（图​（图2B，2B型，补充图S3）。同样，来自制药厂的伊维菌素及其商业形式Stromectol™对BrdU掺入也表现出类似的抑制作用在体外在两个原发性人脑胶质母细胞瘤和两个人黑色素瘤细胞系中与结肠癌细胞进行比较（图​（图2B，2B型，补充图S3）。

鉴于阿维菌素B1和伊维菌素是混合物，我们测试了两种商用单分子阿维菌素A1a衍生物多拉菌素和色拉菌素，以探索纯大环化合物的活性。多拉菌素（25-环己基-5-O-二甲基-25-de（1-甲基丙基）阿维菌素A1a）和色拉菌素2A和B，补充图S3）在兽医中广泛用作抗寄生虫药物（诺兰和洛克，2012). 多拉菌素在减少各种人类结肠癌细胞（IC）增殖方面与伊维菌素一样有效50：0.6-2.8μM；图​图2B，2B型，补充图S3）。相比之下，在10μM的初级筛选中被评为有毒的Selametin的效力提高了十倍，显示出纳米溴化铀掺入IC50s（0.08–0.14μM，图​图2B，2B型，补充图S3）。在平行测试中，米尔贝霉素大环内酯家族成员莫西捷宁也显示出与伊维菌素相当的抗增殖活性（图​（图2B，2B型，补充图S3）。然而，并不是所有的大环内酯都表现出这样的活性，例如Bryostatin，一种遥远的大环内酯，在很大程度上是无效的（在2.5和5μM时，DLD1细胞中BrdU掺入率分别为90%和88%，而对照组则为90%）。

伊维菌素和Selametin诱导细胞凋亡

伊维菌素和色拉菌素（图​（图2A）2A） 考虑到EMEA和FDA批准的第一种和高效的在体外以及兽医广泛使用第二种药物。药物治疗48小时后，通过免疫组织化学方法将活化的Caspase3用作细胞凋亡的标志物。塞拉菌素和伊维菌素诱导激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的数量增加了七倍+两种原代（CC14和CC36）和两种细胞系（DLD1和Ls174T）结肠癌细胞类型（图​（图2C）。2C） ●●●●。所有变化都是有意义的(P（P）<0.05），但DLD1、CC14和CC36中的0.1μM Selametin除外，且呈浓度和细胞类型依赖性，在含有2.5μM伊维菌素的DLD1细胞中检测到最强的影响（图​（图22C） ●●●●。

伊维菌素和Selamictin抑制阳性直接WNT-TCF靶标的表达

在开始治疗12小时后进行基因表达分析，以检测早期反应。重要的是，这两种治疗都抑制了WNT-TCF直接阳性靶点AXIN2型,LGR5级，以及ASCL2公司在DLD1和Ls174T结肠癌细胞中，尽管它们对cMYC公司（图​（图2D）。2D） ●●●●。WNT-TCF信号的单个成分在不同细胞中的水平预计存在微小差异（Herbst等,2014). 此外，这两种治疗也提高了第21页，细胞周期阻滞剂。这加上发现“管家”基因的表达TBP（待定）和HMBS公司用于标准化的未受影响，表明对转录没有一般毒性作用。

伊维菌素、多拉菌素、莫西菌素和Bryostatin对结肠癌细胞TCF靶点作用的比较

用不同的大环内酯（见上文）治疗后观察到的增殖抑制，提出了它们在结肠癌细胞中阻断TCF反应的相对能力的问题。TCF目标分析AXIN2，LGR5，以及第21页在Ls174T细胞中，伊维菌素、多拉菌素和莫西菌素的效力相等（图​（图2E）。2E） ●●●●。远端相关的大环内酯Bryostatin不活跃（图​（图2E）。2E） ●●●●。在初级CC14细胞中，伊维菌素对AXIN2型和LGR5级和最强的激活第21页，其次是Doramictin和Moxidectin，均为相同浓度（图​（图2E）。2E） ●●●●。TCF目标分析(图2因此，D和E）确定了进一步研究的伊维菌素和色拉菌素的选择。

伊维菌素和色拉菌素抑制结肠癌干细胞克隆性自我更新

肠干细胞基因表达的强烈下调ASCL2公司和LGR5级（范德弗利尔等,2009; 舍佩尔斯等,2012; 朱等,2012年b)伊维菌素和色拉菌素（图​（图2D）2D） 提出了这些药物可能影响WNT-TCF依赖性结肠癌干细胞行为的可能性。因此，我们测试了这些药物对抗癌干细胞驱动的克隆形成球体的能力在体外它测量癌症干细胞自我更新并产生其他后代的能力。用伊维菌素（1–2.5μM）或Selametin（0.01–0.1μM）预处理2D培养中DLD1、CC14和Ls174T附着细胞（图​（图3A）三A） 与对照组相比，随后克隆漂浮球体的频率分别减少了73%和43%，而不影响球体的大小（图​（图3B–E）。三B–E）。虽然该试验测试了伊维菌素在2D培养中对肿瘤干细胞自我更新的抑制作用，从而产生3D球体，但它并没有直接解决球体生长，即在3D培养中发现的肿瘤干细胞的自我更新或衍生非干细胞的增殖。

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伊维菌素和Selamictin预处理抑制结肠癌干细胞在克隆球体试验中的自我更新

结肠癌干细胞自我更新预处理和评估的工作流程在体外克隆试验。请注意，在这种设置中，细胞在被激发生成人类结肠癌细胞的漂浮克隆球状体（结肠球状体）之前被处理。

B–D（B，D）DLD1和Ls174T人结肠癌细胞系以及原代CC14人结肠癌癌细胞经二甲基亚砜或不同浓度的伊维菌素（B）或色拉菌素（D）处理后，每96个平板的结肠球体数量直方图，如（A）所示。柱显示了三个重复实验的平均值，每个实验有三个平板。DMSO处理的细胞显示为对照。（C） 14天后结肠球体的典型图像（见A）。每个面板对应图像正上方的处理。比例尺=100μM。

E在所述条件下从2D药物预处理细胞（初级克隆）中获得的Ls174T结肠癌细胞球体数量的直方图，并在使用初级克隆球体作为起始材料进行第二次克隆形成分析后获得。

数据信息：误差线=s.e.m.概率(P（P）)值来自于双尾t吨-测试。

为了研究伊维菌素也像在2D培养物中一样影响3D球体增殖的可能性，在克隆球体生长开始时添加该药物，以便在球体形成过程中存在。在第二次试验中，伊维菌素以剂量依赖性的方式降低了球体频率（补充图S4）。将这两种不同的检测结果结合起来，数据表明伊维菌素和塞拉菌素影响克隆发生事件的频率在体外以及由此产生的克隆球体的生长。这些结果表明对肿瘤及其肿瘤干细胞都有作用。事实上，对Ls174T中主要与次要克隆形成事件的分析表明，伊维菌素预处理仅影响主要克隆，而对次要事件的影响与药物作用时间相去甚远（图​（图3F）。三F） ●●●●。这一结果也表明，药物没有长期的不良反应。

与非克隆形成细胞（例如Varnat）相比，具有克隆形成球体能力的结肠癌细胞通常表达高水平的CD133（AC133）表位等,2009). CC14 CD133的定量+用有限的胰蛋白酶或干细胞前Accutase处理分离2D培养物后，通过磁激活细胞分选的细胞显示，对照组与（2.5和5μM）伊维菌素处理的细胞之间没有差异（7%对6.3%；P（P） > 0.05). 因此，伊维菌素处理可分离CD133表达和球形克隆原性。

伊维菌素选择性抑制TCF依赖的人结肠癌异种移植瘤生长体内

癌症和人类异种移植的遗传模型都为人类疾病建模提供了非常有价值的工具（Richmond&Su，2008). 然而，由于我们试图测试伊维菌素对人类肿瘤细胞的影响，所以我们选择进行异种移植实验。

WNT-TCF信号通路对人结肠癌细胞增殖有一般要求在体外（例如，van de Wetering等,2002; 瓦尔纳特等,2010)，但事实并非如此体内我们已经证明，通过人类结肠癌细胞和小鼠原代异种移植物（包括移植的Ls174T细胞和原代CC14、CC36细胞产生的肿瘤）中dnTCF4的表达阻断WNT-TCF活性通常不会导致生长停滞或细胞死亡，DLD1细胞除外（Varnat等,2010). 因此，我们在裸小鼠中使用DLD1与CC14皮下异种移植物作为伊维菌素活性和特异性的严格差异测试体内我们推断，如果这种药物现象复制了人类上皮癌细胞中dnTCF对WNT-TCF反应的基因阻断，它应该会阻止体内-dnTCF-敏感的DLD1肿瘤，但不是体内-dnTCF-不敏感的CC14异种移植物。

与仅注射环糊精载体的小鼠异种移植同胞细胞相比，肿瘤形成后每日腹腔注射10 mg/kg的环糊精结合伊维菌素抑制DLD1肿瘤生长（图​（图4A）。4A级). 至关重要的是，伊维菌素的抑瘤作用与我们的基因基准dnTCF4的抑瘤效果相同（图​（图4A）。4A） ●●●●。此外，伊维菌素不影响体内-dnTCF4不敏感的CC14肿瘤（图​（图4B）。4B） ●●●●。注射的小鼠没有副作用，也没有伊维菌素治疗。使用商用临床级伊维菌素Stromectol™治疗也有积极效果（补充图S5）。然而，当皮下异种移植物较大（>100 mm）时，开始治疗时，DLD1肿瘤的抑制作用取决于大小三)通过IP（未显示）对伊维菌素治疗产生不良反应（8/9），可能是由于药物渗透无效。

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伊维菌素特异性阻断TCF依赖性肿瘤生长体内

绘制数天肿瘤大小的肿瘤生长曲线。在肉眼检测到肿瘤后（注射后9–19天，视细胞类型而定），通过IP注射环糊精结合伊维菌素或环糊精载体单独治疗裸鼠人结肠癌（DLD1、CC14、HT29）细胞的皮下异种移植。将异种移植小鼠随机分为实验组和对照组，并进行治疗。箭头表示治疗的开始。小鼠每天注射10 mg/kg的IP。

  1. 伊维菌素的抑制作用及其模拟dnTCF对体内-TCF-依赖性DLD1异种移植物。
  2. 伊维菌素缺乏活性体内-TCF-非依赖性CC14异种移植物（见Varnat等,2010).
  3. 伊维菌素对结肠癌HT29移植瘤的抑制作用。
  4. 基因表达热图显示为内务处理基因归一化后实验与对照的比率，通过RT-qPCR测定，揭示了伊维菌素对HT29细胞WNT-TCF靶点的抑制。右侧面板：免疫印迹显示伊维菌素处理HT29细胞后细胞周期蛋白D1蛋白水平受到抑制。显示了每个条件下的控制GAPDH水平。CYCLIND1和GAPDH面板来自相同的Western印迹。

数据信息：错误栏=s.e.m。n个=每种疾病的肿瘤数量。P（P）-值来自t吨-测试。

要扩展体内第二种WNT-依赖性结肠癌类型的数据，我们使用HT29，它在APC中具有与DLD1细胞相似的截断。将HT29细胞皮下注射到裸小鼠的侧翼产生肿瘤，伊维菌素治疗抑制了肿瘤的生长（图​（图4C）。4C） ●●●●。此外，HT29细胞对伊维菌素治疗的TCF靶基因调控的总体模式与DLD1细胞中检测到的模式大体相似（图​（图2D2D和​和44D） ●●●●。

伊维菌素抑制肺癌异种移植瘤生长体内

除结肠癌外，WNT-TCF信号传导还与许多其他肿瘤类型有关，包括晚期非小细胞肺癌（Nguyen等,2009; 帕切科-皮内多等,2011). 因此，我们使用H358人转移性肺细支气管肺泡癌细胞来测试在与结肠癌细胞相同剂量下对伊维菌素的反应。预先建立的H358肿瘤对伊维菌素有反应，表现出50%的生长抑制（补充图S5）。一直以来，伊维菌素治疗抑制了肺癌WNT-TCF信号，该信号包括直接靶点AXIN2型,LEF1，索x4，以及循环1（作为ASCL2公司和LGR5级在这些细胞中不表达）并增强第21页标高（补充图S5）。伊维菌素还降低了HT29和H358肿瘤细胞中CYCLIN D1（TCF直接靶点和癌基因）的蛋白水平（图​（图4D，4天，补充图S5）。

直接激活TCF可缓解低剂量伊维菌素和Selametin的影响

为了进一步研究伊维菌素和Selamictin对WNT-TCF通路的特异性，我们试图通过TCF直接增强TCF功能来挽救它们在结肠癌细胞中的作用第16版TCF DNA结合域与强VP16病毒转录激活因子（Kim等,2000)以WNT和β-CATENIN独立方式起作用（补充图S6）。TCF公司第16版-表达细胞对低浓度伊维菌素或色拉菌素不敏感在体外在BrdU掺入试验中，与DLD1、Ls174T和原代TNM3 CC36细胞（8）中的对照组相比，在0.5–1μM下观察到伊维菌素和0.05–0.1μM下发现塞拉菌素的完全挽救（图​（图5A，5A级，补充图S6）。在较高浓度下，这些药物可能会涉及其他机制（见讨论）。

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优势活性TCF阻断细胞增殖、WNT-TCF通路反应和肿瘤生长的上位性补救
  1. 集成电路50伊维菌素（顶行）或塞拉菌素（底行）与人结肠癌细胞系DLD1和原代Ls174T结肠癌细胞的BrdU掺入曲线。在每个图中，都有控制（空向量）和TCF的响应叠加第16版表达不同药物浓度的细胞。蓝色箭头突出显示IC中的移位50值。请注意，在低微摩尔浓度下，伊维菌素和纳摩尔浓度下塞拉菌素的完全解救。误差线=s.e.m.关于CC36的结果，参见补充图S6。
  2. WNT-TCF靶点表达的热图显示为药物治疗TCF值的比值第16版经过基因归一化处理后，DLD1和Ls174T细胞的细胞数均高于药物处理的空载体细胞。红色：增强1.5倍或以上。深蓝色：压制在0.6或以下。
  3. Western blot显示通过伊维菌素（上部面板）或Selametin（下部面板）治疗以及TCF对其的救援，细胞周期蛋白D1蛋白水平受到抑制第16版表达式。看家基因GAPDH的水平显示为对照。
  4. 体内通过表达显性活性TCF增强TCF功能，挽救伊维菌素对DLD1异种移植生长的抑制作用第16版箭头表示治疗开始。

数据信息：错误栏=s.e.m。n个=每种疾病的肿瘤数量。P（P）-值来自t吨-测试。

TCF公司第16版表达导致结肠癌细胞中WNT-TCF靶基因的阳性水平显著升高，如伊维菌素治疗的TCF中的比率所示第16页与伊维菌素处理的对照细胞相比（图​（图5B）。5B） ●●●●。低浓度的伊维菌素（1μM）或色拉菌素（0.1μM）也分别将正常水平的CYCLIN D1蛋白抑制了90%和50%，在DMSO处理的对照组中检测到，这种抑制通过TCF的表达完全逆转第16版（图​（图55C） ●●●●。

重要的是，TCF的持续表达第16版通过DLD1细胞中的整合慢载体，伊维菌素挽救了预先建立的异种移植物的生长阻滞（图​（图55D） ●●●●。

伊维菌素和Selamectin降低β-CATENIN的C末端磷酸化物水平和直接TCF靶点CYCLIN D1的水平

由于伊维菌素抑制由APC敏感性N'Δβ-CATENIN驱动的TCF报告活性，我们试图测试该药物是否会影响β-CATENIN/TCF的下游激活，重点是β-CATEN本身的C末端磷酸化，这是TCF复合物全转录活性（Hino）所必需的等,2005; 方等,2007; 赵等,2010). DLD1和Ls174T结肠癌细胞的治疗在体外与伊维菌素合用后，β-阳离子的两种C末端磷酸形式（磷酸-Ser552和磷酸-Ser675）的水平受到剂量依赖性抑制，并抑制细胞周期蛋白D1（图​（图6A、，6A级，补充图S7）。GAPDH和总β-CATENIN水平没有变化（图​（图6A、，6A级，补充图S7）。

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伊维菌素和Selamectin对β-CATENIN和CYCLIN D1的C末端磷酸形式的抑制及其对磷脂酶的抑制

DLD1人结肠癌细胞提取物的Western blot显示，伊维菌素在1和2.5μM浓度下，β-CATENIN（P-Ser552和P-Ser675）的C末端磷酸形式以及TCF靶细胞周期蛋白D1的水平的浓度依赖性丢失。GAPDH和总β-CATENIN水平显示为对照。

B在肺癌H358细胞中也观察到伊维菌素（5μM）对CYCLIN D1水平的抑制作用，这里将其用作最终TCF输出的标志，这可以通过冈田酸（15 nM）治疗来缓解。

C–F蛋白质印迹（C，E）及其定量（D，F）显示，OA（15 nM）但FK（10μM）治疗对伊维菌素（5μM）（C，D）和塞拉维菌素（0.5μM）（E，F）的抑制作用无效。GAPDH水平显示为所有面板中的加载控制。所有治疗均持续12小时，以突出早期反应。

G对照CC14细胞（top）和用伊维菌素（5μM）处理6h的细胞中总β-CATENIN蛋白的亚细胞定位。面板显示了β-CATENIN共焦显微镜图像（右），DAPI突出细胞核（中央）和合并图像（左）。（G）中所有面板的比例尺=15μm。

C末端非磷酸化β-CATENIN向磷酸化版本的过渡图，该磷酸化版本与TCF和共因子一起激活靶基因的转录，尤其包括CYCLIN D1的转录。磷酸化由蛋白激酶如蛋白激酶A（PKA）促进，蛋白激酶A被Forskolin（FK）激活，磷酸酶如PP2A被冈田酸（OA）抑制。因此，伊维菌素和色拉菌素的作用需要活性磷酸酶。

数据信息：错误栏=s.e.m。

伊维菌素和Selamictin对CYCLIN D1水平的抑制活性需要丝氨酸蛋白磷酸酶的功能

β水平降低-CATENIN磷酸形式原则上可能是由于磷酸化C-末端位点的激酶受到抑制或磷酸化这些位点的磷酸酶过度活化所致。因此，为了测试伊维菌素在促进C末端β-CATENIN磷酸化丢失方面的作用，我们首先分析了冈田酸（OA）可能的解救作用，冈田酸阻断丝氨酸蛋白磷酸酶PP2A和PP1的活性。正如预期的那样，OA治疗导致β-CATENIN C末端磷酸化物和TCF靶向CYCLIN D1水平升高（补充图S8）。然而，伊维菌素在降低OA增强表达方面无效（图​（图6C6厘米和D，补充图S8）​（图6A、C6A、 C和D）。在肺癌H358细胞中也获得了CYCLIN D1的类似结果（图​（图6B）。6B） ●●●●。这些结果表明，伊维菌素需要活性PP2A/PP1对WNT-TCF途径发挥抑制作用。

为了补充这些发现，我们试图通过激活内源性蛋白激酶A来增强激酶活性，从而超激活WNT-TCF途径，该激酶在C末端磷酸化β-CATENIN（Hino等,2005)，含毛喉素（FK）。FK治疗无法挽救伊维菌素对β-CATENIN和CYCLIN D1的C末端磷酸形式水平的抑制作用（图​（图6C6C和D），表明与磷酸酶抑制引起的过度磷酸化不同，通过增强激酶激活引起的过度磷酸化受到伊维菌素的抑制。

最后，这些作用被Selamectin完全复制，OA而非FK挽救了其作用（图​（图6E6E和F），表明这两种大环内酯对WNT-TCF信号的作用模式相似（图​（图66H） ●●●●。

伊维菌素处理后β-CATENIN的定位

为了进一步测试伊维菌素对β-CATENIN的作用，我们通过免疫细胞化学绘制了其亚细胞分布图。对多个样本的分析显示，在处理6小时后，对照组（DMSO）和伊维菌素（5μM）处理的CC14细胞中的分布相似（图​（图6G）。6G） ●●●●。在这两种情况下都检测到了膜、细胞质和细胞核信号。

讨论

这里我们报告伊维菌素（坎贝尔等,1983)已批准用于人类的非专利药物和相关大环内酯具有WNT-TCF通路反应阻断和抗癌活性。虽然影响WNT-TCF应答的伊维菌素和色拉菌素的确切分子靶点尚待确定，但目前的研究结果表明，这些药物阻断WNT-TCC通路应答，可能在β-CATENI/TCF功能，影响β-CATENIN磷酸化状态。

阿维菌素、多拉菌素和莫西菌素的抗增殖活性与伊维菌素和塞拉菌素的类似，表明阿维菌汀和米尔贝霉素家族的大环内酯具有共同的性质和结构特征（例如Awasthi等,2012)这可能是伊维菌素和色拉菌素抗WNT-TCF活性的基础。此外，塞拉菌素强大的WNT-TCF反应抑制活性强烈证明，通过发酵制备的大环内酯制剂（如伊维菌素）的活性不是由于次要或残留成分，因为塞拉菌肽是一种半合成的单一复合药物。Selamictin的效力是原来的十倍，这一发现不仅需要进行临床测试，还需要进一步探索大环内酯的化学空间。

伊维菌素具有众所周知的抗寄生虫活性，通过解除氯离子通道的调节而介导，导致瘫痪和死亡（Hibbs&Goauux，2011; Lynagh&Lynch，2012). 伊维菌素对液体肿瘤细胞的毒性以及阿维菌素B1对经典化疗药物（Drinyaev等,2004; Sharmeen公司等,2010). 相反，我们记录的阻断WNT-TCF反应的特异性，在低微摩尔剂量下伊维菌素和低纳米摩尔剂量下塞拉菌素，表明阻断WNT-TCF反应和解除氯离子通道调控是不同的作用模式。为了支持这一点，WNT-TCF反应阻断活性的检测浓度比报道的氯离子解除管制浓度低10倍（本研究；Drinyaev等,2004). 该发现表明，莫西丁胶在控制肠道线虫（Fatima）方面比伊维菌素更有效等,2007; 克林戈利等,2009)但对人类癌细胞的活性类似或较低（本研究），进一步支持了大环内酯对癌细胞和寄生虫的不同作用模式。我们描述的伊维菌素和Selamictin的特异性和选择性也与这些大环内酯通过阴离子选择性Cys环通道的改变而普遍存在的作用不一致（Hibbs&Gouaux，2011; Lynagh&Lynch，2012)或Farnesyl X受体（Jin等,2013). 伊维菌素可以靶向不同分子的观点得到了进一步的支持，因为它对黄病毒解旋酶活性的抑制仅存在于感染细胞中的病毒复制过程中（Mastrangelo等,2012;). 因此，关键是找到一种剂量和环境，使伊维菌素的使用对患者产生有益的影响，并将我们的结果与小鼠异种移植的结果相比较。

细胞毒性出现的剂量大于阻断TCF反应和诱导细胞凋亡所需的剂量（大于10μM的剂量持续12小时或更长时间，或大于5μM的浓度持续48小时或更长）。与氯离子通道放松调节有关的一般毒性被认为是伊维菌素对液体肿瘤细胞高微摩尔毒性的基础在体外（德里亚耶夫等,2004; Sharmeen公司等,2010)并且可能使WNT-TCF依赖性脑疾病的治疗复杂化，因为伊维菌素可以影响谷氨酸门控和其他Cys-loop离子氯通道（Kokoz等,1999; Hibbs&Gouaux，2011; Lynagh&Lynch，2012). 配体门控氯通道存在于哺乳动物的中枢神经系统中，通常通过血脑屏障（Schinkel等,1994)，但这在脑瘤中经常被打破。

我们的数据表明WNT-β受到抑制-伊维菌素、色拉菌素和相关大环内酯对CATEN/TCF转录的反应。这一结论是基于（i）阿维菌素B1抑制N-末端突变体（APC不敏感）激活WNT-TCF报告基因活性的能力-在我们的屏幕中检测到的CATENIN；（ii）阿维菌素B1、伊维菌素、多拉菌素、莫西菌素和塞拉菌素通过dnTCF平行调节WNT-TCF靶点的能力；（iii）发现低剂量伊维菌素和Selametin对WNT-TCF特异性反应的阻断被组成活性TCF逆转；（iv）β的关键C末端磷酸亚型的抑制-伊维菌素和色拉菌素对TCF靶点和阳性细胞周期调节因子CYCLIN D1的抑制作用；（v） 对体内-依赖TCF，但不依赖体内-异种移植物中伊维菌素诱导的TCF-非依赖性癌细胞。

β的磷酸异构体分析-在PP2A/PP1蛋白磷酸酶阻断条件下用伊维菌素或塞拉菌素治疗后的CATENIN表明，这些药物可能通过直接或间接增强参与P-Ser552/P-Ser675去磷酸化的磷酸酶活性发挥作用。这种效应有助于解释伊维菌素处理细胞的表型，因为P-Ser552-和P-Ser675-β-CATENIN与TCF因子协同显示出增强的转录活性，并且对结肠癌细胞（Hino）的WNT信号传导至关重要等,2005; 牛磺酸等,2006; 方等,2007; 朱等,2012年a). PP2A参与的支持还来自于其Bα（PR55α）亚单位需要下调β-Ser552和P-Ser675 C末端磷酸形式的水平-结肠癌细胞中的CATENI（张等,2009). 因此，PP2A及其多亚单位的作用可能是复杂的，因为它还可以通过抑制N末端β-CATENIN磷酸化从而抑制β-CATENIN破坏（Seeling等,1999). 然而，在缺乏APC破坏复合物功能（例如缺乏APC）的癌细胞中，通过伊维菌素治疗增强PP2A功能的总体效果预计是通路沉默（图​（图66H） ●●●●。

上述伊维菌素作用的阐明得益于大多数人结肠癌细胞的测试在体外在单层中是依赖于TCF的（例如，van de Wetering等,2002; 瓦尔纳特等,2010)，从而允许在体外屏幕。有趣的是，癌细胞在培养中形成3D球体的能力以及这些球体的生长也依赖于WNT-TCF（Kanwar等,2010)他们也受到伊维菌素治疗的影响。这些结果以及结肠癌干细胞标记物表达的减少ASCL2型和LGR5级（例如，美国好施集团等,2013; 齐斯金等,2013)提高伊维菌素、色拉菌素和相关大环内酯对TCF依赖性肿瘤干细胞的抑制作用的可能性。

体内，我们之前的研究表明，在异种移植中检测的大多数结肠癌是TCF非依赖性的。例如，Ls174T和初级CC14细胞依赖TCF在体外但在异种移植中变得不依赖TCF体内（反之亦然）（Varnat等,2010). 相反，DLD1仍依赖TCF在体外和体内（瓦纳特等,2010). 尽管可能涉及DNA甲基化，但这些变化的基础仍不清楚（de Sousa等,2011). 尽管有这种机制，但这些差异为伊维菌素的特异性提供了关键测试体内如果伊维菌素是特异性的，它应该只阻止TCF依赖的肿瘤生长。事实上，DLD1和CC14异种移植物分别对伊维菌素治疗的敏感性和不敏感性，以及对伊维菌素作用的脱敏体内通过组成活性TCF提供证据证明该药物在人类癌症中阻断激活的WNT-TCF通路的特异性。

伊维菌素具有良好的安全性，因为体内-对dnTCF敏感的肿瘤异种移植物对伊维菌素治疗有反应，我们在伊维菌汀治疗的小鼠中未检测到所用剂量的副作用。尽管高剂量可能开始表现出非特异性毒性，但之前的研究表明，临床相关剂量的系统治疗对人类的副作用是罕见的（Yang，2012)在接触孕妇后未观察到出生缺陷（Pacqué等,1990)而且这种药物不会越过血脑屏障（科科兹等,1999). 类似地，只有变异狗ABCB1型导致血脑屏障破裂的（MDR1）等位基因显示伊维菌素神经毒性（米利等,2001; 热霍夫斯基等,2012).

口服伊维菌素已经被数百万人用于对抗多种寄生虫感染，尤其是通过麦迪赞捐献计划对抗河盲症（Thylefors，2008). 根据我们目前的数据，该药物可以作为WNT-TCF阻滞剂用于治疗不同疾病，包括多种依赖WNT-TCC的人类癌症类型。在这种情况下，这可能需要一种组合方法，将标准化疗药物作为去积垢剂。适应症可能包括治疗无法治愈的β-CATENIN/TCF依赖性晚期和转移性人类肺、结肠、子宫内膜和其他器官肿瘤。伊维菌素、色拉菌素或相关大环内酯也可作为WNT-TCF依赖性皮肤病变和肿瘤（如基底细胞癌）的外用药物。此外，它们也可能用作常规预防剂，例如对家族性息肉病患者的新生TCF依赖性肠道肿瘤和一般老龄化人群的新生散发性结肠肿瘤有用。伊维菌素和其他疏水性大环内酯与增强组织渗透性的制剂的配方可能会提高其功效。

材料和方法

细胞培养

如前所述，培养人结肠癌CC14和CC36原代细胞以及Ls174T和HT29细胞系（Varnat等,2009,2010). 结肠癌DLD1和肺非小细胞支气管肺泡癌H358细胞在DMEM-F12或含有10%FBS的RPMI 1640中作为附着的2D层培养。293T细胞在含有10%FBS的DMEM中培养。药物治疗时，细胞在2%FBS中电镀，第二天治疗12–48小时。GBM原代细胞按Zbinden中所述进行培养等(2010). 按照ATCC的描述培养U251胶质瘤和SKMel2黑色素瘤细胞系。

初级筛选

在293T细胞中进行荧光素酶报告物分析，以确定能够使用融合到萤火虫荧光素素酶报告体的TCF结合位点来降低TCF驱动基因表达的化合物。通过转染N’Δβ-CATENIN作用于内源性TCF因子来驱动激活。在所有病例中，HSV-TK表达质粒共同转染产生的Renilla荧光素酶活性产生的内部对照。用磷酸钙对293T细胞进行转染，并将其以5000个/孔的密度镀入96个板中。每一次转染都将一个组成活性的β-CATENIN质粒作为效应器，一个TCF-结合位点萤火虫荧光素酶质粒作为报告者，一个HSV-TK Renilla荧光素酶质粒作为对照。化合物处理12小时后收集细胞。二级报告者分析至少重复三次。

药物

将阿维菌素（31732，Fluka）、伊维菌素（Fagron Iberica和Sigma#I8898）、多阿维菌素（33993，Fluka）、Selamictin（32476，Sigma）、Stromectol™（Merck）和Moxidectin（33746，Sigma）在100%二甲基亚砜或乙醇中稀释，并在0.01–10μM下用于在体外分析。冈田酸（OA，Enzo Life Science）的用量为1–15 nM。

BrdU公司

将结肠原代细胞培养物和细胞系置于含有2%FBS的培养基中，并用不同浓度的药物处理48小时。用BrdU（10 mg/ml）进行15′脉冲后，将细胞固定在4%PFA中，在2N HCl中孵育15′，用0.1 M硼酸中和10′，在PBS-10%HINGS中封闭10′，并用抗BrdU抗体标记（1:5000，爱荷华大学杂交瘤库）。用罗丹明偶联的抗鼠二级抗体（1:500，Invitrogen分子探针）显示信号，并用DAPI（Sigma）进行复染。每个条件下至少有10个字段被量化。

细胞凋亡测定

将结肠癌细胞在30%的汇合处电镀，并用不同浓度的药物处理48小时。处理后，细胞在4%PFA中固定2分钟，在10%HINGS中封闭1小时。使用兔抗裂解Caspase3抗体（1:200，4°C过夜；细胞信号）和Cy3标记的二级抗体（1:500，RT时1小时；Jackson ImmunoResearch）通过免疫荧光法评估细胞凋亡。用DAPI（1:10000，Sigma）对细胞进行复染。针对每种情况，每个平板至少量化10个字段。

定量逆转录聚合酶链式反应

如前所述进行RNA提取、反转录和qPCR（Varnat等,2009).

qPCR引物序列如下（5′->3′）：

LGR5-F型GGAGCATTCACTGGCCTTTA公司
>LGR5-R型CTGGACGGATTTCTGTTA公司
第21-F页GACTCTCAGGGTCGAAACG公司
P21-R基因AAGATGTAGAGCGGGCCTTT公司
AXIN2-F型CTCCTTATCGTGGGCAGT公司
AXIN2-R型CCAACTCCAGCTTTCAGCTT
EFNB1-F型AAGACCTGGAGCCCGTAT公司
EFNB1-R型GGGTCGAGAACTGTGCTAC公司
EPHB2-F型ATGCGGAAGGTGATGTA公司
EPHB2-R型CCTTGAAAGTCCCAGATGGA公司
EPHB3-F型GATTGGCTGAAGTACCAGACC
EPHB3-R型CAGAAACTGCAGACTCCTTGG公司
OLFM4-F型行动
OLFM4-R型CGACAGGGGTTTTTGATCT公司
SOX4-F标准AAACCAACATGCCGAGAAC公司
SOX4-R标准GTTCATGGGTCGCTTGATGT
ASCL2-F系列GCGTTCCGCCTACTCGT公司
ASCL2-R型GGCTTCTCGGGGCTGAG公司
TBP-F（待定）TGCACAGGAGCCAAGTGAA公司
TBP-R（待定）CACATCACAGCTCCCCACCA公司
HMBS-F型AAGTGCGAGCCAAGGACCAG公司
HMBS-R型TTACGAGCAGTGATGCCTACCAAC公司
cMYC-F公司TGGTCTTCCCCTACCCTCT公司
cMYC-R公司GATCGACTCTGACCTTT公司

体外克隆测定和CD133分类

用不同浓度的伊维菌素或Selamectin处理粘附的结肠癌细胞，清洗、提起并以1个细胞/孔的速度将其置于96周的非粘附板中，放置在不含药物的结肠球形培养基（DMEM-F12补充B27和10 ng/ml EGF）中，并生长14天。然后使用倒置蔡司光学显微镜目测球体数量。对于二次克隆形成分析，将初级球体分离并以1个细胞/孔的速度重新放置在96个培养皿中，并如上所述进行培养。每个实验至少重复三次。另一种方法是，将未经处理的细胞进行电镀，并在96周的板中使用药物进行处理，随后对球体的形成进行评分。CD133 MACS（Miltenyi Biotech）如前所述（Varnat等,2009,2010)使用有限的胰蛋白酶或StemProAccutase（Gibco LifeTech）进行细胞分离。

蛋白质斑点

将细胞置于含有2%FBS的培养基中，并用不同浓度的伊维菌素或塞拉菌素处理12 h。蛋白裂解物在RIPA缓冲液中。将10-20μg蛋白质加载到12%聚丙烯酰胺凝胶上，并将蛋白质转移到硝化纤维膜（Hybond）上，如前所述，用一级和二级抗体对其进行探测。使用ECL系统（GE Healthcare）和胶片显示信号。ImageJ用于量化。在TBS-1%Tween-20中清洗并控制信号损失后，依次重新制备膜。使用了以下主要抗体：抗GAPDH（1:6000，RT时1小时，2118细胞信号传导）、抗cyclinD1（1:100，RT时1h，Ab-3癌基因研究）、抗Pser552β-CATENIN（1:1000，RT时一小时，9566细胞信号传导，和抗总β-CATENIN（RT时1:1000，1h，8480细胞信号）。作为次级抗体，HRP-偶联抗兔或抗鼠（1:6000，Promega）在RT培养1小时。

小鼠异种移植物

5 × 105将对照组或慢载体感染的癌细胞皮下注射到6-8周龄雌性NMRI裸鼠的两侧。肿瘤形成后，通过每天腹腔注射10 mg/kg的剂量，用环糊精载体单独或伊维菌素（或Stromectol™）与环糊精（45%）结合治疗小鼠。每隔2–3天测量肿瘤体积。

排序空气污染指数和β-阳离子常见突变区域

使用来自原发性结肠癌细胞（CC14和CC36）或细胞系（DLD1和Ls174T）的1毫微克基因组DNA，使用Phusion HF DNA聚合酶（BioLabs）进行PCR。设计特异性引物来扩增空气污染指数和CTNNB1公司(β-阳离子)基因。的突变簇区（MCR）空气污染指数用两对引物进行扩增：（1）MCR1FWD 5′-GATACCAATATGTTTTC-3′和MCR1REV 5′-GGAAGATGCTTAT-3′，（2）MCR2FWD 5'-GTGGACCAGTGGAATG-3′和MCR2REV 5’-TCTGAATCTAATAGGTC-3′。的引物CTNNB1公司具体如下：CTNNB1公司FWD 5′-CAATGGGTCATCACAGATTCTT-3′和CTNNB1公司修订版5′-TCTCTTTTCTTCACCACAACATTT-3′。

论文解释道

问题

WNT-TCF细胞间信号通路在许多疾病中被组成性激活，包括肠癌、皮肤癌、肺癌、子宫内膜癌和脑癌。发现作为通路阻断剂的小分子已经引起了很多治疗兴趣，但到目前为止，临床上还没有WNT-TCF阻断剂，部分原因是开发新药的时间和成本。

结果

在这里，我们使用一组临床批准的药物进行了小分子筛的重新定位。我们描述了伊维菌素和相关大环内酯（包括单组分半合成药物Selamectin）作为WNT-TCF阻滞剂在人类癌细胞中的鉴定在体外和体内Selametin的效力是伊维菌素的10倍，作用范围为纳米摩尔。低剂量的这些药物模拟显性阴性TCF的作用，其作用由激活的TCF（TCF）挽救第16版). 伊维菌素表现出极高的选择性体内抑制TCF敏感的人类肿瘤异种移植生长，在所用剂量下无明显副作用。检测到WNT-TCF阻断活性的剂量低于氯离子通道放松调节和一般细胞毒性的报告剂量，这表明针对过度激活的WNT-TCX依赖性疾病的治疗窗口。

影响

鉴于伊维菌素是一种经批准的药物，广泛用于对抗多种寄生虫感染，我们的数据表明，它还可以作为治疗WNT-TCF依赖性疾病的药物，尤其是包括几种癌症类型的疾病，并对大环内酯化学空间进行了进一步的研究。

β-CATENIN免疫组织化学

将结肠癌细胞在40%的汇合处电镀，并用5μM伊维菌素或2%二甲基亚砜处理6小时。处理后，将细胞固定在新鲜的4%PFA中2分钟。通过在10 mM柠檬酸缓冲液（10 mM枸橼酸，0.05%吐温-20，pH 6.0）中煮沸7分钟进行抗原回收。然后在RT下培养细胞30分钟，用PBS洗涤，并在RT下用1%吐温-20在PBS中渗透15分钟。在用3%的BSA封闭PBS后，在4°C下应用抗β-CATENI抗体（1:400，细胞信号）过夜。用罗丹明偶联的抗兔二级抗体（1:1000）显示信号并用DAPI（1:10000）复染。样品用蔡司LSM 510META共焦显微镜成像。每种情况分析五张独立的幻灯片。

致谢

我们感谢C.Bernal、A.Duquet、C.Seth、S.Mishra、G.Singovski和A.Cookson对手稿的讨论或评论。我们感谢K.-H.Krause（日内瓦）、P.Mehlen（里昂）和E.Martí（巴塞罗那）对小分子文库、H358细胞和TCF的友好捐赠第16版构造。CM、AM和MK分别是欧盟FP6-CAPPELLA和欧盟FP7-HEALING网络的研究员。这项工作得到了瑞士癌症联盟、瑞士国家科学基金会、欧盟CAPPELLA和HEALING计划以及美国詹姆斯·麦克唐纳基金会21的资助标准脑癌研究奖的世纪科学倡议，以及由日内瓦州教育局向ARA提供的资金。

作者贡献

ARA、CM、AM、MK和ALT设计并执行了实验。ARA写了这篇论文。所有作者都对结果的解释和呈现以及论文的改进做出了贡献。日内瓦大学（Mas and Ruiz i Altaba，WO2012150543）已就伊维菌素和相关大环内酯的使用提出专利申请。

利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

支持信息

补充信息本文在线阅读：http://embomolmed.embopress.org

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  • Anastas JN，Moon RT.WNT信号通路作为癌症的治疗靶点。Nat Rev癌症。2013;13:11–26.[公共医学][谷歌学者]
  • Awasthi A，Razzak M，Al-Kassas R，Harvey J，Garg S.所选阿维菌素衍生物的化学衍生化和稳定性概述。Chem Pharm Bull（东京）2012;60:931–944.[公共医学][谷歌学者]
  • Barker N，Clevers H.挖掘癌症治疗的Wnt途径。Nat Rev药物发现。2006;5:997–1014.[公共医学][谷歌学者]
  • Campbell WC、Fisher MH、Stapley EO、Albers-Schönberg G、Jacob TA。伊维菌素：一种有效的新型抗寄生虫剂。科学。1983;221:823–828.[公共医学][谷歌学者]
  • Clevers H，Nusse R.Wnt/β-catenin信号与疾病。单元格。2012;149:1192–1205.[公共医学][谷歌学者]
  • Cringoli G、Veneziano V、Mezzino L、Morgoglione M、Pennacchio S、Rinaldi L、Salamina V。0.1%莫西丁胶与0.08%伊维菌素对胃肠道线虫自然感染绵羊产奶量的影响。BMC兽医研究。2009;5:41. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Curtin JC，Lorenzi MV。靶向癌症干细胞Wnt信号的药物发现方法。肿瘤靶点。2010;1:563–577. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Dodge ME、Moon J、Tuladhar R、Lu J、Jacob LS、Zhang LS、Shi H、Wang X、Moro E、Mongera A等。多种化学支架支持直接抑制膜结合O-酰基转移酶豪猪。生物化学。2012;287:23246–23254. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 弗吉尼亚州德林亚耶夫、弗吉尼亚州莫辛、克鲁格利亚克EB、诺维克TS、斯特利纳TS、内华达州埃尔马科娃、库布利克LN、莱维曼M、沙波什尼科娃VV、科斯托夫YN。阿维菌素的抗肿瘤作用。欧洲药理学杂志。2004;501:19–23.[公共医学][谷歌学者]
  • Fang D，Hawke D，Zheng Y，Xia Y，Meisenhelder J，Nika H，Mills GB，Kobayashi R，Hunter T，Lu Z。AKT对β-catenin的磷酸化促进了β-catentin的转录活性。生物化学杂志。2007;282:11221–11229. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Fatima Z、Asharaf M、Khan MS、Khan MA、Shahzad K、Younus M。伊维菌素和莫西捷宁对马强似线虫的比较效力。国际农业兽医医学杂志。2007;1:16–20. [谷歌学者]
  • van der Flier LG、van Gijn ME、Hatzis P、Kujala P、Haegebarth A、Stage DE、Begthel H、van den Bornn M、Guryev V、Oving I等。转录因子achaete scute-like 2控制肠干细胞命运。单元格。2009;136:903–912.[公共医学][谷歌学者]
  • González P、Gonzélez FA、Ueno K.伊维菌素在人类医学中的临床应用现状概述。当前药物生物技术。2012;13:1103–1109.[公共医学][谷歌学者]
  • Hatzis P、van der Flier LG、van Driel MA、Guryev V、Nielsen F、Denissov S、Nijman IJ、Koster J、Santo EE、Welboren W等。结直肠癌细胞TCF7L2/TCF4染色质占位的全基因组模式。分子细胞生物学。2008;28:2732–2744. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Herbst A，Jurinovic V，Krebs S，Thieme SE，Blum H，Göke B，Kolligs FT。Wnt/β-catenin信号失调的结直肠癌细胞系中β-catenin靶基因的综合分析。BMC基因组学。2014;15:74. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hibbs RE，Gouaux E.阴离子选择性Cys-loop受体的活化和渗透原理。自然。2011;474:54–60. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hino S，Tanji C，Nakayama KI，Kikuchi A.环腺苷酸依赖性蛋白激酶对β-连环蛋白的磷酸化通过抑制其泛素化来稳定β-连环素。分子细胞生物学。2005;25:9063–9072. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hirsch D、Barker N、McNeil N、Hu Y、Camps J、McKinnon K、Clevers H、Ried T、Gaiser T。LGR5阳性定义了结直肠癌中的干细胞。致癌。2013;35:849–858. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Huang SM、Mishina YM、Liu S、Cheung A、Stegmeier F、Michaud GA、Charlat O、Wiellette E、Zhang Y、Wiessner S等。Tankyrase抑制稳定axin并对抗Wnt信号。自然。2009;461:614–620.[公共医学][谷歌学者]
  • Jin L，Feng X，Rong H，Pan Z，Inaba Y，Qiu L，Zheng W，Lin S，Wang R，Wang Z等。抗寄生虫药物伊维菌素是一种新型的FXR配体，可调节新陈代谢。国家公社。2013;4:1937.[公共医学][谷歌学者]
  • Kandoth C、McLellan MD、Vandin F、Ye K、Niu B、Lu C、Xie M、Zhang Q、McMichael JF、Wyczalkowski MA等。12种主要癌症类型的突变景观和意义。自然。2013;502:333–339. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kanwar SS、Yu Y、Nautiyal J、Patel BB、Majumdar AP。Wnt/beta-catenin途径调节结肠球的生长和维持。摩尔癌症。2010;9:212. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kim CH、Oda T、Itoh M、Jiang D、Artinger KB、Chandrasekharappa SC、Driever W、Chitnis AB。无头/Tcf3的抑制活性对脊椎动物头部形成至关重要。自然。2000;407:913–916. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kinzler KW，Vogelstein B.遗传性结直肠癌的教训。单元格。1996;87:159–170.[公共医学][谷歌学者]
  • Kokoz YM、Tsyganova VG、Korystova AF、Grichenko AS、Zenchenko KI、Drinyaev VA、Mosin VA、Kruglyak EB、Sterlina TS、Victorov AV。阿维菌素的选择性细胞抑制和神经毒性作用以及GABAalpha受体的激活。Biosci代表。1999;19:535–546.[公共医学][谷歌学者]
  • Lau T，Chan E，Callow M，Waaler J，Boggs J，Blake RA，Magnuson S，Sambrone A，Schutten M，Firestein R等。一种新型的tankyrase小分子抑制剂抑制APC突变驱动的结直肠癌生长。癌症研究。2013;73:3132–3144.[公共医学][谷歌学者]
  • Lepourcelet M、Chen YN、France DS、Wang H、Crews P、Peterson F、Bruseo C、Wood AW、Shivdasani RA。致癌Tcf/β-catenin蛋白复合物的小分子拮抗剂。癌细胞。2004;5:91–102.[公共医学][谷歌学者]
  • Lynagh T，Lynch JW。伊维菌素调控Cys-loop离子通道受体的分子机制。前摩尔神经科学。2012;5:60. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • MacDonald BT、Tamai K、He X.Wnt/β-catenin信号：成分、机制和疾病。开发单元。2009;17:9–26. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mastrangelo E、Pezzullo M、De Burghgraeve T、Kaptein S、Pastorino B、Dallmeier K、De Lamballerie X、Neyts J、Hanson AM、Frick DN等。伊维菌素是一种有效的黄病毒复制抑制剂，专门针对NS3解旋酶活性：旧药物的新前景。《抗菌化学杂志》。2012;67:1884–1894. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mealey KL、Bentjen SA、Gay JM、Cantor GH。牧羊犬对伊维菌素的敏感性与mdr1基因的缺失突变有关。药物遗传学。2001;11:727–733.[公共医学][谷歌学者]
  • Nguyen DX、Chiang AC、Zhang XH、Kim JY、Kris MG、Ladanii M、Gerald WL、Massague J.WNT/TCF信号通过LEF1和HOXB9介导肺腺癌转移。单元格。2009;138:51–62. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Nolan TJ和Lok JB。大环内酯用于治疗和控制小伴生动物的寄生。当前药物生物技术。2012;13:1078–1094.[公共医学][谷歌学者]
  • Orzechowski KL、Swain MD、Robl MG、Tinaza CA、Swaim HL、Jones YL、Myers MJ、Yancy HF。靶向插入突变犬ABCB1基因的基因工程小鼠服用伊维菌素的神经毒性作用。美国兽医研究所。2012;73:1477–1484.[公共医学][谷歌学者]
  • Pacheco Pinedo EC、Durham AC、Stewart KM、Goss AM、Lu MM、Demayo FJ、Morrisey EE。Wnt/β-catenin信号传导通过在肺上皮上施加胚胎远端祖细胞表型来加速小鼠肺肿瘤的发生。临床投资杂志。2011;121:1935–1945. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • PacquéM、Muñoz B、Poetschke G、Foose J、Greene BM、Taylor HR。社区分发期间因疏忽而接受伊维菌素治疗后的妊娠结局。柳叶刀。1990;336:1486–1489.[公共医学][谷歌学者]
  • Richmond A，Su Y.小鼠异种移植模型与用于人类癌症治疗的GEM模型。Dis模型机械。2008;1:78–82. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Schepers AG、Snippert HJ、Stange DE、van den Born M、van Es JH、van DE Wetering M、Clevers H。血统追踪显示小鼠肠道腺瘤中Lgr5+干细胞活性。科学。2012;337:730–735.[公共医学][谷歌学者]
  • Schinkel AH、Smit JJ、van Tellingen O、Beijnen JH、Wagenaar E、van Deemter L、Mol CA、van der Valk MA、Robanus-Maindag EC、te Riele HP等。小鼠mdr1a P-糖蛋白基因的破坏导致血脑屏障缺陷，并增加对药物的敏感性。单元格。1994;77:491–502.[公共医学][谷歌学者]
  • Seeling JM、Miller JR、Gil R、Moon RT、White R、Virshup DM。蛋白质磷酸酶2A的B56亚单位对β-catenin信号的调节。科学。1999;283:2089–2091.[公共医学][谷歌学者]
  • Sharmeen S、Skrtic M、Sukhai MA、Hurren R、Gronda M、Wang X、Fonseca SB、Sun H、Wood TE、Ward R等。抗寄生虫药伊维菌素诱导白血病细胞的氯依赖性膜超极化和细胞死亡。鲜血。2010;116:3593–3603.[公共医学][谷歌学者]
  • Shitashige M、Hirohashi S、Yamada T.Wnt在细胞核内发出信号。癌症科学。2008;99:631–637. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • de Sousa F、Melo E、Colak S、Buikhuisen J、Koster J、Cameron K、de JJ、Tuynman JB、Prasetyanti PR、Fessler E等。癌细胞相关Wnt靶基因甲基化预测结直肠癌患者预后不良。细胞干细胞。2011;9:476–485.[公共医学][谷歌学者]
  • Taurin S，Sandbo N，Qin Y，Browning D，Dulin NO.环腺苷酸依赖性蛋白激酶对β-catenin的磷酸化作用。生物化学杂志。2006;281:9971–9976.[公共医学][谷歌学者]
  • 蒂尔福斯B.麦迪赞捐赠计划（MDP）Ann Trop Med寄生虫。2008;102（补充1）：39–44。[公共医学][谷歌学者]
  • Traore MO、Sarr MD、Badji A、Bissan Y、Diawara L、Doumbia K、Goita SF、Konate L、Mounkoro K、Seck AF等。用伊维菌素治疗非洲地方性Foci消除盘尾丝虫病的初步证据：马里和塞内加尔研究的最终结果。公共科学图书馆（PLoS）负面特罗普疾病。2012;6：e1825。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Valenta T，Hausmann G，Basler K。β-catenin的多种面孔和功能。EMBO J。2012;31:2714–2736. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Varnat F、Duquet A、Malerba M、Zbinden M、Mas C、Gervaz P、Ruiz i Altaba A。人结肠癌上皮细胞具有活跃的HEDGEHOG-GLI信号，对肿瘤生长、复发、转移以及干细胞存活和扩张至关重要。EMBO分子医学。2009;1:338–351. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Varnat F、Siegl-Cachedenier I、Maleba M、Gervaz P、Ruiz I Altaba A。WNT-TCF成瘾的丧失和HH-GLI1信号的增强定义了人类结肠癌的转移转移。EMBO分子医学。2010;2:440–457. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Waaler J、Machon O、Tumova L、Dinh H、Korinek V、Wilson SR、Paulsen JE、Pedersen NM、Eide TJ、Machonova O等。一种新型tankyrase抑制剂可降低结肠癌细胞中典型Wnt信号传导，并降低条件APC突变小鼠的肿瘤生长。癌症研究。2012;72:2822–2832.[公共医学][谷歌学者]
  • van de Wetering M、Sancho E、Verweij C、de Lau W、Oving I、Huristone A、van der Horn K、Battle E、Coudreuse D、Haramis AP等。β-catenin/TCF-4复合物在结直肠癌细胞上强加隐窝祖细胞表型。单元格。2002;111:241–250.[公共医学][谷歌学者]
  • 杨CC。大环内酯的急性人体毒性。当前药物生物技术。2012;13:999–1003.[公共医学][谷歌学者]
  • Zbinden M、Duquet A、Lorente-Trigos A、Ngwabyt SN、Borges I、Ruiz I Altaba A。NANOG调节胶质瘤干细胞，在体内与GLI1和p53的跨功能网络中发挥重要作用。EMBO J。2010;29:2659–2674. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zhang W，Yang J，Liu Y，Chen X，Yu T，Jia J，Liw C.PP2A的调节亚单位PR55α，特异性调节PP2A介导的β-连环蛋白去磷酸化。生物化学杂志。2009;284:22649–22656. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zhao J，Yue W，Zhu MJ，Sreejayan N，Du M.AMP-activated protein kinase（AMPK）通过Ser552的-catenin磷酸化与典型Wnt信号传导进行交叉对话。生物化学与生物物理研究委员会。2010;395:146–151. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zhu G，Wang Y，Huang B，Liang J，Ding Y，Xu A，Wu W.A Rac1/PAK1级联控制结肠癌细胞中β-catenin的激活。致癌物。2012年a；31:1001–1012.[公共医学][谷歌学者]
  • Zhu R，Yang Y，Tian Y，Bai J，Zhang X，Li X，Peng Z，He Y，Chen L，Pan Q，等。通过miRNA-302b相关抑制结肠癌祖细胞，Ascl2基因敲除导致肿瘤生长停滞。《公共科学图书馆·综合》。2012年b；7：e32170。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ziskin JL、Dunlap D、Yaylaoglu M、Fodor IK、Forrest WF、Patel R、Ge N、Hutchins GG、Pine JK、Quirke P等。现场验证结肠直肠癌中的肠干细胞特征。内脏。2013;62:1012–1023.[公共医学][谷歌学者]
文章来自EMBO分子医学由以下人员提供自然出版集团