用于基因组编辑和癌症建模的CRISPR-Cas9敲除小鼠

小鼠组织特异性Cas9表达的特征

为了评估延长Cas9表达的效果，我们通过将Cre依赖性Cas9小鼠与β-actin Cre驱动因子交叉，生成了一个组成性Cas9表达小鼠系(Lewandowski等人，1997年). 这种杂交产生的后代是有活力的，并且在全身观察到Cas9-P2A-EGFP的表达(图1B). 组成型Cas9表达小鼠具有生育能力，产仔数正常，没有形态异常，并且能够繁殖到纯合子。在细胞水平上，我们也没有发现DNA损伤和凋亡标记物的形态异常或上调(图S1在线提供）。

为了进一步评估组成性Cas9表达在细胞生理学中是否有不利影响，我们使用了一组电生理测量来评估Cas9表达神经元的健康状况，这是一种对扰动特别敏感的细胞类型。因此，我们从急性海马脑片中对CA1锥体神经元进行全细胞膜片钳记录，以检测放电阈值(图1C和1D)和膜特性（膜兴奋性、输入电阻、膜电容、静息电位；图1E–1H和表S1)并发现野生型和表达Cas9的神经元之间没有显著差异。

使用条件Cas9小鼠、组织和细胞类型特异性启动子(Lewandoski，2001年)可以促进Cas9的时空表达。为了证明这一点，我们将Cre依赖性Cas9小鼠与两种Cre驱动菌株杂交，即多巴胺能神经元的酪氨酸羟化酶（TH-IRES-Cre）驱动和抑制性中间神经元亚型的小白蛋白（PV-Cre）驱动器(Hippenmeyer等人，2005年;Lindeberg等人，2004年). 正如预测的那样，Cas9的表达仅限于这两个杂交后代的F1代中的TH或PV阳性细胞(图1I–1J).

慢病毒介导的sgRNA表达对原代树突状细胞的体外基因组编辑

为了确定Rosa26敲除蛋白结构是否提供Cas9表达的功能水平，我们开始测试之前描述的U6-sgRNA慢病毒载体(Sanjana等人，2014年)能在原代免疫细胞中介导体内外吲哚的形成。一些类型的免疫细胞，如先天性免疫树突状细胞（DC），由于传递困难、培养期短或两者兼而有之，通常无法进行基因操作。此外，由于现有细胞系不能很好地模拟DC生物学，许多研究都是用从骨髓分离的前体细胞（BMDCs）体外获得的原代细胞进行的(图2A)保留了体内DC的许多关键特征(Amit等人，2009年;Chevrier等人，2011年;Garber等人，2012年;Shalek等人，2013年). 因此，我们推断，来源于组成型Cas9表达小鼠的Cas9表达细胞可能有助于此类应用，因为基因组编辑只需要引入sgRNAs，而sgRNAs可以使用慢病毒载体有效传递。

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图2

组成性Cas9表达小鼠原代免疫细胞的体外基因组编辑

（A） 体外基因组编辑实验流程示意图。

（B） 组成型Cas9-表达（绿色）和野生型（蓝色）小鼠骨髓细胞的流式细胞术直方图，显示Cas9-P2A-EGFP仅在Cas9小鼠中表达。数据以单元格总数的百分比绘制。

（C） 靶向小鼠的sgRNA设计Myd88（Myd88）轨迹。

（D） 靶向小鼠的sgRNA设计A20型轨迹。

（E）我的88表达Cas9的DCs的结构指数分析Myd88（Myd88）-靶向sgRNA（sgMyd88-1和sgMyd 88-2）或对照（CTR，四个对照sgRNA的平均值），仅在Myd88（Myd88）-目标细胞。数据绘制为Illumina测序读数在目标位置包含indels的百分比。突变分为移码（fs，黄色条）或非移码（nfs，橙色条）。

（F）A20型表达Cas9的DC的组成成分的indel分析A20型-靶向sgRNA（sgA20-1）或对照（CTR，四个对照sgRNA的平均值），仅在A20型-目标细胞。数据绘制为Illumina测序读数在目标位置包含indels的百分比。突变分为移码（fs，黄色条）或非移码（nfs，橙色条）。

（G）Myd88（Myd88）用任何一种方法转导的组成型Cas9表达DC的mRNA定量Myd88（Myd88）-靶向sgRNA（sgMyd88-1或sgMyd 88-2）或对照（CTR，六个对照sgRNA的平均值），仅在Myd88（Myd88）-目标细胞。数据绘制为Myd88（Myd88）纳米线计数器分析中的mRNA水平。

（H） 用Myd88靶向sgRNA（sgMyd88-1或sgMyd 88-2）或对照（四个对照sgRNAs）转导的组成型Cas9表达DC的免疫印迹显示Myd88（Myd88）蛋白仅存在于Myd88靶向细胞中。β-actin作为负荷对照。（星号）过度曝光，重复测量。

（一） 用任何一种基因转导的表达Cas9的构成性DC的纳米线计数器分析Myd88（Myd88）-靶向sgRNA（sgMyd88-1或sgMyd88-2）或shRNA（shMyd88），A20型-靶向sgRNA（sgA20-1或sgA20-2）或shRNA（shA20），显示改变的LPS反应。（插图）显示以下各项之间差异最大的簇Myd88（Myd88）-和A20-目标sgRNAs，包括关键炎症基因（IL1a、IL1b、Cxcl1、Tnf等）。（红色）高；（蓝色）低；（白色）不变；基于相对于使用六个对照sgRNA的测量的倍数变化。另请参见图S2.

我们首先验证了组成型Cas9表达小鼠骨髓中Cas9的表达(图2B). 同样，我们验证了Cas9在许多其他免疫细胞类型中的表达(图S2). 在培养了组成型Cas9表达小鼠的骨髓细胞两天后，我们用编码两种不同sgRNAs的慢病毒感染了BMDCs，这两种sgRNA3分别针对其中一种的早期外显子我的D88(图2C)或A20型(图2D)分别是Toll样受体4（TLR4）信号的两个特征明确的阳性和阴性调节物。在转导后7天，我们用脂多糖（LPS）激活细胞并进行功能分析(图2A). 我们在67%–78%的测序读取中发现indels(图2E和2F)导致mRNA减少(图2G)和蛋白质(图2H).

DC专门从事病原体检测和启动适当的免疫反应(梅尔曼和斯坦曼，2001年). 因此，我们使用纳米线计数器测量了276个LPS反应代表基因在靶向细胞中的表达Myd88（Myd88）或A20型与对照组相比(图2I). 正如预测的那样，MyD88的缺失导致炎症反应基因的减少，而A20的缺失导致炎性反应基因的增加。这些效应与独立实验中观察到的shRNA-介导的敲除效应相当(图2I). 总之，我们的结果证明了组成型Cas9表达小鼠在原代细胞中有效扰动的潜力。

大脑中的体内基因组编辑

为了证明Cre依赖型Cas9小鼠体内的直接基因组编辑，我们应用AAV介导的Cre和sgRNA在大脑中的表达(图3A). 我们构建了一个AAV-U6-sgRNA-Cre载体(图3B)含有靶向高表达神经特异性RNA剪接因子的sgRNA，NeuN公司(雷诺Fox3)（sgNeuN）(图3C). 用AAV1和两种包装质粒的等量混合物包装一种嵌合AAV1/2载体，此前已证明该载体能有效感染神经元(Konermann等人，2013年). 包装好的病毒通过立体定向注射进入Cre-dependent Cas9小鼠的前额叶皮层(图3A). 注射后三周，我们解剖了注射的大脑区域。对NeuN公司该位点在预测的裂解位点附近显示出indel的形成(图3C)，表明Cas9是功能性的，并促进靶indel的形成。此外，我们仅在注射区域观察到NeuN蛋白耗竭(图3D-3F)，但不在对照组（非注射和LacZ公司-靶向sgRNA，称为sgLacZ）(图3D-3F). 为了量化这种影响，我们对三只小鼠的组织样本进行了免疫印迹分析，发现NeuN蛋白的表达减少了80%(图3G).

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图3

Cre-Dependent Cas9小鼠脑内的体内基因组编辑

（A） 显示将sgNeuN-表达的AAV立体定向输送到Cre依赖型Cas9小鼠前额叶皮层的实验程序的示意图。

（B） sgRNA表达的AAV载体示意图。

（C） 靶向小鼠的sgRNA设计NeuN公司基因座和代表性Illumina测序读数（r_n个)来自注射AAV1/2-NeuN的Cre-dependent Cas9小鼠，显示靶点形成吲哚（红色箭头）。

（D） 从注射或不注射AAV1/2-sgNeuN或AAV1/2-sgLacZ的Cre依赖性Cas9小鼠脑组织中分离出的代表性免疫印迹，显示NeuN仅在NeuN公司-目标小鼠。β-微管蛋白作为负荷对照。

（E） 转导后3周注射AAV1/2-sgNeuN的Cre依赖性Cas9小鼠前额叶皮层的代表性免疫荧光图像，显示Cre介导的Cas9-P2A-EGFP激活和相应的NeuN耗竭（NeuN）。底部一行显示了装箱区域的放大视图。比例尺，200μm（顶部）和50μm（底部）。

（F） 转导后3周，Cre-dependent Cas9小鼠双侧注射AAV1/2-sgNeuN（左半球）或AAV1/2-sgLacZ（右半球）的前额叶皮层的代表性免疫荧光图像显示，NeuN仅在转导后2周出现缺失NeuN公司-目标半球。比例尺，200μm。

（G） 转导后3周注射AAV1/2-sgNeuN或AAV1/2-sgLacZ的Cre依赖性Cas9小鼠脑组织切片的免疫印迹定量，显示只有在NeuN公司-目标小鼠。数据绘制为平均值±SEM（n=3只小鼠）***p<0.0005。

（H）NeuN公司对转导后3周注射表达sgNeuN或sgLacZ的AAV1/2-EGFP-KASH载体的Cre依赖性Cas9小鼠的神经元核群进行indel分析，结果显示只有在转导后的3周内，神经元核群才出现显著的indel形成NeuN公司-目标细胞。数据绘制为平均值±SEM（n=3只小鼠）***p<0.0005。

（一）NeuN公司对注射表达sgNeuN的AAV1/2-EGFP-KASH载体的Cre-dependent Cas9小鼠的单个神经元核进行indel分析，结果表明84%的转导神经元在两个等位基因上都发生突变。单个细胞核分为双等位基因、单等位基因或野生型。数据绘制为原子核百分比（n=167）。

（J）NeuN公司对注射表达sgNeuN的AAV1/2-EGFP-KASH载体的Cre-dependent Cas9小鼠的单个神经元核进行indel分析，显示大多数突变是移码的。来自纯合子（n=141）或杂合子（n=15）细胞核的个体等位基因突变分为移码（fs）或非移码（nfs）。数据绘制为纯合子（n=141）或杂合核（n=15）的百分比。

为了研究Cas9介导的基因组编辑在单细胞水平上的诱变效应，我们开始根据先前建立的方法分离单个神经元细胞核(Okada等人，2011年). 为了实现这一点，我们生成了一个单一载体（AAV-sgRNA-hSyn-Cre-P2A-EGFP-KASH），该载体表达sgRNA、Cre和EGFP融合到神经元的KASH（Klarsicht，ANC-1，Syne同源性）核跨膜域（L.S.和M.Heidenreich，未发表数据）。采集注射的脑组织后，我们使用荧光激活细胞分选（FACS）分离单个EGFP阳性神经元核。EGFP阳性核群靶位点的靶扩增子测序显示，平均indel率为85%(图3H). 167个单核的测序显示，84%（n=141）的转导细胞具有双等位基因修饰，剩下9%（n=15）具有单等位基因修饰，7%（n=11）未修饰(图3I). 141个双等位基因突变核同时含有移码突变（3n+1或3n+2相）和非移码突变(图3J).

多基因癌症突变的体内模型

Cas9介导的基因组编辑的多重性使多基因疾病过程（如肿瘤发生）的建模成为可能。癌细胞的基因组具有复杂的遗传损伤组合(温伯格，2007年)通常包括原癌基因的获得功能突变和肿瘤抑制基因的丧失功能突变(Garraway和Lander，2013年;劳伦斯等人，2013年). 由于很难创建具有多个扰动等位基因的转基因动物，因此很难阐明这些复杂的遗传改变组合在肿瘤进化中的作用。因此，我们开始在Cre依赖性Cas9小鼠中建立多病变肺癌模型。

我们选择对涉及癌基因的肺癌突变进行建模KRAS公司和抑癌基因第53页和LKB1号机组(第11列)，是人类肺腺癌中最常见的三个突变基因（46%为第53页，33%用于KRAS公司17%用于LKB1号机组) (TCGA-网络，2014). 为了模拟这三个基因的突变动力学，我们构建了一个能够产生KRAS公司^G12D系列同时敲除基因突变第53页和LKB1号机组在Cre-dependent Cas9小鼠中。

设计了多个针对G12D位点附近第一个外显子的sgRNAsKRAS公司和早期外显子第53页和LKB1号机组使用先前开发的信息学工具(Hsu等人，2013年). 为了为每个基因选择一个有效的sgRNA，我们分别在癌细胞系（Neuro-2a）中表达每个sgRNA和Cas9，并使用SURVEYOR核酸酶分析量化编辑效率。大多数sgRNAs能够在特定的靶位点诱导indels(图S3A). 为三个基因中的每一个选择一个sgRNA，然后用于生成包含所有三个sgRNA的U6表达盒的单个载体。该单一载体的瞬时转染在所有三个基因中都产生了显著的indels（35%KRAS公司, 44%第53页和30%LKB1号机组) (图S3B).

鉴于第53页和LKB1号机组患者肿瘤中的突变通常在本质上是功能丧失KRAS公司通常是错义突变，导致功能增强(TCGA网络，2014). 为函数的错义增益建模KRAS公司突变后，我们设计了一个HDR供体模板，该模板由800个碱基对（bp）基因组序列组成，与包含小鼠第一外显子的区域同源KRAS公司基因。该HDR供体编码：（1）第12个氨基酸位置（G12D）的甘氨酸（G）到天冬氨酸（D）突变，导致致癌KRAS公司^G12D系列突变；（2） 11个同义单核苷酸改变，以帮助区分供体和野生型序列；（3）原间隔区邻接基序（PAM）突变，以防止供体DNA被Cas9切割。测试HDR介导的错义的效率KRAS公司突变，我们使用深度测序来评估体外培养的Neuro-2a细胞中G12D掺入率。4%的测序读数与供体序列一致，包括G12D突变和同义突变(图S3C). 总的来说，这些数据表明单个载体可以刺激HDR事件诱发KRAS公司^G12D系列突变以及促进高效编辑第53页和LKB1号机组体外基因。

Cas9-介导的基因组编辑第53页 LKB1号机组、和KRAS公司在肺部

经Cre重组酶诱导后，证实Cas9在肺部表达(图S4A和S4B)，我们评估了AAV介导的基因传递的效率(图4A). A类萤火虫使用两种不同血清型的AAV（AAV6-Fluc和AAV9-Fluc）包装荧光素酶（Fluc(Bell等人，2011年;Halbert等人，2002年;Limberis和Wilson，2006年). 病毒通过鼻内（i.n.）和气管内（i.t.）方法传播(图4A、4B、和S4C系列). 使用体内发光成像，我们在静脉注射AAV9-Fluc后1周检测到肺中的荧光素酶活性，但未检测到AAV6-Fluc。3周后，AAV6-Fluc和AAV9-Fluc在肺部均显示阳性信号，但AAV9产生更高的强度(图S4C). 基于这些数据，我们为所有后续的体内研究选择了AAV9载体的i.t.传递。

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图4

体内AAV9-KPL递送和突变分析

（A） Cre依赖型Cas9小鼠气管内（i.t.）将AAV9输送至肺部的示意图和实验流。

（B） 裸鼠注射AAV9-Fluc或生理盐水后的荧光素酶成像显示，AAV9-在肺部有效介导表达。

（C） AAV-KPL矢量示意图。

针对小鼠的（D和E）（左）sgRNA设计第53页（D） 和LKB1号机组（E） 基因座和代表性Illumina测序读数（r_n个)来自注射AAV9-KPL的Cre-dependent Cas9小鼠，显示靶点形成吲哚。（中）在目标位置发现的indel的大小分布。（右）全肺的独立分析（上）和编辑的等位基因的相位特征（下）。第53页和LKB1号机组位点比例尺，1kb。

（F） 靶向小鼠的sgRNA和HDR供体设计KRAS公司G12D掺入位点和代表性Illumina测序读数（r_n个)来自注射AAV9-KPL的Cre-dependent Cas9小鼠。绿色文本表示G12D突变，而蓝色文本表示预期的同义突变，表示成功生成KRAS公司^G12D系列突变。KRAS公司轨迹刻度条，1 kb。

（G）第53页和LKB1号机组对注射AAV9-KPL或AAV9-sgLacZ的Cre-dependent-Cas9小鼠的全肺进行indel分析，显示仅在注射AAV9KPL的小鼠中有显著的indel形成。数据绘制为平均值±SEM。*p<0.05**p<0.005。

（H）KRAS公司^G12D系列对注射AAV9-KPL或AAV9-sgLacZ的Cre依赖性Cas9小鼠的全肺进行突变分析，结果显示仅在注射AAV9KPL的小鼠中存在显著的G12D掺入。数据绘制为平均值±SEM。***p<0.0005。

另请参见图S3,S4系列、和第5章.

我们生成了一个单独的AAV矢量，将KRAS公司^G12D系列HDR供体，U6-sgRNA盒KRAS公司,第53页、和LKB1号机组以及含有Cre重组酶和雷尼利亚荧光素酶（AAV-KPL，图4C). 使用AAV9（AAV9-KPL）包装AAV-KPL载体，并将其静脉注射到Cre-dependent Cas9小鼠中，使用相对低剂量的病毒进行稀疏靶向。四周后，从AAV9-KPL转基因小鼠和AAV9-sgLacZ转基因对照小鼠的肺中获取，并通过Illumina测序进行表征。我们在第53页和LKB1号机组预测切割位置，0.1%第53页indels和0.4%LKB1号机组整个肺中的indels(图4D、4E和4G). 这些indels中有很大一部分可能会破坏内源性基因功能，因为它们大多超出框架（即长度为3n+1bp或3n+2bp）(图4D和4E). 此外，我们检测到0.1%KRAS公司^G12D系列肺细胞基因组中的HDR事件，如同义SNP编码的G12D读码所示(图4F和4H). indels的频率第53页、和LKB1号机组和目标KRAS公司^G12D系列突变随着时间的推移而增加，我们检测到1.3%第53页指数，1.3%LKB1号机组indels和1.8%KRAS公司^G12D系列分娩后9周全肺的突变(图4G–4H). 这可能是由于突变细胞的选择性生长优势。这些数据表明，将AAV9-KPL输送到Cre依赖性Cas9小鼠的肺部会产生KRAS公司^G12D系列突变和假定的功能丧失突变第53页和LKB1号机组.

Cas9介导的第53页,LKB1号机组、和KRAS公司在肺部诱发的肿瘤形成中

为了研究AAV9-KPL给药的表型效应，通过显微计算机断层扫描（μCT）对注射动物进行成像。注射后两个月，所有（5只中的5只=100%）经AAV9-KPL治疗的动物都在肺部出现结节，而经AAV9sgLacZ治疗的动物没有一只（0/5=0%，Fisher精确试验，单尾，p=0.008）出现可检测到的结节(图5A和5B和电影S1). 量化显示，2个月时的平均总肿瘤负担约为33mm^三(图5C)接近总肺容量的10%(Mitzner等人，2001年).

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图5

AAV9-KPL注射小鼠体内肿瘤形成

（A） 转导后2个月注射AAV9-KPL或AAV9-sgLacZ的Cre依赖性Cas9小鼠的肺部mCT图像显示，只有注射AAV9KPL的小鼠出现肿瘤形成（箭头所示）。

（B） 转导后2个月注射AAV9-KPL的Cre依赖性Cas9小鼠的肺部μCT 3D显示，显示肿瘤形成（黄色卵圆形）。

（C） 注射AAV9-KPL或AAV9-sgLacZ的Cre依赖性Cas9小鼠的主要肿瘤负担量化，显示AAV9-KPL注射小鼠的显著肿瘤负担。数据绘制为平均值±SEM。**p<0.005。

（D） 转导9周后注射AAV9-KPL或AAV9-sgLacZ的Cre-dependent Cas9小鼠的代表性肺部H&E图像显示，注射AAV9KPL的小鼠中存在异质性肿瘤形成。箭头突出显示了AAV9-KPL注射小鼠肺部肿瘤的代表性子集。比例尺，500μm。

（E） 转导后9周注射AAV9-KPL或AAV9-sgLacZ的Cre依赖性Cas9小鼠的肺部肿瘤大小量化。数据以箱线图的形式绘制，每个框表示组的中位数、上分位数和下分位数，以及95%的置信区间。单个肿瘤的数据点覆盖为棕色点。

（F–H）转导9周后注射AAV9-KPL或AAV9-sgLacZ的Cre-dependent-Cas9小鼠的平均肿瘤大小（F）、每叶平均结节数（G）和每叶总肿瘤面积（H）量化，显示AAV9-KPL注射小鼠的肿瘤异质性范围。数据绘制为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005。

另请参见图S3,S4系列、和第5章.

具体而言，我们观察到AAV9-KPL治疗的小鼠肺中有多个肿瘤结节，而AAV9-sgLacZ治疗的小鼠则没有(图5D). 此外，某些肺叶以一个大肿瘤为主，而其他肺叶则有许多大小不等的肿瘤(图5D–5G). 肿瘤的大小随时间显著增加(图5E). 每个叶的肿瘤总面积也随着时间的推移而显著增加(图5H). 肿瘤大小的变化表明肿瘤在肺叶和动物之间发生和生长是动态的，这让人想起在人类肿瘤中观察到的复杂性(Herbst等人，2008年).

SgRNA设计

SgRNAs是使用CRISPR工具设计的(http://crispr.mit.edu)以最大限度地减少潜在的偏离目标的影响。SgRNA序列和基因组引物列于表S3.

基因组DNA提取、捕获的Illumina测序和指数分析

按照推荐的方案，使用快速提取DNA提取液（Epicenter）从细胞和组织中提取基因组DNA。如前所述，将处理过的细胞和组织用作PCR模板，用于捕获测序和使用高保真聚合酶（Thermo Scientific）进行SURVEYOR核酸酶分析(Hsu等人，2013年). 基因组PCR产物使用Nextera XT DNA样品制备试剂盒（Illumina）或定制条形码方法进行文库制备。简言之，进行低周期的第一轮PCR以扩增靶位点。进行第二轮PCR以添加通用适配器，然后将其用于第三轮PCR以进行样本条形码。样品以等量汇集，并使用QiaQuick PCR Cleanup（QIAGEN）进行纯化，并使用Qubit（Life Technologies）进行量化。在Illumina MiSeq系统上对混合条形码库进行测序。

Illumina序列分析

Illumina测序读数被映射到KRAS公司,第53页，或LKB1号机组使用Burrows-Wheeler对准器作为参考序列(Li和Durbin，2010年)使用自定义脚本。使用VarScan2针对引用调用插入和删除(Kobolt等人，2012年). 如前所述，使用自定义脚本处理Indel长度分布、Indel相位和供体等位基因频率(Chen等人，2014年;Hsu等人，2013年). The rate ofKRAS公司^G12D系列根据G12D突变和同义条形码SNP计算HDR作为供体等位基因频率。

AAV1/2 DNA载体

用于小鼠脑内立体定向注射的AAV载体在AAV血清型2 ITR之间克隆，还包括用于非编码sgRNA转录的人类U6启动子、普遍存在的Cbh启动子（CBA启动子的混合形式）(格雷等人，2011年)、HA-tagged Cre重组酶，用于重组loxP-SV40polyA-loxP、WPRE和人类生长激素polyA序列。为了进行细胞核分选，在AAV血清型2 ITR之间克隆了一个类似的质粒，并且还包括用于非编码sgRNA转录的人类U6启动子、普遍存在的hSyn启动子、用于重组loxP-SV40polyA-loxP、P2A、用于核标记的EGFP-KASH融合的HA-taged Cre重组酶、WPRE和人类生长激素polyA序列。完整的质粒序列和注释见数据S1.

AAV1/2生产

在Dulbecco改良的Eagle培养基（来自Life Technologies的DMEM，10569-010）中转染HEK293FT细胞，转染感兴趣的质粒pAAV1质粒、pAAV2质粒、辅助质粒pDF6和PEI-Max（Polysciences，Inc.24765-2）。转染72小时后，丢弃细胞培养基。然后通过低速离心对细胞进行冲洗和造粒。随后，将病毒应用于HiTrap肝素柱（GE Biosciences 17-0406-01），并用一系列摩尔浓度增加的盐溶液清洗。在最后阶段，使用Amicon超15离心过滤装置（Millipore UFC910024）浓缩肝素柱的洗脱液。使用定制的Cre靶向Taqman探针（生命技术）通过定量PCR对病毒颗粒进行滴定。

立体定向注射AAV1/2

2–3个月大的动物通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和木聚嗪（10 mg/kg）进行麻醉。我们还腹膜内给予盐酸丁丙诺啡（0.1 mg/kg）作为先发制人的镇痛药。一旦受试小鼠处于深度麻醉状态，他们将被固定在Kopf立体定向装置中，该装置使用耳内定位钉和牙棒固定颅骨。标准加热垫提供热量以取暖。我们在Bregma前方1.94毫米处和外侧0.39毫米处的颅骨表面钻了一个孔，以便注入前额叶皮层。使用33 G Nanofil针头和World Precision Instrument Nanofil[–2.95 mm深度处的注射器，我们注射了1 ul（1×10¹³病毒基因组复制）AAV进入大脑右半球。注射速率由世界精密仪器公司UltraMicroPump3监测。注射后，我们用6-0 Ethilon缝线（Johnson&Johnson的Ethicon）缝合切口部位。术后用1 ml乳酸林格溶液（皮下）给动物补水，并将其置于温度控制（37°C）的环境中，直到实现动态恢复。术后直接皮下注射美洛昔康（1-2 mg/kg）。为了进行下游分析，在立体定向显微镜下解剖EGFP+组织。

AAV6和AAV9矢量设计

利用来自AAV2的ITR克隆了单载体设计，AAV2是用于非编码sgRNA转录的人类U6启动子，短EFs启动子来源于EF1a型,雷尼利亚体内荧光素酶成像用荧光素酶，肽裂解用P2A，LSL重组用Cre重组酶，短polyA序列和800 bpKRAS公司^G12D系列同源重组供体模板。完整的质粒序列和注释见数据S1.

AAV6/9生产和净化

AAV6和AAV9在HEK293FT细胞中包装和生产，并用氯仿进行化学纯化。总之，HEK293FT细胞瞬时转染了感兴趣的载体、AAV血清型质粒（AAV6或AAV9）和pDF6（使用聚乙烯亚胺（PEI））。在转染后72小时，将细胞移出并转移到无菌DPBS中的锥形管中。添加1/10体积的纯氯仿，并在37℃孵育混合物^°C，剧烈摇晃1小时。添加氯化钠至最终浓度1 M，摇晃混合物直到溶解，然后在20000 3下造粒克在4^°将三氯甲烷层转移到另一管中时，丢弃水层。将PEG8000添加至10%（w/v）并摇晃直至溶解。混合物在4点孵育^°C冷却1小时，然后以20000×克在4^°将上清液丢弃，并将颗粒重新悬浮在DPBS和MgCl中₂并用苯甲酸酶（Sigma）处理，37℃孵育^°然后添加三氯甲烷（体积1:1），摇晃并在12000×克在4C下保持15分钟。隔离水层并通过100 kDa MWCO（Millipore）。用DPBS清洗浓缩溶液，并重复过滤过程。使用针对Cre的定制Taqman分析（生命技术）通过qPCR对病毒进行滴度。

病毒进入肺部

根据之前制定的方案进行腺相关病毒的鼻内和气管内给药(DuPage等人，2009年). 简言之，2至3个月大的动物使用异氟烷麻醉，并放置在生物安全柜中。对于鼻内给药，将之前滴定过的病毒溶液放入50 ml无菌生理盐水中，用吸管直接移到小鼠的一个鼻孔中。对于气管内给药，将一根24号量规导管插入气管，用移液管将75μl无菌生理盐水中的病毒溶液移到导管顶部，让动物逐渐吸入溶液。滴度为1×10¹¹对每只小鼠进行病毒基因组复制。手术结束后，用加热灯为动物保温以恢复健康。

免疫染色和成像

给予小鼠致命剂量的氯胺酮/木拉津，并使用蠕动泵（Gilson）用0.9%生理盐水和4%多聚甲醛经心灌注，并固定过夜。在厚度为40μm的振动仪（Leica VT1000S）上进行组织切片。在含有0.1%Triton X-100（PBSTx）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中冲洗切片三次，并用5%的正常山羊血清（NGS）（细胞信号技术）在PBS-Tx中封闭1小时。用含有5%NGS的PBS-Tx中稀释的一级抗体孵育切片，在4小时内过夜^°轨道振动筛上的C。以下是使用的主要抗体列表：抗裂解半胱天冬酶3（CC3）（1:1000，细胞信号技术，9664）、抗yH2AX（1:1000；Millipore，05-636）、抗NeuN（1:800，细胞信号科技，12943）、抗GFP（1:1600，Nacalai-Tesque，GF090R）、抗parvalbumin（1:1000、Sigma-Aldrich，P3088）、，和抗酪氨酸羟化酶（1:1000，Immunostar，22941）。第二天，在PBS-Tx中清洗切片三次，然后在室温下在轨道振动筛上用适当的AlexaFluor 405、488、568和/或647二级抗体（1:400，Life Technologies）在PBS-Tx中培养3小时。孵育后，用PBS-Tx冲洗切片三次，然后安装在超霜显微镜载玻片（VWR）上。然后用VECTASHIELD HardSet Mounting Medium和DAPI（VECTOR Laboratories）覆盖切片，并在共焦显微镜下进行可视化（蔡司LSM 710、Ax10 ImagerZ2、Zen 2012软件）。

单个神经元核的纯化及流式细胞术

为了标记神经元细胞核，我们生成了AAV-U6-sgRNA-hSyn-Cre-P2A-EGFP-KASH载体。注射后3周，我们在立体定向显微镜下解剖了前额叶皮层EGFP+注射部位。如前所述（L.S.和M.Heidenreich，未发表的数据），在2ml冰镇均质缓冲液（HB）（320 mM蔗糖，5 mM CaCl，3 mM Mg（Ac））中轻轻均质组织₂，10 mM Tris[pH7.8]，0.1 mM EDTA，0.1%NP40，0.1 mM-PMSF，1 mMβ-巯基乙醇），使用2 ml Dounce均质器（Sigma-Aldrich）；使用杵A进行25次，然后使用杵B进行25次。再添加3 ml HB，将混合物放在冰上5分钟。使用5 ml 50%OptiPrep密度梯度培养基（Sigma-Aldrich）进行梯度离心，其中含有5 mM CaCl，3 mM Mg（Ac）₂，10 mM Tris pH 7.8，0.1 mM PMSF，1 mMβ-巯基乙醇。在30 ml锥形离心管（Beckman Coulter，SW28转子）中，将含核混合物轻轻添加到29%等-等极OptiPrep溶液的顶部。样品在10100×克（7500转/分）在4时持续30分钟^°C.去除上清液，将细胞核颗粒轻轻地重新悬浮在65 mMβ-甘油磷酸（pH 7）、2 mM MgCl中₂、25 mM KCl、340 mM蔗糖和5%甘油。完整的细胞核用Vybrant DyeCycle Ruby Stain（Life Technologies）标记，并用BD FACSAria III EGFP进行分类⁺将细胞核分为96孔板上的各个孔，该板含有5μl QuickExtract DNA Extraction Solution（Epicenter）。

小鼠树突状细胞

所有DC实验均使用6至8周龄表达Cas9的雌性小鼠。从股骨和胫骨采集骨髓细胞，以2×10的浓度进行电镀⁵/在RPMI培养基（GIBCO、Carlsbad、CA、Invitrogen、Carlsbacd、CA）中的未处理组织培养皿上，添加10%的FBS（Invitrogen）、L-谷氨酰胺（Cellgro）、青霉素/链霉素（Cellgro）、MEM非必需氨基酸（Cellglo）、HEPES（Cellgro）、丙酮酸钠（Cellgro）、β-巯基乙醇（GIBCO）和GM-CSF（20 ng/ml；肽基）。SgRNAs靶向Myd88（Myd88）和A20型被克隆到导向慢病毒载体(Sanjana等人，2014年). 在第2天，用编码引导RNA的慢病毒感染细胞。细胞在GM-CSF存在下扩增。第7天，通过添加5 mg/ml的嘌呤霉素（Invivogen）来选择感染细胞。第9天，在蛋白质分析前30分钟或mRNA表达谱前3小时添加100 ng/ml LPS（Invivogen）。用BD-Accuri C6进行流式细胞术检测GFP。使用抗Myd88（R&D Systems AF3109）和抗肌动蛋白（Abcam，ab6276）抗体进行蛋白质印迹。

纳米线计数器表达测量

如前所述，对DC进行处理和分析(Amit等人，2009年). 简而言之，5×10⁴细胞在补充有β-巯基乙醇的TCL缓冲液（QIAGEN）中溶解。5%的裂解物与之前描述的纳米串基因表达编码组杂交16小时(Geiss等人，2008年)并加载到n计数器准备站，然后使用n计数器数字分析仪进行量化。如前所述，使用控制基因对计数进行标准化(Amit等人，2009年)并计算相对于用sgRNA靶向GFP和非靶向对照转导的细胞的折叠变化。使用GENE-E创建热图(http://www.broadinstitute.org/cancer/software/GENE-E/).

μCT成像和处理

使用标准成像协议和μCT机器（GE Healthcare）进行μCT成像。简而言之，使用异氟醚对动物进行麻醉，并将其放置在成像床上，鼻锥提供恒定的异氟醚。使用软组织快速扫描设置，每只小鼠共获得720个视图。使用标准ROI工具（MicroView）处理原始图像堆栈以进行肺部重建。使用MicroView中的渲染体积工具和测量工具进行渲染和量化。肿瘤负担计算为大小之和（单位：mm）^三每只小鼠的所有可检测肿瘤，每组3-4只小鼠。

肺组织学

用二氧化碳窒息法处死小鼠。在荧光立体镜下解剖肺部，将其固定在4%甲醛或10%福尔马林中过夜，包埋在石蜡中，在6μm处切片，并用苏木精和伊红（HE）染色进行病理学检查。对于肿瘤大小的量化，将图像平铺整个肺叶，合并成单个肺叶，手动勾画出感兴趣区域（ROI），然后使用ImageJ进行量化(施耐德等人，2012年). 如前所述，使用标准免疫组织化学（IHC）方法对切片进行脱蜡、复水和染色(Chen等人，2014年). 以下抗体用于IHC：抗Ki67（abcam ab16667，1:100）、抗CCSP（Millipore，1:500）、抗pSPC（Millibore AB3786，1:500。使用ImageJ对每叶10个随机选择的低倍视野中的IHC进行量化，每组3只小鼠(施耐德等人，2012年).

TCGA数据分析

从TCGA数据门户下载TCGA肺腺癌（LUAD）突变数据(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). 重新处理LUAD的变异注释格式文件以显示KRAS公司编码错义突变以及Tp53型和STK11型227例患者的功能丧失突变。

我们感谢整个张实验室和夏普实验室。我们感谢J.T.Ting、I.Tirosh、N.Sanjana、M.Muzumdar、S.Jones、Y.Li以及Broad和Koch Institutes的同事提供的技术援助和讨论。我们感谢斯旺森生物技术中心的支持（特别是应用治疗学和全动物成像、生物信息学和计算、ES细胞和转基因、显微镜、流式细胞术和组织学）。R.J.P.由国家科学基金会研究生研究奖学金资助，资助号为1122374。S.C.是Damon Runyon癌症研究研究员（DRG-2117-12）。Y.Z.由麻省理工学院西蒙斯社会大脑中心（Simons Center for the Social Brain at MIT）博士后奖学金资助。L.S.是欧洲分子生物学组织（EMBO）和波兰科学基金会（FNP）研究员。J.E.D.得到了NDSEG、NSF和MIT总统研究生奖学金的支持。M.J.由瑞士国家科学基金会高级研究人员（SNF）和玛丽·斯科洛多斯卡·库里IOF的研究金资助。R.J.X.和D.G.由赫尔姆斯利慈善信托基金和DK43351提供支持。A.R.由NHGRI CEGS P50 HG006193、HHMI和克拉曼细胞天文台支持。N.H.由NHGRI CEGS P50 HG006193支持。R.L.和D.A.G.得到了美国国立卫生院癌症纳米技术卓越中心（NIH Centers of Cancer Nanotechnology Excellence）授予的U54CA151884、受控释放授予的EB000244以及美国国立卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所（National Health Institutes of Health）授予的纳米技术卓越计划（PEN）合同HHSN268201000045C的支持。G.F.由McGovern Internal Funding Poitras Gift 1631119、Stanley Center、SFARI/Simons Foundation 6927482和Nancy Lurie Marks Family Foundation 6928117提供支持。P.A.S.由美国国立卫生研究院的美国公共卫生服务R01-CA133404支持；由国家癌症研究所的MIT-Harvard癌症纳米技术卓越中心授予U54 CA151884；玛丽·D·卡西米尔·兰伯特基金会慷慨捐赠；由斯科尔科沃基金会的斯科特理工学院/麻省理工学院倡议拨款；部分由国家癌症研究所科赫研究所支持（核心）拨款P30-CA14051。F.Z.由NIMH通过NIH主任先锋奖（DP1-MH100706）、NINDS通过NIH变革R01拨款（R01-NS 07312401）、NSF Waterman奖、Keck、Damon Runyon、Searle Scholars、Klingenstein、Vallee、Merkin和Simons基金会以及Bob Metcalfe提供支持。学术界可通过Addgene获得CRISPR试剂，相关协议、支持论坛和计算工具可通过Zhang实验室网站获得(http://www.genome-engineering.org). 可通过Jackson实验室获得Cre-dependent Cas9（JAX库存编号：024857）和组成型Cas9表达（JAX储备编号：0248058）小鼠。