醛脱氢酶1是肺癌的肿瘤干细胞相关标记物

ALDH1阳性细胞具有干细胞样特征体外

检查ALDH1阳性细胞是否表现出增加在体外我们首先培养亲本NSCLC细胞及其相应的ALDH1阳性和ALDH1阴性细胞，分别培养2、4、6和8天。ALDH1阳性细胞比亲代细胞和ALDH1阴性细胞生长更快(图1B)表明ALDH1阳性癌细胞的增殖能力增强。然后，我们通过平板细胞和克隆密度培养14天来检测不同细胞群体的克隆形成潜能，以了解其个体增殖能力。如所示图1C，ALDH1阳性群体中大集落的形成明显大于ALDH1阴性群体中大集落的形成，这提供了ALDH1阳性细胞显示出增加的增殖能力的进一步证据。

此外，在相同条件下培养不同细胞群后，我们对细胞进行了重新分析，并使用Aldefluoro分析和FACS分析测定了它们的分化能力。ALDH1阳性细胞增加到52%（52±2.6%）ALDH1阴性细胞和48%（48±2.2%）ALDH1阳性细胞(图1D)。相反，ALDH1阴性细胞只产生ALDH1阳性细胞，不能分化为ALDH1正细胞。这些结果表明ALDH1阳性细胞可能经历不对称分裂在体外自我更新并产生高侵袭性和低侵袭性致瘤表型的异质细胞群。

为了研究ALDH1阳性细胞是否比ALDH1阴性细胞和亲代癌细胞具有更大的侵袭性，我们进行了在体外分选和未分选NSCLC细胞的基质侵袭试验。实验重复了三次。如所示图1E，ALDH1阳性细胞比ALDH1阴性细胞和未分类的亲代癌细胞（所有P（P）< 0.05).

所有这些研究结果表明，ALDH1阳性肺癌细胞具有CSC样在体外属性。

ALDH1阳性细胞表达独特的干细胞标记

为了确定ALDH1阳性细胞是否表达不同的干细胞分子标记物，我们检测了CD133抗体，这是一种以前证实的肺CSC标记物(20)在ALDH1阳性和ALDH1阴性人群中。免疫荧光分析显示，相对于ALDH1阴性细胞，ALDH1阳性细胞的细胞质对CD133具有较强的免疫反应性(补充图S1)。64%（64±2.9%）的ALDH1阳性细胞对CD133呈阳性反应，但只有1.2%（1.2±0.6%）的ALDH1阴性细胞对CD1313呈阳性反应(P（P）< 0.05). 这意味着来自肺癌细胞的ALDH1阳性细胞在CSC中富集。

ALDH1阳性细胞对化疗药物具有高度耐药性

化疗耐药是CSC的另一个重要特征。为了评估ALDH1阳性细胞是否对临床上常用的化疗药物（作为肺癌一线治疗药物）表现出更高的耐药性，我们对ALDH1正细胞和ALDH1阴性细胞进行了敏感性分析。与ALDH1阴性细胞相比，ALDH1阳性细胞对化疗药物的耐药性更强(补充图S2)。这一发现与传统化疗药物对肺癌患者的疗效不佳一致，因此提示ALDH1阳性细胞可能代表肺CSC。

ALDH1阳性癌细胞的肿瘤形成与自我更新体内

确定ALDH1阳性肺癌细胞是否能够引发肿瘤体内我们将ALDH1阳性和ALDH1阴性的H358和H126细胞分别植入裸鼠的侧翼。4周后，1×10的剂量^三ALDH1阳性肺癌细胞植入5只小鼠后，肿瘤直径为10±2.3 mm^三在所有小鼠中，而相同剂量的ALDH1阴性细胞在任何小鼠中都不会产生肿瘤。此外，剂量为1×10⁵ALDH1-H125阳性肺癌细胞在所有五只小鼠中产生了更大的肿瘤，直径为30±2.9 mm^三而相同剂量的ALDH1阴性H125细胞产生较小的肿瘤块（5 mm^三)五只老鼠中只有一只(图2A)。同样，剂量为1×10⁵ALDH1阳性肺癌细胞在所有五只小鼠中产生了更大的肿瘤，直径为36±3.2 mm^三而相同剂量的ALDH1阴性H358细胞产生较小的肿瘤块（4 mm^三)五只老鼠中只有一只。

在单独的窗口中打开

图2

ALDH1阳性肺癌细胞具有肿瘤干细胞特性体内.答：。ALDH1阳性细胞的成瘤能力大于ALDH1阴性细胞。将ALDH1阳性和ALDH1阴性的H125细胞移植到裸鼠两侧。4周后，1×10的剂量⁵ALDH1阳性肺癌细胞产生较大肿瘤(红箭)直径为30±2.9 mm的所有五只小鼠^三而相同剂量的ALDH1-negative H125细胞仅产生较小的肿瘤块（5 mm^三;绿色箭头)只有五只老鼠中的一只。使用细胞系H358和H125进行动物实验，并重复三次。A类仅显示H125细胞系的结果。B。对ALDH1阳性H125癌细胞形成的移植瘤进行组织病理学检查，发现一个具有肺腺癌特征的高细胞团。C、。ALDH1阳性异种移植瘤细胞的双色FISH分析H125型带有探针（绿色信号）的肺癌细胞FHIT公司基因和3号染色体着丝粒区域的探针（红色信号）。肿瘤细胞中的大多数细胞缺失FHIT公司绿色信号比红色信号少。D。重新分析由ALDH1阳性和ALDH1阴性癌细胞生成的移植瘤细胞，并使用Aldefluor分析和FACS测量其分化能力。ALDH1阳性H125癌细胞产生的肿瘤细胞(左边)产生46%（46±3.1%）的ALDH1阳性群体和54%（54±3.3%）的ALDH1阴性细胞，而来自肿瘤的细胞由ALDH1阴性的H125细胞形成(正确的)仅产生ALDH1阴性细胞群，这意味着ALDH1阳性细胞可能经历不对称分裂体内自我更新并产生高侵袭性和低侵袭性致瘤表型的异质细胞群。对来自H358和H125细胞系的肿瘤植入物的分解细胞进行了氟化铝分析和FACS实验，并分别重复了三次，而D类仅说明H125细胞的结果。

组织病理学检查显示，ALDH1阳性H125癌细胞移植瘤中有一个具有肺腺癌特征的高度细胞团(图2B)。此外，荧光就地用特定遗传探针进行杂交（FISH）分析显示FHIF公司基因(图2C)ALDH1阳性肺癌细胞产生的肿瘤块中，肺癌细胞最常见的遗传特征之一。

阐明ALDH1阳性癌细胞能否自我更新并产生异质性肺癌体内在细胞分离后，对肿瘤植入物进行了Aldefluoro分析和FACS分析。由ALDH1阳性细胞产生的肿瘤的分解细胞平均产生46%（46±3.1%）的ALDH1正细胞和54%（54±3.3%）的ALDH1阴性细胞(图2D)。然而，从ALDH1阴性癌细胞的肿瘤中分离出来的细胞仅显示出ALDH1阳性人群。

总之，我们的体内数据强烈表明，与ALDH1阴性肿瘤细胞相比，ALDH1阳性肺癌细胞具有肿瘤干细胞的独特特征，包括启动肿瘤发生和具有多潜能分化潜能的肿瘤细胞增殖。

ALDH1过度表达与非小细胞肺癌侵袭性生物学行为相关

为了评估ALDH1上调是否参与非小细胞肺癌的侵袭性生物学行为，我们首先通过对新采集的经支气管针吸标本进行免疫组织化学分析来分析ALDH1的表达。60份肺癌样本中有18份显示ALDH1阳性染色(图3A;表1)。ALDH1的过度表达与患者疾病的临床分期有显著的统计学意义(P（P）=0.02）。然后，我们检测了来自59名不同临床分期、组织学类型和分级的非小细胞肺癌患者的肺组织微阵列中ALDH1的表达。与我们对TBNA标本的评估结果一致，ALDH1蛋白在细胞质中表达，主要局限于肿瘤细胞(图3B)。ALDH1过度表达发生在59例中的17例（29%），肺肿瘤发生在30例腺癌中的8例（27%），25例CSC中的8个（32%），以及4例肺大细胞癌中的1例（25%）。这两组独立的临床样本的结果表明，ALDH1的高表达与非小细胞肺癌患者的组织学分级和临床分期显著相关（全部P（P）< 0.05).

在单独的窗口中打开

图3

ALDH1过度表达与NSCLC的侵袭性生物学行为和NSCLC患者的不良预后相关。答：。对一例IV期非小细胞肺癌患者肺肿瘤肿块的TBNA标本进行免疫组织化学分析，结果显示ALDH1阳性表达。B。对一例IV期肺腺癌患者石蜡包埋肺肿瘤组织的免疫组织化学分析表明，ALDH1的过度表达主要发生在癌细胞的细胞质中。C、。一期非小细胞肺癌中ALDH1表达水平对肿瘤特异性生存率的影响。D。第一期非小细胞肺癌ALDH1表达水平的总生存率。采用Kaplan-Meier方法确定生存概率，并采用log-rank检验比较各组之间的生存曲线。

此外，用CD133抗体染色进行组织微阵列免疫组织化学分析表明，一部分ALDH1阳性癌细胞表达CD133。总的来说，在17例（60%）ALDH1阳性表达的癌症标本中，有10例（10%）CD133也呈阳性表达，而ALDH1阴性表达的标本中没有一例CD133表达。此外，所有CD133阳性样本的ALDH1染色也呈阳性。这些数据证实了我们在在体外细胞培养实验：ALDH1阳性细胞可能富含肺CSCs。

用流式细胞仪分析ALDH1阳性细胞群并进行醛氟测定

为了分离具有ALDH1酶活性的醛氟染色细胞群，我们使用了醛氟试剂盒（干细胞技术），该试剂盒旨在通过与人类ALDH1的特异性相互作用来优化干细胞的鉴定和分离(15)。实验是根据制造商的指示进行的。简而言之，将细胞悬浮在含有未带电ALDH1底物BODIPY-氨基乙醛（BAAA）的醛氟检测缓冲液中，并在37°C下培养40分钟。BAAA通过被动扩散被活细胞吸收，然后被细胞内ALDH转化为带负电荷的反应产物BODIPY-氨基乙酸，该反应产物保留在表达高水平ALDH1的细胞内，使细胞发出明亮的荧光。在FACScan仪器（BD Biosciences）的绿色荧光通道（520–540 nm）中检测到明亮荧光的ALDH1表达细胞（ALDH1阳性细胞）。使用与特异性ALDH抑制剂二乙氨基苯甲醛（Sigma）相同的条件对一组细胞进行染色，作为每个实验的阴性对照。使用橙色荧光通道检测碘化丙锭（Sigma）荧光。因为只有具有完整细胞膜的细胞才能保留醛氟反应产物，所以只能鉴定出存活的ALDH1阳性细胞。用BAAA和二乙氨基苯甲醛孵育的细胞建立这些细胞（R1）的基线荧光，并确定（ALDH1）阳性区域（R2）。在不含二乙胺基苯甲醛的情况下，将细胞与底物孵育，导致BAAA荧光发生改变，从而定义了醛氟阳性群体。使用Cell Quest软件（BD Biosciences）分析数据。每个实验重复三次。

细胞增殖试验

亲代细胞和分选的ALDH1阳性和ALDH1阴性细胞被放置在6孔板（1×10⁴每孔）在补充有成纤维细胞生长因子（Sigma）和表皮生长因子（Sigma）的生长培养基中。每周使用一个孔，通过台盼蓝排除法进行细胞计数。确定他们的在体外自我更新能力，每孔一个细胞接种在96周板中。播种后，对含有单细胞的微孔进行鉴定和分析，以了解细胞生成球体的能力。每个实验重复三次。

细胞侵袭试验

根据制造商的说明，使用Matrigel入侵室（BD Biosciences Discovery Labware）测定细胞的侵袭潜能。简单地说，将细胞以2×10的比例接种到上部腔室中⁵在无血清DMEM中每个腔室。外腔充满了与化学引诱剂相同的培养基，但含有胎牛血清。培养细胞48小时，通过擦拭Matrigel顶层去除非侵入细胞。用苏木精对含有侵袭细胞的膜进行染色并将其固定在载玻片上，并在光学显微镜下对含有侵袭细胞的整个膜进行计数。每个实验重复三次。

免疫荧光分析

分选出的ALDH1阳性和ALDH1阴性细胞在玻璃盖玻片上生长48小时，并固定在4%多聚甲醛（Sigma）中。免疫荧光染色如前所述(31)带有抗CD133的一级抗体（Miltenyi Biotec）。最后，在装有滨松9792-95数码相机（滨松）的徕卡显微镜（徕卡微系统）下对细胞进行检查和成像。

药物敏感性试验

将肺癌细胞以100μL/孔的速度接种在96个板中。恢复24小时后，将6种化疗药物，顺铂、吉西他滨、阿霉素、柔红霉素、长春瑞滨和多西他赛，以50%的抑制浓度添加到分选细胞和未分选细胞中。然后将细胞再培养24小时。根据制造商的方案，使用比色法3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲基氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四氮唑（Sigma）和内盐细胞增殖试验（Promega）测定灵敏度。如前所述测量吸光度并计算耐药性(32).

肿瘤细胞植入实验

每组五只无胸腺瑞士nu/nu/Ncr nu小鼠(数值/数值)小鼠皮下接种1×10剂量的ALDH1阳性和ALDH1阴性H358和H125细胞^三和1×10⁵分别是。观察小鼠4周，让肿瘤生长，然后在戊巴比妥（Sigma）深度麻醉下实施安乐死。手术切除肿瘤，其体积计算公式为：0.52×长×宽²将部分肿瘤组织固定在10%甲醛中，并包埋在石蜡中。包埋组织用H&E染色进行组织病理学检查，用FISH进行遗传特征分析。从其余的肿瘤移植物中获得分离细胞(33)然后采用Aldefluoro分析和FACS分析进行再分析。

FISH分析

特定探针FHIT公司，一种在肺癌中通常被删除的肿瘤抑制基因(34)，用绿色荧光染料标记，并用FISH在从肿瘤异种移植物制备的组织切片上进行测试，如前所述(34)。简单地说，3号染色体的着丝粒探针（Vysi）用红色荧光染料标记，用作内部对照探针。染色体3探针的着丝粒探针与FHIT公司杂交缓冲液中的探针（Vysi）。杂交过夜后，用徕卡显微镜（徕卡微系统公司）检查载玻片。

临床标本和免疫组织化学分析

为了确定ALDH1表达与非小细胞肺癌临床病理特征之间的相关性，我们首先通过支气管镜前瞻性采集96例患者的TBNA样本，其中包括36例无癌患者和60例肺癌患者(表1)。从每个TBNA样品中制备细胞离心载玻片，然后按照我们之前的工作所述将其固定在4%多聚甲醛中(35)。其次，我们从59例不同分期和组织学类型的非小细胞肺癌患者的手术切除肺组织中获得了组织芯片（Express Biotech）(32)。此外，为了评估ALDH1表达与非小细胞肺癌患者预后之间的关系，我们使用了肺组织微阵列，该微阵列由148例I期非小细胞肝癌患者的肿瘤标本组成，我们对这些患者有完整的病历和随访数据(36).

采用兔抗ALDH1多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology）和3,3′-二氨基联苯胺（Santa Cruz Bietechnologies）作为染色剂，对活检标本和组织芯片进行免疫组织化学染色。我们还在商业组织微阵列载玻片上用抗CD133抗体（Miltenyi Biotec）进行了免疫组织化学分析。每批幻灯片包含一个阳性对照和一个阴性对照。ALDH1样本的免疫反应评分是根据先前公布的标准确定的(15,19)。简言之，ALDH1染色的评分由两名经验丰富的研究人员独立完成，他们通过光学显微镜检查样本，并以盲法检查受试者的临床信息。染色强度根据以下等级评定：0=无可见染色，1=微弱染色，2=中度染色，3=强染色。ALDH1阳性细胞的百分比分为0%、<10%、10%至25%、25%至50%、50%至75%或更高。考虑到组织芯片上直径为0.6 mm的组织核心活检标本，我们在高功率（×400）下检查了每个组织点的整个区域。为了比较所有可用数据，将强度得分乘以细胞染色的平均百分比，为每个病例分配一个总得分。选择截止点，根据总得分将样本归类为ALDH1阳性或阴性。样本中ALDH1表达的细胞数≤10%，染色微弱（总分≤10%），视为ALDH1阴性样本。样本中有>10%的细胞表达ALDH1，染色微弱或更高（总分>10%）被视为ALDH1阳性。CD133样本的免疫反应评分是根据先前公布的标准确定的(37).

拨款支持：国家癌症研究所授予CA-126710、CA-CA137742和CA-133956，Wendy Will Case癌症奖，马里兰大学全州健康网络奖，美国癌症学会机构研究基金的种子资金，国家癌症研究院-早期检测研究网络的准会员奖，空乘医学研究所临床创新奖和马里兰大学医学院病理学系内部奖（F.Jiang）。