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《公共科学图书馆·病理学》。2014年10月；10（10）：e1004377。
2014年10月9日在线发布。 数字对象标识：10.1371/日志.ppat.1004377
预防性维修识别码：下午4点192593分
PMID：25299639

中和人抗体识别人巨细胞病毒糖蛋白B的结构基础

纳迪娅·斯宾德勒,#1 Uschi Diestel公司,#2 约阿希姆·D·斯塔姆,三 安娜·凯萨琳娜·威格斯,1 托马斯·温克勒,4 海因里希·斯蒂希特,三 迈克尔·马赫,1,*和伊夫·马勒2,*
蒂洛·斯特勒，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料
数据可用性声明

摘要

人类巨细胞病毒（HCMV）感染威胁着免疫系统受损或不成熟的人的生命。粘附后，病毒包膜与宿主细胞融合。在这一步中，病毒糖蛋白gB被认为代表主要融合子。在这里，我们首次提出了抗疱疹病毒抗体结合的结构数据，并描述了HCMV gB的抗原域Dom-II与人抗体SM5-1的Fab片段之间的原子相互作用。晶体结构表明SM5-1几乎完全结合Dom II通过只有两个CDR，即轻链CDR L1和22个残基的重链CDR H3。SM5-1以Dom-II的两个相邻片段为靶点，结合位点包括Dom-II表面上的疏水囊，仅部分被CDR H3残基填充。SM5-1属于一系列序列同源性抗-HCMV gB单克隆抗体，在同一时间点从同一供体分离，代表不同的成熟状态。结合分子动力学模拟对这些抗体中的氨基酸替换进行分析表明，SM5-1的微粒体亲和力的关键贡献者并不直接与抗原相互作用，而是通过分子内侧链显著降低了CDR H3在SM5-1结合和非结合状态下的柔韧性互动。因此，这些残基很可能缓解与超长CDR H3s相关的不利结合熵，这可能是抗体成熟期间的一种常见策略。不同构象状态下的整个HCMV gB模型表明，SM5-1通过阻断gB融合前到融合后的过渡或通过阻止与其他效应器（如gH/gL复合物）的相互作用来中和HCMV。

作者摘要

人巨细胞病毒（HCMV）属于β-疱疹病毒家族。HCMV感染不仅威胁免疫系统受损的人的生命，而且也是新生儿先天缺陷最常见的病毒原因。因此，1999年，美国医学研究所将HCMV疫苗的开发列为重中之重。几乎所有感染者都会产生针对包膜蛋白gB的抗体，该蛋白在感染过程中起着关键作用。在这里，我们描述了病毒中和抗体SM5-1片段与gB抗原决定簇（即Dom-II）复合物的晶体结构。结构表明，抗原-抗体相互作用集中在SM5-1的两个CDR内。计算方法和对来自同一血统的额外抗体序列的分析表明，在不直接接触抗原的情况下，使超长CDR H3环变硬的残基对高亲和力结合有额外的关键贡献。我们认为，这种间接贡献的优化代表了抗体成熟过程的一个普遍但被低估的原则。此外，我们的数据表明，SM5-1的中和作用要么源于阻止膜融合，要么源于防止gB与其他包膜蛋白的相互作用。

介绍

人巨细胞病毒（HCMV）属于β-疱疹病毒家族，是临床上重要的病原体。虽然在具有功能性免疫系统的宿主中感染通常是无临床症状的，但该病毒可在免疫系统不成熟或受到抑制的个体中引起显著的发病率和死亡率。因此，该病毒仍然是移植受者潜在的严重临床并发症[1]先天性HCMV感染也是儿童神经系统疾病最常见的感染原因[2]因此，开发HCMV疫苗被视为首要任务[3].

疱疹病毒通过级联的分子相互作用进入细胞，最终导致病毒包膜与靶细胞膜融合。在最初的步骤中，病毒通过与硫酸乙酰肝素蛋白多糖的非特异性低亲和力结合附着到靶细胞表面，在随后的步骤中与更特异、更高亲和力的受体相互作用（有关综述，请参阅[4]). 虽然一些疱疹病毒的细胞受体及其病毒配体的特征已经很清楚，但HCMV的情况还不太清楚。在宿主方面，不同的分子如整合素[5]、表皮生长因子受体[6]或PDGF-α受体[7]已经被假定为特异性受体。在这些研究中描述的HCMV的病毒配体在所有情况下都是糖蛋白B（gB）。然而，其中一些发现也受到了质疑[8],[9].

受体结合启动一系列事件，使病毒和细胞膜融合。疱疹病毒的核心融合复合物通常由gB和gH/gL组成（综述于[10]). 对于HCMV，gH/gL相关蛋白如gO或UL128-131复合物决定了细胞的嗜性和/或进入方式[11],[12]成纤维细胞的融合发生在质膜上[13]而内皮细胞/上皮细胞在内吞室中融合而感染[14],[15]，表明融合复合体在不同pH环境中具有功能。某些细胞类型的HCMV感染也可能涉及类似大胞饮症的事件，这突出表明总体情况相对复杂[8],[16].

目前的共识是，在核心融合复合体中，gB代表实际的融合原，而gH/gL作为辅助蛋白发挥作用，激活gB。单纯疱疹病毒1型（HSV-1）和EB病毒（EBV）gB的晶体结构表明，gB与其他无关病毒（如VSV-G和杆状病毒gp64）的III型融合蛋白具有结构相似性[17]–[21]这些数据表明，目前可用的gB结构代表蛋白质的融合后形式而不是融合前形式，尽管这一点尚未得到证实。与VSV-G类似，在融合后和融合前形式的结构可用的情况下，gB将经历从病毒包膜中的最初融合形式到病毒与宿主细胞膜融合后发生的最终融合后形式的构象转变[19],[20].

gB在融合事件中的中心作用使gB成为宿主防御机制的主要目标。事实上，几乎所有HCMV感染者都会产生抗gB抗体，HCMV恢复期患者血清的中和能力与抗gB的抗体滴度相关[22],[23]由于其高免疫原性，HCMV gB被选为疫苗抗原，并使用重组产生的gB蛋白进行了II期临床试验。血清学阴性的女性或肾移植受者都能看到部分保护作用[24],[25].

我们最近从健康HCMV血清阳性供体中分离出一组抗gB的人单克隆抗体（mAb），靶向gB中的两个新抗原域（AD），称为AD-4和AD-5[26]一些针对AD-4或AD-5的抗体在在体外化验[26]这些抗体在感染的吸附后步骤中有效，中和不同的病毒株，重要的是以类似的效率阻断不同类型的靶细胞的感染，如成纤维细胞、上皮细胞和树突状细胞[26]因此，这些抗体可以被认为具有广泛的中和作用。针对AD-4的SM5-1被确定为该小组中最有效的中和mAB。AD-4在结构上对应于HSV和EBV同源gB蛋白晶体结构的结构域II（Dom-II）[17],[18]Dom-II的折叠与PH结构域的折叠相似，在III型融合蛋白的所有晶体结构中，Dom-II由不连续的蛋白质序列形成，在HCMV AD169株中包含gB的121-132和344-438氨基酸[26],[27]有趣的是，在HSV病例中，发现与Dom-II结合的抗体不仅能中和HSV，同时还能阻断与gH/gL的相互作用[28]由于Dom-II的序列在不同HCMV分离株之间高度保守，并且gB与gH/gL的相互作用是激活所有疱疹病毒中融合机制的先决条件，通过分子效应器阻断这种相互作用似乎是一种很有希望的预防感染的策略。

在这里，我们报道了中和抗体和疱疹病毒包膜蛋白结构域之间复合物的第一个晶体结构，即AD-4特异性单克隆抗体SM5-1的Fab片段与分离的HCMV gB-Dom-II复合物。结构表明，轻链互补决定区1（CDR L1）内的微粒体结合簇的分子决定簇主要位于抗体的异常长重链CDR H3内。来自同一种系的额外抗体克隆的比对，结合结构分析和分子动力学（MD）计算，突出了体细胞成熟过程的重要结构方面以及伴随出现的高亲和力抗体。我们希望我们的研究结果能够为基于结构的抗HCMV疫苗设计提供信息。

结果

HCMV gB-Dom-II与SM5-1 Fab复合物及分离蛋白的晶体结构

HCMV gB中的Dom-II工程变体的晶体结构与抗体SM5-1的抗原结合片段（Fab）以2.1º的分辨率进行复合求解(表1,图1). 此外，工程Dom-II和SM5-1 Fab碎片的结构分别以1.8和1.9º的分辨率进行了求解(表1,图2). 在工程化的Dom-II片段中，HCMV gB的残基112–132和344–438通过人工的5残基长连接子片段连接，以产生一个序列相关的Dom-III结构域(图2)[26]虽然未结合Dom-II结构中的连接子残基和一些N端和C端残基没有可见的电子密度，但整体结构与全长gB蛋白的不连续Dom-II的结构相比很好[18]当考虑所有常见主链原子时，工程化非结合HCMV Dom-II的结构与Dom-II和HSV-1 gB的结构不同（PDB条目：2gum[18])相对误差为1.7º，与Dom-II和EBV gB（PDB条目：3fvc[17])偏差为1.5Å。这些偏差与序列差异的预期非常吻合。而HCMV和HSV-1 gB之间的总序列一致性为28%（UniProt序列P06437 vs P06473[29])，相应Dom-II片段之间的同源性为34%（HCMV gB残基119–132和344–438与HSV-1 gB残基142–153和364–459）。HCMV gB Dom-II在融合前或融合后的形式（PDB条目2j6j和2cmz）与类似的VSV-G Dom-III的比对明显较差[19],[20]). 此处，r.m.s.偏差范围为3.1至3.3º。

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通过抗体SM5-1识别HCMV gB-Dom-II。

（A） HCMV糖蛋白B（gB）的三元模型源自同源HSV-1 gB蛋白（PDB ID 2gum，[18]). 在不同的gB域中，Dom-II以绿色突出显示。标记Dom-II表达结构的N-（Thr-112）和C-末端（Ser-438）氨基酸。虚线表示在HSV-1gB的晶体结构中未解析的区域，因此被排除在模型之外。（B） Dom-II-SM5-1 Fab复合物的卡通表示，原子分辨率为2.1º。Dom-II为绿色，SM5-1轻链和重链分别为红色和蓝色。重链的CDR环以橙色显示，轻链的CDR-环以黄色显示。gB的两个片段（残基112–132和344–438）通过人工连接子片段融合在一起，以获得序列相似的Dom-II蛋白[32].（C）抗原结合位点的俯视图，其中Dom-II的结构在介绍中被省略。颜色如（B）所示。CDR回路标记为L1至L3和H1至H3。（D） 2mFo-DFc图在1σ处形成等高线，并在任何CDR H3原子周围2.5°范围内显示。在抗原结合结构中的整个H3环中观察到相邻的电子密度。（E） SM5-1抗原结合位点的表面表征，如（C）所示。以白色显示的是SM5-1的表面积，在抗原结合后被掩埋。

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未结合Dom-II和SM5-1的晶体结构。

（A） 未绑定工程Dom-II的卡通表示以1.8º的分辨率求解。人工引入的连接剂氨基酸没有观察到电子密度（灰色虚线）。（B） 未绑定Fab SM5-1的卡通表示以1.9º的分辨率求解。重链和轻链分别用蓝色和红色表示。CDR回路用橙色（H1至H3）或黄色（L1至L3）表示。在游离SM5-1结构中，无法追踪残基H3 107和111之间的多肽链以及重链残基145到152。（C） Dom-II在未结合状态（绿色）和Fab SM5-1-结合状态（黑色）下的叠加。（D） Fab SM5-1在未结合状态（彩色）和Dom-II结合状态（黑色）下的叠加。变量域被叠加，叠加表明两种结构之间的差异仅限于CDR H3和弯头角度的变化（用箭头表示）。（E） 特写显示未结合Dom-II晶体结构中剩余的正mFo-DFc差异电子密度。密度在3σ水平上呈等高线分布，并延伸至晶体的两倍轴（黑色椭圆形）。

表1

结晶数据收集和精炼统计。
数据统计gB Dom II公司SM5-1工厂Dom-II-SM5-1 Fab综合体
波长（Ω）0.918410.918410.91841
X射线源、探测器Bessy BL14.1，Rayonics MX-225 3×3 CCDBessy BL14.1，Rayonics MX-225 3×3 CCDBessy BL14.1，Rayonics MX-225 3×3 CCD
“空间”组第6页122第4页1212第2页1
单元单元参数a=b=89.9Å，c=75.7Å，α=β=90°，γ=120°a=b=92.6°，c=124.6°，α=β=γ=90°a=43.1º，b=69.4º，c=101.0º，α=γ=90°，β=99.7°
马修斯系数（Ω三/Da公司−1)3.042.552.35
分子数/ASU111
溶剂含量（%）595147
分辨率（Ω）+ 1.76 (1.81–1.76)1.87 (1.98–1.87)2.11 (2.16–2.11)
反射次数（唯一）18,070 (1,297)45,558 (7,187)33,553 (2,475)
冗余+ 10.7 (11.1)8.1 (8.2)3.2 (3.2)
完整性（%）+ 98.1 (97.2)99.9 (99.2)98.5 (98.6)
平均值我/(σ我)+ 26.04 (3.1)27.8 (5.8)12.4 (2.3)
R（右） sym（对称）(%)+ 5.3 (93.5)5.9 (40.2)7.7 (65.9)
威尔逊B因子（λ2)34.330.339.9
精炼统计
最终 R（右） -系数（%）
工作集20.1818.6018.02
工作集+测试集20.3118.8318.31
免费R（右）-系数（%）# 22.8223.1523.76
R.m.s.偏差
粘结长度（Ω）0.0100.0190.017
结合角（°）1.3872.0341.86
平均B值（Ω2)
蛋白质原子36.330.3（重链），29.0（轻链）38.1（Dom-II）、37.0（重链）、39.0（轻链）
溶剂/附加分子41.5（溶剂分子）33.3（溶剂）、39.8（甲酸盐）、29.4（钠+原子）39.9（溶剂）、66.5（Hepes分子）、39.2（乙二醇）
各向异性总体比例因子2)
B11、B22、B330.33, 0.33, −1.08−0.10, −0.10, 0.210.76, −0.87, 0.07
B12、B13、B230.33, 0.0, 0.00.0, −0.0, 0.0−0.0, 0.22, −0.0
蛋白质原子数9631723（重链）、1619（轻链）904（Dom II）、1738（重链）、1591（轻链）
附加分子/原子数76386（溶剂），7（甲酸分子），2（钠+原子）243（溶剂），1（HEPES分子），3（乙二醇分子）
Ramachandran图（%） ##
首选区域/允许/异常值98.9/1.1/0.096.3/3.2/0.595.4/3.9/0.7
+括号中的数字表示最高分辨率外壳。
#5%的反射被选择为R（右） 自由的设置。
##用程序COOT计算[67].

HCMV gB-Dom-II折叠成一个全反平行β-片三明治，由一个4股和一个5股的β-片组成，两个β-片的方向几乎成直角。五圈长的α-螺旋将5股β-片中的两条β-链相互连接。如前所述，Dom-II的结构域拓扑类似于pleckstrin同源（PH）结构域，但需要注意的是，上述α-螺旋在PH结构域中不存在[18],[30]此外，PH结构域显示一个替代的α-螺旋，即在最后一条β-链之后。EBV gB和之前的HSV-1 gB结构（PDB入口2gum）中缺少该螺旋[17],[18]然而，在HSV-1 gB的较新晶体结构中，这种PH畴状螺旋段从Dom-II延伸而来（残基463-475，PDB条目：3nwf）[31]应注意的是，此处报告的HCMV gB-Dom-II结构中不存在螺旋延伸，因为相应的残基（442-454）不包含在工程Dom-II中[32]此外，与HSV-1 gB相比，HCMV gB在位置459后翻译后裂解，这可能会影响局部结构[33],[34].

通过DALI搜索可以识别出结构上最接近的PH结构域是Rho GTPase激活蛋白27（ArhGAP27，PDB条目3pp2）。当计算115个可能的等效Cα位置中的75个时，r.m.s.偏差高达3.0Ω[35]到目前为止，还没有迹象表明疱疹病毒中的Dom-II使用PH域中观察到的任何典型配体相互作用位点结合磷酸酪氨酸、聚脯氨酸螺旋或磷酸肌醇头部基团[30]据我们所知，这也延伸到蛋白质相互作用模式[30]有趣的是，关于Dom-II可能参与蛋白质-配体相互作用，我们观察到HCMV gB的Dom-II面上存在大量的剩余正差电子密度，即接近Arg131和Glu422(图2E). 虽然不能从结晶溶液的组成推断配体的身份，但电子密度的细长形状表明配体可能对应于肽。配体横跨Dom-II中的疏水口袋，令人惊讶的是，抗体-抗原复合物结构中的抗体SM5-1的CDR H3也以同一口袋为靶点（见下文）。

未结合SM5-1的结构类似于其他Fab片段的结构。在复合物形成后，SM5-1或Dom-II中没有发生明显的构象变化，但SM5-1的CDR H3构象和弯头角度变化除外(图2D). 在复合物中，CDR H3参与了与Dom-II的广泛接触，并且在电子密度图中清楚地定义了CDR H三中的所有残基(图1D). 总的来说与Dom-II和SM5-1的束缚结构非常低。V的范围为0.27ºH（H）-V（V）L（左）Dom-II的域对SM5-1至0.33Ω，C的域对为0.72Ω上半年-C类L（左）SM5-1的结构域对。复合物形成后，SM5-1的可变域和恒定域之间的肘角从自由态的170°变为束缚态的195°(图2D)[36].

抗原识别的分子决定因素

对抗原-抗体结合位点的检测表明，HCMV gB-Dom-II识别主要实现通过异常长的重链CDR H3，具有来自CDR L1的额外贡献(图1E,图3). 775º的总溶剂可及表面积2被SM5-1埋藏在复杂界面中，H3贡献515欧2（66.5%）和L1 210º2(27%) (图S1). 虽然在结合后观察到附加CDR中的残基的表面可及性变化，但CDR L3、H1和H2中没有残基与Dom-II直接接触，这是根据原子间距离截止值>3.5º判断的，CDR L2仅为(图3,4A和C).

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Dom II和SM5-1之间的接触以及相关抗体的CDR的比对。

黑线表示分子间距离小于3.5º。完整报告了Dom-II序列，而对于SM5-1，仅显示了CDR和框架残基Lys67的氨基酸序列。星号表示复合物中工程Dom-II发生突变。提供高度相关抗体的CDR序列，并将其列在SM5-1序列的上方或下方。序列不同的氨基酸以红色突出显示。被取代的SM5-1残基生物信息学对分子动力学模拟进行了强调。

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Dom-II-SM5-1 Fab重组现场的详细信息。

（A） CDR H3和Dom-II残基359-EAED-362之间的侧链特异性相互作用。氢键距离单位为奥。（B） 重点研究SM5-1和Dom-II残基379-KQEVN-383之间的相互作用。（C，D）SM5-1 Fab和Dom-II段359-EAED-362（C）和379-KQEVN-383（D）之间形成的交互作用的替代表示。<3.5º距离内的氢键用黑色表示，>3.5º用灰色表示。（E） CDR H3中的残基Leu109屏蔽Dom-II中的疏水囊。疏水空腔中的侧链（虚线圆圈）显示为棒状模型。灰色圆点突出显示Dom-II的段359-EAED-362和379-KQEVN-383。

在抗体-抗原结构中，CDR H3几乎总是对抗原结合位点贡献最广泛的表面积，然而，只有六分之二的CDR几乎完全实现抗原结合的情况仍然不常见[37]SM5-1中的抗原识别让人想起C05-Fab片段对甲型流感I类融合蛋白血凝素的识别[38]这里，24个残基长的H3环从抗体表面延伸，与H1结合，足以进行抗原识别。对于SM5-1，抗原识别还包括来自框架残基3A的贡献，即轻链的Lys67(图3).

Dom-II中被SM5-1簇优先识别的残基位于两个相邻肽段内，即359-EAED-362和379-KQEVN-383(图3和​和4）。4). 虽然359-EAED-362主要与轻链CDR L1相互作用，但379-KQEVN-383与CDR L1-优先与CDR H3参与广泛和扩展的氢键网络(图4A-D). SM5-1还可以识别Dom-II表面上的高度疏水性口袋。这个口袋位于我们在未结合的Dom II结构中观察到残余正差电子密度的相同位置(图2E). CDR H3片段105-SNSGLSLL-112通过该口袋的开口结合，Leu109的侧链指向口袋(图4E). 然而，Leu109似乎无法完全填满这个口袋(图S2A). Leu109接触通过许多氢键相互作用与周围溶剂隔离，这些作用主要涉及CDR H3中相邻丝氨酸和亮氨酸残基的主链原子。这些亲水接触还包括Dom-II残基Arg131和CDR H3残基Ser107之间的双齿相互作用，这似乎稳定了CDR H三的构象(图4D). 总的来说，含有CDR H3残基Leu109的相互作用斑块的原子结构与蛋白质相互作用热点的典型结构相似[39].

在先前的诱变研究中，残基Tyr364和片段378-KKQE-381被确定为一系列SM5-1相关抗体结合和中和活性的关键决定因素[32]两个残基Tyr364和Lys379对SM5-1结合（YK-motif，[32]). 在复合物的结构中，Lys379起着中心作用，因为它与Glu359一起是唯一接触CDR L1和H3的Dom-II残基(图3,图S2B). 相反，Tyr364不直接与SM5-1结合。它位于Dom-II残基Glu359和Lys379的直接空间邻近位置，并将Lys378的侧链与周围的水分子屏蔽。其作用可能是帮助确定与SM5-1直接相互作用的关键Dom-II残基的方向(图S2B). 总的来说，这里提供的结构数据与之前报道的突变分析非常一致[32].

体细胞选择和成熟过程的结构决定因素

SM5-1属于在单个时间点从单个供体中分离出的一系列抗HCMV gB单克隆抗体[26]所有克隆都是相关的，即来源于一个在生发中心反应期间通过体细胞突变和选择进行克隆多样化的B细胞。由于在复合物结构中与抗原相互作用的所有残基在这些克隆中基本上是保守的，因此可以合理地假设Dom-II再识别的结构模式在这些抗体中是保守的(图3). 抗HCMV gB的单个抗体的结合亲和力相差两个数量级以上，SM5-1的亲和力最高(表S1)[26],[32]后一个观察结果与SM5-1是该家族中最成熟的抗体这一事实相一致，因为与种系序列相比，SM5-1显示出最大数量的突变(图3). 当比较解离常数与相关单克隆抗体的中和活性时，可以观察到明显的相关性。然而，中和活性的增加程度与结合亲和力的增加程度不同，这表明在生发中心反应中发生的亲和力成熟并不能直接转化为更好的中和HCMV活性。有趣的是，抗体的失活率（即解离率）与其中和活性最为相关。

在SM5-1中，CDRs L1和H3以及CDRs L3、H1和H2明显从种系序列中经历了亲和力成熟(图3). 然而，在晶体结构中，后三个CDR不与Dom-II相互作用。这增加了这些CDR有助于增强SM5-1的中和活性，并与重组Dom-II中不存在的部分gB或甚至其他病毒成分相互作用的可能性。为了检验这个假设SM5-1胚芽生成了一个SM5-1衍生物，其中CDR H1、H2和L3被还原为各自的种系序列(图S3). 在中和试验中，我们无法检测到SM5-1和SM5-1之间的任何差异胚芽，表明未与重组Dom-II接触的CDR中的亲和力成熟对SM5-1的中和活性没有可测量的影响(图5). 这些数据进一步强化了SM5-1的中和能力完全取决于DomII和SM5-1之间的相互作用模式的概念，该模式已在晶体中绘制。

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SM5-1和部分细菌转化SM5-1的中和能力胚芽.

病毒与抗体预孵育1小时，成纤维细胞感染病毒-抗体混合物。感染后4小时更换培养基。如前所述，以相对光单位（RLU）测量感染后24小时的荧光素酶活性，并计算中和百分比[26]所示为来自两个独立实验的一个数据集。

上述数据还表明，SM5-1的亲和成熟残基（不接触Dom-II）可能对稳定抗体本身的结构起作用。对SM5-1结构的检查表明，确实有几个相应的残基形成紧密的分子内相互作用，包括CDR H1的Lys30、Asp31和His32。例如，CDR H1的His32与位于长CDR H3 N端的Asp99接触。CDR H3残基His115、Asn116、Arg117的额外极性相互作用进一步稳定了该区域。后一种残基在SM5-1亲和成熟过程中出现，也不会与抗原形成直接相互作用。为了更详细地研究这些极性残基的作用，对SM5-1和6倍的SM5-1进行了分子动力学（MD）模拟生物信息学替换变体SM5-1*，其中CDR H1和H3的各自残基被替换，以匹配结合低亲和力Dom-II（重链K30T、D31G、H32T、H115Y、N116D和R117V）的未成熟SM1-6的序列。

SM5-1和SM5-1*的动力学比较表明，取代主要增强了长CDR H3环的灵活性，这对于残基104–113最为显著(图6). 在模拟时间内收集的结构叠加也显示出SM5-1*的CDR H3与Dom-II结合构象的更显著偏差，该构象是模拟的起始结构(图6B、C).

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SM5-1和SM5-1*的构象灵活性。

（A） 每个残基的均方根波动（RMSF）图，表明SM5-1*（红线）中残基102–112（CDR H3）的灵活性比SM5-1（黑线）增强。SM5-1和SM5-1*之间不同的序列位置用黄色星号标记。（B，C）在SM5-1（B）和SM5-1*（C）的模拟时间内，每隔20 ns收集6个结构的叠加。请注意，SM5-1*中的CDR H3环路表现出更高的灵活性，并进一步偏离作为起始结构的Dom-II结合构象。SM5-1和SM5-1*之间不同的六个残基如棒状图所示，一个粉红色箭头指向CDR H3回路。

SM5-1*中CDR H3的更高灵活性可归因于CDR H3锚定区域中重要稳定侧链相互作用的损失。例如，在SM5-1中，Asp99由多个氢键固定，侧链为His32、Tyr113和His115，主链为Tyr33和Asn116(图S4). 由于His32和His115被酪氨酸取代，CDR H3的N端和C端的紧密相互作用网络丢失，导致长连接环失稳。从非结合SM5-1的结构开始，在控制MD模拟中也检测到了相同的效果(图S5). 因此，SM5-1中许多亲和力成熟残基的具体作用似乎不是与Dom-II直接相互作用，而是稳定CDR H3的结合活性构象。

讨论

SM5-1亲和力成熟涉及长CDR H3环的分子内稳定

对SM5-1与gB-Dom-II复合物的结构分析表明，突变残基的很大一部分并不与Dom-II直接相互作用。MD模拟为这一令人费解的发现提供了功能性解释，并表明这些残基在SM5-1 CDR H3环路本身的稳定中发挥了作用。以前曾报道过分子内CDR H3对抗体的稳定作用，可以通过形成氢键β发夹、二硫键或增加脯氨酸来实现[40],[41]所有这些结构特征都有望增强刚性，这将减少抗原识别时的熵变化，从而产生更高的结合亲和力。

长CDR H3s经常表现出延伸的β发夹结构，如HIV-1 gp120结合抗体10-1074或PGT122[42],[43]SM5-1的CDR H3采用扩展构象，但不显示规则的β发夹结构。因此，通过主链氢键获得分子内稳定的能力相当有限；然而，这通过侧链氢键的额外稳定作用得到了补偿。血凝素结合人类mAB C05的长CDR H3中也存在类似的主链和侧链氢键组合，类似于锤头拓扑[38]与SM5-1的情况一样，C05的CDR H3构象在抗原结合后没有显著变化，这表明长CDR H4环的分子内稳定通过减少相互作用引起的熵损失有利于抗原结合[38].

与可由任何氨基酸形成的主链氢键不同，侧链氢键的形成需要具有功能性侧链基团的不同氨基酸的存在。因此，抗体成熟期间极性残基的出现可能反映了分子内稳定性的增强，并不一定意味着相应残基与抗原形成相互作用。

因此，这一观察结果也对其他研究领域产生了影响：首先，它强调了通过对接方法预测正确的抗体-抗原结构的困难。这些方法经常将亲和力成熟过程中出现的所有残基视为界面的一部分。因此，在类似SM5-1的情况下，这种方法会因产生错误的复杂几何形状而失败。其次，从SM5-1推导出的结构原理也可能影响抗体优化过程中考虑的残基的选择（例如噬菌体展示）。

Dom-II-SM5-1复合体可以很容易地叠加到整个gB的模型上，而不会发生冲突

对于任何病毒融合蛋白，假设HCMV gB采用两种不同的构象状态，即融合前构象和融合后构象。此外，从融合前状态过渡到融合后状态有望促进病毒包膜与宿主细胞膜的融合。然而，就gB蛋白而言，在过渡过程中构象重排的确切程度尚不清楚。目前，gB蛋白的晶体结构仅在HSV-1和EBV中可用[17],[18]这些晶体结构被认为显示了融合后构象。只有在一种更为远缘相关的III类融合蛋白，即来自VSV的蛋白G的情况下，融合前和融合后的构象才得到了实验表征[19],[20],[27]为了可视化SM5-1如何识别整个HCMV gB，我们考虑了两种gB模型，一种是从HSV-1 gB（融合后状态）的晶体结构推导而来的，另一种是根据VSV-G的融合前构象建模的([26]和数据未显示）(图7).

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SM5-1 Fab能够结合整个三聚体HCMV gB的融合前和融合后模型。

（A） 根据VSV-G（PDB ID 2j6j，[19],[26]). （B和C）SM5-1 Fab的两个正交视图与gB的预熔构象相结合。（D） 根据HSV-1 gB（PDB ID 2gum，[18]). （E和F）SM5-1与gB融合后构象结合。箭头连接面板A到C表示HCMV gB从融合前模型到融合后模型的构象转换。连接面板A和B以及D和E的箭头表示SM5-1绑定。Trimeric gB以曲面表示形式显示，颜色为白色、灰色和黑色，gB Dom-II以绿色突出显示。SM5-1 Fab以卡通形式展示。

在由HSV-1 gB晶体结构导出的HCMV gB模型中，抗体结合表位可从溶剂中完全获得[26]SM5-1与Dom-II的结合模式可以很容易地转移到整个gB上，没有明显的空间位阻(图7D、E和F). 如果Dom-II被额外的α-螺旋延伸，这也适用，该α-螺旋在HSV-1 gB的近期晶体结构中可见，并且之前由于高度灵活性和/或蛋白水解裂解而缺失[18],[31]。由于HCMV gB在生理上被切割，因此尚不清楚这种螺旋是否会在HCMV中实际形成体内在这一段之后（见上文）。相应的片段也缺少可将该片段锚定到Dom-II核心结构的多个疏水残基。然而，如果将这种螺旋添加到gB-结合的SM5-1模型中，则可能会产生额外的抗体-抗原相互作用，即SM5-1的CDR L3和gB之间(图S6). 相比之下，L3在当前晶体结构中不参与Dom-II结合。总的来说，SM5-1与Dom-II复合物中观察到的抗原结合模式与HCMV gB结构完全兼容，该结构是根据HSV-1 gB中观察到假定的融合后构象建模的。最近的电子显微镜研究进一步支持了这种结合模式，研究表明，将HSV-2 Dom-II特异性单克隆抗体C226添加到HSV-2 gB中，产生的电子显微镜图像完全符合HCMV gB与SM5-1复合物融合后的模型[44]此外，SM5-1对分离的重组Dom-II和整个HCMV gB的解离常数非常相似，强烈反对Dom-II制剂中gB上存在的额外表位缺失的事实[26].

如果考虑到HCMV gB的潜在糖基化位点，该协议也适用。作为一种成熟蛋白质，gB由一个经蛋白质水解处理的双链二硫键蛋白（残基1–459和460–906）组成，在SDS-PAGE实验中，N末端代表一个扩散迁移带，表明糖基化对其有显著影响[33],[34]基于计算机的潜在N-连接糖基化位点分析显示，N末端部分有8个位点，而C末端部分不包含预测位点，这与SDS-PAGE中定义的迁移带一致。向gB模型中添加复杂的N-连接聚糖仍然允许SM5-1不受限制地访问Dom II的抗体结合表位(图S7).

由于HCMV gB和VSV-G之间的序列同源性显著降低，从VSV-G晶体结构导出的HCMV gB模型不如HSV-1 gB导出的模型可靠。然而，VSV-G和HCMV gB的Dom-II片段之间的整体结构相似性可以很容易地识别，即使各自的域重叠很差（见上文）。当基于VSV-G的融合前构象对HCMV gB进行建模时，Dom II抗体结合表位仍然是可接近的，并且与SM5-1复合的Dom II的晶体结构可以再次叠加在VSV-G衍生的HCMV gB模型上，而没有任何严重的冲突(图7A、B和C). 因此，从这些模型可以得出结论，SM5-1应该能够识别整个gB，而不管gB是否采用与HSV-1 gB中观察到的融合后构象或VSV-G的融合前构象类似的构象。

用重组gB分离SM5-1和相关抗体，表明在真核生物生产过程中，gB的截短外结构域优先采用融合后构象，该构象也非常稳定[45],[46]然而，如传统中和试验所示，SM5-1可以与细胞外病毒结合，这一事实表明SM5-1也与gB的融合前构象结合体内与上述gB-binding模型一致。

SM5-1的潜在作用模式

SM5-1在连接后状态中和HCMV[26]因此，可以排除SM5-1仅仅阻断病毒与宿主细胞的附着。此外，SM5-1 Fab片段显示出与完整IgG相似的病毒中和能力，表明中和不需要病毒表面的gB交联（N.Spindler，未发表的结果）。目前尚不清楚SM5-1结合后病毒进入途径的哪一步被阻断。一种可能性是，SM5-1通过阻止gB与gH/gL的相互作用来阻止活性融合复合体的形成。与我们之前关于HCMV gB的出版物一致，Dom-II被确定为中和HSV gB抗体的关键靶点[28],[32]Atanasiu等人报告了HSV-1的抗Dom-II抗体能够抑制细胞间融合并阻断gB与gH/gL复合物的相互作用[28]SM5-1占领gB中的gH/gL结合位点可能会干扰gB-gH/gL相互作用。类似的作用方式是否会导致游离病毒的中和尚待证明。值得注意的是，在EBV gB域的情况下，III、IV和V被假定为gH/gL相互作用域[47].

作为阻断gH/gL结合位点的替代方法，SM5-1还可以通过抑制gB从融合前状态到融合后状态的转变来中和HCMV，从而阻止膜融合。虽然SM5-1对gB融合前状态的亲和力目前尚不清楚，但间接证据和上述衍生模型表明，SM5-1能够与gB融合前后构象形成热力学稳定的配合物。然而，这并不排除SM5-1与gB的结合能够动态抑制构象转变。由于缺乏关于融合复合体如何在病毒包膜上激活的数据，SM5-1的中和机制仍有待进一步研究。

使用重组产生的gB疫苗接种不能完全预防HCMV感染/疾病[24],[25]。原因不明。当在传统的成纤维细胞检测中分析血清时，疫苗诱导的gB结合和病毒中和抗体与自然感染相当，而当将上皮细胞用作靶细胞类型时，特异性中和活性平均比自然感染后观察到的活性低15倍[48]此外，在天然HCMV感染者和接种了gB疫苗的个体之间，发现抗体在识别gB上单个抗原域方面的特异性不同[49]这可能再次与gB存在于融合前和融合后构象中这一事实直接相关，这两种构象可能存在很大差异。接种gB可能会产生识别融合后状态的抗体，其亲和力高于融合前状态，而在自然HCMV感染期间可能会出现反向抗体结合偏好。目前的技术允许在感染和接种后对单个抗体库进行比较分析，这可能为未来优化基于gB的疫苗提供有价值的信息。

显然，还需要进一步的研究来确定SM5-1究竟如何阻断病毒进入机制。很明显，这里提出的晶体结构将有助于进一步探索HCMV的融合前后状态。然而，更重要的是，这里提供的结构见解为基于结构的HCMV疫苗设计打开了一扇机会之窗。

材料和方法

重组Dom-II蛋白的制备与纯化

为了表达Dom-II工程变体的GST融合蛋白，其中HCMV gB蛋白的残基112至132和344至438通过5残基长的人工连接序列连接，将相应的编码序列克隆到pGEX-6P-1质粒中（GE Healthcare）如前所述，用表达载体转化DH10B细菌[32].融合蛋白从大肠杆菌在室温下与谷胱甘肽Sepharose 4B（GE Healthcare）孵育2小时后的裂解物。通过用PBS洗涤去除未结合的细菌蛋白，并用10mM还原型L-谷胱甘肽洗脱蛋白。为了去除GST部分，使用PreScission蛋白酶（GE Healthcare）在4°C下孵育5 h，以蛋白质水解方式切割结合的Dom-II融合蛋白，并洗脱Dom-II部分。为了进一步纯化20 mM Tris中的阴离子交换色谱，使用HiTrapQ FF 1-ml色谱柱（GE Healthcare）在KTApurifier上进行pH 8.0，然后在HiLoad 16/60 Superdex75色谱柱上进行体积排阻色谱，使用150 mM NaCl，pH 7.4。

SM5-1 Fab片段的制备及抗原-抗体复合物的纯化

Fab片段是使用德国Thermo Scientific Pierce公司的Fab制备试剂盒通过木瓜蛋白酶消化SM5-1 IgG分子制备的。按照制造商的说明进行木瓜蛋白酶消化。使用HiTrap蛋白a HP 1-ml柱通过亲和纯化去除Fc部分和未消化的IgG分子（GE Healthcare）。使用HiLoad 16/60 Superdex200色谱柱，在20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 7.4中使用尺寸排除色谱作为Fab片段的最终纯化步骤。对于复合物的形成，纯化的SM5-1 Fab和Dom-II以1∶2的比例共同孵育(重量/重量)然后使用HiLoad 16/60 Superdex200色谱柱，在20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 7.4中进行尺寸排除色谱，以去除非络合蛋白质。

结晶和结构测定

使用悬滴蒸汽扩散法结晶工程Dom-II，并平衡含有蛋白质溶液（11.9 mg/ml Dom-II在20 mM Tris-HCl中，pH 7.5）和储层溶液（1.5 M Li）的1–4µl混合物2SO公司40.1 M Na-HEPES盐，pH 7.5），与700µl储层溶液的比例为1∶2.5或1∶3。SM5-1 Fab片段的结晶是通过坐滴蒸汽扩散装置实现的。将200 nl蛋白质溶液（9.7 mg/ml溶于20 mM Tris-HCl，pH 7.5）与200 nl储液溶液（4M甲酸钠）混合，并与储液溶液平衡。单个Dom-II和SM5-1 Fab的晶体在两天内在19°C下生长。在这两种情况下，晶体在液氮中闪蒸冷却，不添加冷冻保护剂。

采用坐滴蒸汽扩散法，在20 mM Tris-HCl（pH 7.5）中使用10至15 mg/ml的蛋白质浓度，并将200 nl蛋白质溶液与200 nl储层溶液混合，使gB与SM5-1复合物中的Dom-II结晶。为了增加获得该络合物衍射良好晶体的机会，我们用几种不同的Dom-II突变体在络合物中结晶SM5-1，这些突变体以与野生型Dom-II相似的亲和力结合SM5-1[32]然而，大多数配合物只产生了共生晶体，不适合进行X射线衍射实验。如果双突变体gB-Dom-II-I397A/N398A和SM5-1 Fab之间形成复合物，在19°C下将蛋白-受体混合物与70µl储液溶液（0.1 M HEPES，pH 7.5，0.2 M l-脯氨酸和24%PEG 1500）平衡一个月后，可以分离出单晶。复合物的晶体在转移到液氮中之前，用20%的乙二醇短暂浸泡。在晶体结构中，正如预期的那样，Dom-II中397和398位的残基不参与与SM5-1 Fab的相互作用(图3).

所有衍射数据集都是在柏林Hemholtz Zentrum BESSY同步加速器设施的PX光束线BL 14.1上使用0.5至0.6°旋转框架收集的，并使用程序XDS进行处理[50]所有三种晶体结构都可以通过在CCP4程序套件中使用PHASER程序进行分子替换来解决[51],[52]包含HCMV gB蛋白残基118至132和344至438的Dom-II的结构可以用基于HSV-1糖蛋白B对应Dom-II（残基142至152和364至459，PDB ID 2gum）的混合搜索模型求解。混合模型是使用结构基因组学联合中心SCRWL服务器生成的[53],[54].

人抗HIV-1 gp120反应性抗体E51（PDB ID 1rzf）的无关Fab片段用作SM5-1 Fab结构的搜索模型。在分子替换计算中，删除了CDR环等柔性部分，并分别考虑了可变结构域和恒定结构域。群1：残基109-210（CL）和114-214（CH1）；集合2：残基2–23、34–54、63–91、96–106（VL）和2–23，33–51、57–95、103–111（VH）。gB-Dom-II-SM5-1 Fab复合物结构是使用先前求解的单个蛋白质的晶体结构作为搜索模型求解的。在这里，SM5-1片段中的任何柔性区域都被删除，并且在SM5-1片断的分子替换搜索过程中，由可变域或恒定域组成的两个不同的集合。使用CCP4程序REFMAC5对所有结构进行细化，直到收敛，并且电子密度图中无法解释进一步的细节[52],[55]在最后的细化回合中，执行了TLS细化步骤，以改进模型与实验数据之间的拟合。

SM5-1 Fab片段的肘部角度通过AS2TS网络服务器使用以下免疫球蛋白域边界计算：VL（左）：残基1至110；V（V）H（H）：1至131，CL（左）：111至212和C上半年：132至232[36],[56]使用CCP4程序套件中的程序AREAIMOL，使用默认溶剂探针半径1.4º，计算可及表面积的变化[52]所有分子插图都是用PyMol程序生成的(http://www.pymol.org/引用). 使用NetNGlyc服务器预测潜在的N-连接糖基化位点[57].

SM5-1的表达胚芽变异和病毒中和

SM5-1和一种部分种系回复突变衍生物（SM5-1）的编码序列格恩)根据图S3.编码重链和轻链可变区的相应核苷酸序列由德国Life Technologies化学合成，并克隆到真核IgG表达载体中[58]为了产生IgG，293T细胞与各自的IgG重链和轻链表达载体质粒共同转染。在转染后8天收集细胞培养上清液，并使用HiTrap蛋白a HP 1-ml柱（GE Healthcare）在KTAP时间色谱系统（GE Heaulthcare）上纯化IgG。成纤维细胞和中和的病毒感染与Pötzsch等人2011年所述完全相同[26].

MD模拟

对SM5-1和6倍进行了分子动力学（MD）模拟生物信息学变异体（SM5-1*），其中交换了各自的残基，以匹配不太成熟的SM1-6（K30T、D31G、H32Y、H115Y、N116D和R117V）的序列。对于SM5-1和SM5-1*，从Dom-II配合物中的构象或未结合SM5-1的晶体结构开始，进行了两个独立的模拟。这导致了总共四次模拟。为了减少计算成本，只有VH（H）-V（V）L（左）模拟中包括Fab碎片的结构域（链H和链L的aa 1–131和1–110）。可滴定氨基酸的质子化状态由PROPKA计算[59]瑞士PDB查看器用于添加未解决的残基和侧链，以及用于氨基酸交换[60].

所有MD仿真均使用AMBER 11程序包和ff99SB力场参数进行[61],[62]蛋白质被放置在周期性截短的八面体水箱中，在溶质的任何原子和周期性水箱边缘之间至少有15度的溶剂。通过添加相应数量的Cl来中和系统−离子。最初，通过三步程序将所有四个系统最小化，然后按照之前制定的方案逐渐加热至310 K[63],[64]随后，以2 fs的时间步长和周期边界进行了100 ns MD模拟。Settle算法[65]用于约束涉及氢的共价键。使用AMBER Tools和VMD对获得的仿真数据进行分析和可视化[66].

加入号码

Dom II、SM5-1 Fab和Dom-II-SM5-1 Fab复合物的坐标和结构因子已分别以登录码4OSN、4OSU和4OT1存放在蛋白质数据库（PDB）中。

支持信息

图S1

Dom II和SM5-1之间界面中每个残留物埋置的可接近表面区域。复合物形成后，（A）Dom-II残基、（B）SM5-1轻链残基和（C）重链残基的可及表面积变化。Dom-II中的人工连接物残基用虚线标记，Dom-II用于复合物形成的突变I397A和N398A用星号标记。

（畅通节能法）

图S2

SM5-1和Dom-II之间交互的详细信息。（A） CDR H3残基Leu109不能完全填满Dom-II表面的疏水囊。口袋是用VOIDOO程序计算的[68]（B）由Dom-II（绿色）YK表位介导的接触。突变分析确定Tyr364和Lys379是高亲和力SM5-1结合的主要决定因素。Lys379和Glu359是唯一接触CDR L1（黄色）和H3（橙色）的残基。Tyr364可能在定位Lys379和Glu359时发挥作用，而无需直接联系SM5-1。

（畅通节能法）

图S3

SM5-1相关部分和部分生殖系转化SM5-1的序列比对 胚芽 .SM5-1中胚芽除CDR L1和H3外，所有CDR都恢复到生殖系序列。SM5-1中胚芽氨基酸如图所示发生突变。*表示相同的顺序。

（畅通节能法）

图S4

CDR H3底部形成的极性相互作用和氢键。MD模拟表明，这些相互作用的消除增加了CDR H3的灵活性。我们认为，与亲和力较低的成熟抗体相比，这些残基有助于提高抗体SM5-1的亲和力。

（畅通节能法）

图S5

SM5-1和SM5-1*的构象灵活性使用游离SM5-1的晶体结构作为起始构象。（A） 每个残基的均方根波动（RMSF）图，表明SM5-1*（红线）中残基102–112（CDR H3）的灵活性比SM5-1（黑线）增强。SM5-1和SM5-1*之间不同的序列位置用黄色星号标记。（B，C）在SM5-1（B）和SM5-1*（C）的模拟时间内，每隔20 ns收集6个结构的叠加。请注意，SM5-1*中的CDR H3环路表现出更高的灵活性，并且与起始结构的偏差更大。SM5-1和SM5-1*之间不同的六个残基如棒状图所示，一个粉红色箭头指向CDR H3回路。

（畅通节能法）

图S6

模型显示SM5-1与C末端扩展Dom-II域的假定相互作用。最近，在HSV-1 gB（PDB ID 3nwf，[31]). 尽管之前被忽略了，但这个C端螺旋段可能是gB-Dom-II域的一个组成部分。然而，用于测定Dom-II-SM5-1复合物晶体结构的工程化HCMV Dom-II中不存在该片段（HCMV gB残基443-455）。如果建模到晶体结构中，则看起来（i）螺旋不会干扰复合物的结构，并且（ii）螺旋可能在Dom ii和SM5-1之间产生额外的接触，特别是CDR L3。

（畅通节能法）

图S7

SM5-1中和糖化HCMV gB的模型。（A） 在gB三体融合后模型中SM5-1与Dom-II结合[26]（B）使用GlyProt web服务器生成的糖化HCMV模型[69]（C）模型表明，即使gB被糖基化，SM5-1也可以访问Dom-II-结合位点。（D） 在SM5-1中，与gB相连的两个相邻SM5-1 Fab C的C端子H（H）域之间的距离超过150度。因此，单个IgG分子的两个Fab片段不能同时结合到同一个gB三聚体。因此，IgG很可能在HCMV表面交联不同的gB三聚体。HSV-1gB的晶体结构（PDB ID 2gum，[18])用作HCMV gB建模的模板。在每个面板中，三聚体gB分别以白色、灰色和黑色显示，Dom-II段以绿色突出显示。SM5-1以卡通形式显示，糖原子作为球体。

（畅通节能法）

表S1

各种SM抗体对gB的结合亲和力及其各自的中和活性。

（DOCX）

致谢

作者感谢4-Antibody AG Jena的Luis Martin-Parras赠送SM5-1，以及Simon Fillenberg在数据收集方面的帮助。我们感谢Uwe Müller和Manfred Weiss在束线BL14.1的数据采集过程中提供的帮助，该束线由柏林亥姆霍兹中心（HZB）在BESSY II电子储存环（德国柏林-阿德勒肖夫）运行。我们感谢Thomas Simon:Diarect AG，Freiburg在Fab准备过程中的讨论和帮助。

资金筹措表

YAM和HS承认来自德国Forschungsgemeinschaft CRC-796的支持：通过微生物效应器重新编程宿主细胞(网址：www.dfg.de)和来自德国联邦财政部（DFG）拨款的MM：MA 929/11-1(网址：www.dfg.de). 资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

数据可用性

作者确认，研究结果所依据的所有数据都是完全可用的，没有任何限制。Dom-II、SM5-1 Fab和Dom-II-SM5-1-Fab复合物的坐标和结构因子已分别以登录码4OSN、4OSU和4OT1存放在蛋白质数据库（PDB）中。

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文章来自多囊卵巢综合征病原体由以下人员提供多环芳烃