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自然医学。作者手稿；PMC 2015年4月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
《国家医学》，2014年10月；20(10): 1193–1198.
2014年9月28日在线发布。 数字对象标识：10.1038/3686海里
预防性维修识别码：项目经理4191991
NIHMSID公司：NIHMS619476
PMID：25261994

循环支链氨基酸升高是胰腺癌发生的早期事件

贾里德·梅耶斯,#1 陈武,#2,三，4 克莱里·克利什,#5 彼得·卡夫,4,6 玛格丽特·托伦斯,1 布莱恩·菲斯克,1 陈元,三 英宝,7 玛丽·汤森,7 雪莱·S·托罗格,4,7 肖恩·戴维森,1 泰利斯-帕帕吉安纳科普洛斯,1 杨安南（Annan Yang）,8 塔利亚·戴顿,1 舒吉·奥吉诺,三，4,9 迈尔·J·斯坦普弗,4,7,10 爱德华·乔瓦努奇（Edward L.Giovannucci）,4,7,10 钱志荣,三 道格拉斯·A·鲁宾逊,三 Jing Ma公司,4,7 霍华德·塞索,4,11 约翰·迈克尔·加齐亚诺,11,12 芭芭拉·B·科克伦,13 刘思敏（Simin Liu）,14 Jean Wactawski–温德,15 乔安·曼森,4,7,11 迈克尔·波拉克,16 亚历克·金默尔曼,8 阿曼达·苏扎,5 克里·皮尔斯,5 托马斯·J·王,17 罗伯特·E·格什滕,5,18 查尔斯·S·富克斯,三，7 马修·范德·海登,1,三，5,†和布莱恩·沃尔平（Brian M.Wolpin）三，19,†
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

大多数胰腺导管腺癌（PDAC）患者被诊断为晚期疾病，生存期不到12个月1PDAC与肥胖和糖耐量异常有关2-4但循环代谢物的变化是否与早期癌症进展相关尚不清楚。为了更好地了解与早期疾病相关的代谢紊乱，我们分析了胰腺癌患者和四项前瞻性队列研究中匹配对照组的确诊前血浆中的代谢物。我们发现，血浆支链氨基酸（BCAA）水平升高与未来胰腺癌诊断风险增加2倍以上有关。这种升高的风险独立于已知的诱发因素，在可能存在隐匿性疾病的诊断前2至5年采集样本的受试者中观察到的相关性最强。我们发现，突变型胰腺癌早期小鼠的血浆BCAA也升高喀斯特组织蛋白的分解是导致早期疾病患者血浆BCAA增加的原因。总之，这些发现表明，增加全身蛋白分解是PDAC发展的早期事件。

PDAC是全球癌症相关死亡的主要原因，大多数患者在确诊时都患有不治之症1特征最好的易感因素、当前烟草使用以及与PDAC的一级相关，都使该病的风险增加约1.8倍5,6然而，到目前为止，这些风险因素对散发性肿瘤早期疾病进展的生物学研究提供了有限的见解。PDAC的发展和进展与包括肥胖在内的系统代谢改变有关2，葡萄糖不耐受三,4和癌症引起的恶病质7然而，尚未对循环代谢物进行系统检查，以确定代谢改变是否预示着亚临床胰腺癌，或在干预可能改善患者预后时告知我们对早期疾病进展的了解。

此前，为了确定与癌症相关的循环代谢物的变化，采用了一种横断面设计，将无癌症对照组与诊断时采集的血样进行比较8-10这种方法对于发现与早期癌症进展相关的变化是有问题的，因为晚期疾病的后果可能会影响循环代谢物的特征。胰腺癌患者尤其如此，他们通常在诊断时有明显的厌食、体重减轻和胰腺功能不全1为了研究代谢改变如何导致胰腺恶性肿瘤，我们分析了PDAC患者的血浆代谢物，并从四项前瞻性队列研究中选取了匹配的对照组，这些研究在癌症诊断前至少两年采集了血液(补充表1). 从采血到PDAC诊断的中位时间为8.7年。

在条件logistic回归模型中，15种血浆代谢物与PDAC的未来诊断相关P（P）<0.05; 3种代谢产物中，支链氨基酸异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸对P（P）≤0.0006，多重假设检验校正后的预定义显著性阈值(图1和补充表2). 为了评估PDAC诊断的风险程度，我们将参与者分为BCAA水平升高的五分之一组。与最低五分之一组相比，最高五分之一的受试者患PDAC的风险至少增加了2倍(表1,补充表3和补充图1). 如前所述11，三种BCAA的循环水平高度相关(补充表4)反映了他们共同的代谢途径12并导致BCAA总和的类似结果(表1和补充表3).

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血浆代谢物与胰腺癌未来诊断风险

P（P）-在条件logistic回归模型中，比较胰腺癌患者和对照组的人血浆中对数转换的连续代谢物水平值，该模型以匹配因素为条件，并根据抽血时的年龄（年，连续）、禁食时间（<4，4-8，8-12，≥12小时，缺失）进行调整和种族/民族（白人、黑人、其他、失踪）。绿色虚线表示具有统计显著性P（P）–多假设检验Bonferroni校正后的阈值，P（P）–趋势≤0.0006（0.05/83）。蓝色虚线表示P（P）–趋势为0.05。

表1

根据支链氨基酸的血浆水平预测胰腺癌的比值

模型一异亮氨酸亮氨酸缬氨酸BCAA总数c（c）
极限五分位数b条根据S.D。极限五分位数b条根据S.D。极限五分位数b条根据S.D。极限五分位数b条根据S.D。
基本模型2.11 (1.40-3.18)1.30 (1.15–1.48)2.08 (1.38–3.13)1.31 (1.14–1.50)2.00 (1.37–2.92)1.23 (1.09–1.39)2.13 (1.43–3.15)1.30 (1.14–1.48)
+体重指数和体育活动2.05 (1.34–3.12)1.29 (1.14–1.48)2.01 (1.32–3.06)1.29 (1.12–1.49)1.94 (1.31–2.86)1.21 (1.07–1.38)2.06 (1.37–3.09)1.28 (1.12–1.47)
+BMI、体力活动和采血时报告的糖尿病2.00 (1.31–3.05)1.28 (1.13–1.46)1.97 (1.29–2.99)1.28 (1.11–1.48)1.90 (1.28–2.81)1.20 (1.06–1.37)2.01 (1.34–3.03)1.27 (1.11–1.46)
+BMI、体力活动、报告的糖尿病、HbA1c、血浆胰岛素、胰岛素原和C-肽1.86 (1.13–3.03)1.24 (1.06–1.45)1.81 (1.11–2.96)1.24 (1.04–1.47)1.67 (1.06–2.63)1.14 (0.99–1.33)1.89 (1.17–3.06)1.22 (1.04–1.44)
排除采血时报告患有糖尿病或糖化血红蛋白≥6.5%的受试者2.12 (1.37–3.27)1.33 (1.16–1.52)2.16 (1.39–3.35)1.32 (1.14–1.54)1.91 (1.28–2.85)1.23 (1.08–1.41)2.19 (1.44–3.34)1.31 (1.14–1.51)
排除采血时糖尿病或糖化血红蛋白≥6.5%的受试者和采血后糖尿病患者2.18 (1.39–3.43)1.32 (1.15–1.53)2.21 (1.40–3.49)1.33 (1.13–1.55)1.94 (1.27–2.96)1.22 (1.07–1.40)2.25 (1.45–3.49)1.31 (1.13–1.52)
一条件logistic回归模型的比值比（95%置信区间）以匹配因素为条件，并根据抽血时的年龄（年，连续）、禁食时间（<4，4-8，8-12，≥12小时，缺失）和种族/民族（白人、黑人、其他人，缺失）进行调整。随后的模型还根据能量平衡、高血糖或胰岛素抵抗的指示测量值进行了调整：体重指数（kg/m2连续）、体力活动（MET–小时/周，连续）、采血时报告的糖尿病（是/否）、糖化血红蛋白（%，持续）、血浆胰岛素（μIU/ml，持续），血浆胰岛素原（pM，持续）和血浆C–肽（ng/ml，连续）。
b条循环支链氨基酸第五个五分位与第一个五分位数（参考值）的比值比（95%CI）
c（c）三种循环支链氨基酸，异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的浓度总和

缩写：BCAA，支链氨基酸；BMI，体重指数；CI，置信区间；血红蛋白A1c；S.D.，标准偏差

肥胖者和胰岛素抵抗者的循环BCAA升高13在研究参与者中，血浆BCAA与能量平衡、肥胖和糖耐量异常的标志物适度相关(补充表4). 为了评估BCAAs对PDAC风险的独立影响，我们评估了包括这些标记物的模型，发现BCAAs与PDAC的相关性基本上保持不变(表1). 循环中支链氨基酸的水平也与未来患糖尿病的风险有关11,14由于2型糖尿病是PDAC的易感因素15，我们质疑糖尿病的中间发展是否是BCAA关联的基础。在采血时排除糖尿病受试者并没有改变我们的结果(表1)这表明我们尚未发现与PDAC后期诊断相关的糖尿病流行特征。为了确定循环BCAA是否能识别出患有糖尿病的人群，而这些人群又是PDAC的高风险人群，我们排除了在采血到癌症诊断期间患糖尿病的受试者，并发现结果没有变化(表1). 这些数据表明，BCAA与未来PDAC诊断的相关性并不依赖于糖尿病的中期发展。

为了检验循环BCAA对PDAC风险分层模型的贡献，我们评估了受试者-操作-特征（ROC）曲线下面积（AUC）16和净重新分类改进（NRI）17低风险和高风险类别。与基础模型相比，包括循环BCAA导致AUC显著增加(补充表5a和补充图2)净8.2%的病例转移到高风险类别，NRI为5%(补充表5b). 因此，在我们的人群中，纳入循环BCAA提高了风险分层模型识别未来PDAC病例的能力。

在分层分析中，我们发现BCAAs与PDAC的相关性在队列、性别、吸烟状态、BMI或采血时的禁食状态方面没有显著差异(补充图3，全部P（P）–相互作用≥0.14）。为了检测循环BCAA与PDAC的相关性，我们按照采血和PDAC诊断之间的时间间隔（<2年、2-<5年、5-<10年、≥10年）对病例和对照组进行分层。这些分析表明，在诊断前2年至5年之间，相关性特别强(图2a和补充表6).

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血浆BCAA在亚临床疾病期间升高

a、，队列病例和匹配对照组中未来胰腺癌诊断的优势比图（95%置信区间），比较从采血到病例癌症诊断的时间分层的循环BCAA的最高与最低五分位数。条件logistic回归模型的比值比（95%置信区间）以匹配因素为条件，并根据抽血时的年龄（年，连续）、禁食时间（<4，4-8，8-12，≥12小时，缺失）和种族/民族（白人、黑人、其他人，缺失）进行调整。红色水平线表示比值比为1.0。b。KPC小鼠随时间变化的总血浆BCAA图和同窝对照组。每个控制数据点是研究过程中一只老鼠的平均值(补充图3b)KPC小鼠寿命超过19周的值是>19周时间点的平均值。对于15-17周、n＝6个KPC和n＝9个对照，t吨-测试，P（P）=0.001.c、，KP胰腺组织的H&E染色–/–3-4周龄的C组小鼠和同窝鼠作为对照。胰腺组织学正常的对照小鼠的组织（左）；一个KP–/–PDAC区与正常胰腺区相邻的C小鼠（中部）；和KP–/–具有PDAC和胰腺上皮内瘤变区域的C小鼠（闭合箭头）（右）；比例尺=50μM。d日，KP在3-4周龄时的平均体重（±SEM）–/–C小鼠和窝友对照组（n=7 KP–/–C、 n=11只对照小鼠）。e（电子），KP血浆支链氨基酸总水平平均值（±SEM）–/–3-4周龄的C组小鼠和窝友对照组（n=10 KP–/–C、 n=14只对照小鼠，t吨-测试，P=0.002).（f）,P（P）–KP中循环氨基酸水平的比较值–/–3-4周龄的C组小鼠和窝鼠对照组，cys=胱氨酸（n=10 KP–/–C、 n=14只对照小鼠），红色虚线表示P（P）–值0.05。克，top，葡萄糖耐量试验（KP）–/–C断奶时的小鼠和窝友对照组（n=7 KP–/–C、 n=11只对照小鼠）和KP的底部胰岛素耐受性试验–/–四周龄时的C组小鼠和室友对照组（n=7 KP–/–C、 n=15只对照小鼠）。小时，KP空腹血浆胰岛素水平的平均值（±SEM）–/–四周龄时的C组小鼠和室友对照组（n=7 KP–/–C、 n=11只对照小鼠）。

实验研究表明，从最初的恶性克隆形成到癌症诊断需要数年时间18这表明，当我们观察到BCAA升高的最强关联时，可能存在隐匿性PDAC。因此，我们假设循环中BCAA升高是早期PDAC的标志。为了测试这种可能性，我们利用LSL–克拉G12D系列/+;LSL–Trp53172H兰特/+;Pdx–1–Cre公司（KPC）小鼠产生具有可变潜伏期的PDAC19KPC小鼠经历了从正常胰腺到侵袭性腺癌的所有组织学阶段，平均生存期约为21周19(补充图4a). KPC小鼠最初表现出与窝友对照组相似的BCAA水平，但在处死前15-17周出现显著升高(图2b和补充图4b). 这些数据表明循环BCAA升高伴随早期PDAC。

LSL–克拉G12D系列/+; Trp53基因flox/flox公司;Pdx–1–Cre公司（千帕–/–C） 小鼠发展为具有更一致动力学的PDAC，在3-4周龄时表现出具有有限侵袭性癌的前驱病变（PanINs）(图2c)中位寿命为10-12周20。在3-4周龄时，我们观察到KP和KP的体重或食物摄入量没有差异–/–C组小鼠和窝友对照组表明患有早期PDAC的动物尚未出现明显的体质症状(图2d和补充图4c). 与患者和KPC小鼠的研究结果一致，KP患者的循环BCAA较高–/–与对照组相比，患有亚临床PDAC的C组动物(图2e)，这是大多数其他氨基酸未观察到的模式(图2f和补充图4d-e).

在4周龄KP的腹腔内葡萄糖和胰岛素耐受性试验中，我们观察到空腹血糖、葡萄糖负荷反应、胰岛素激发反应或空腹胰岛素水平无显著差异–/–C和对照小鼠(图2g–h和补充4f-i). 这些发现表明，BCAA升高并不反映高血糖或胰岛素抵抗，而是亚临床PDAC的早期后果。

我们检查了由相同基因损伤引起的其他恶性肿瘤是否导致血浆BCAA升高。Cre–重组酶引入患有喀斯特和Trp53基因KP的等位基因–/–C型分别导致非小细胞肺癌和肉瘤21-23。两种模型均未显示早期PDAC的BCAA改变(补充图5). KP衍生细胞系的再植入–/–免疫活性同基因宿主的C模型也不能引起BCAA升高(补充图6). 这些数据表明，BCAA升高与胰腺早期原发性肿瘤有关，并不是胰腺癌的一般特征喀斯特–导致癌症。他们还建议，从终末期疾病中重新植入细胞并不能模拟导致BCAA升高的早期疾病状态。

慢性胰腺炎是PDAC的危险因素24胰腺炎症可以促进小鼠PDAC的发展25,26因此，我们研究了BCAA升高是否可能是早期疾病中胰腺炎症的原因或后果。在无肿瘤发生的情况下，轻度慢性胰腺炎未能恢复BCAA升高(补充图7a-h)饮食干预后血浆BCAA的长期增加并没有引起胰腺炎症或胰腺炎(补充图7i-o). 需要进一步研究以了解BCAA与更严重胰腺炎之间的关系。

与其他氨基酸不同，肝脏不调节血浆支链氨基酸水平27,28; 相反，水平是由饮食摄取、组织利用、肌肉和其他身体蛋白质储存的分解决定的27,29因此，血浆BCAA可能来源于与膳食摄入和处置相关的短期池或与组织蛋白分解相关的长期池。为了调查短期储备，我们喂养了四周大的KP–/–C组和对照组小鼠采用氨基酸定义的饮食，其中20%的亮氨酸和缬氨酸13C–标记。KP公司–/–C组和对照组小鼠在暴露于带标签的饮食中两个小时后摄入了相似数量的食物(补充图8a)我们观察到血浆的出现和消失没有差异13C–标签(图3a和补充图8b)他认为，无论有无PDAC，小鼠的肠道吸收和外周处理都是相似的。

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BCAA升高源于长期的氨基酸库

a、，血浆水平（平均值±SEM）13暴露于含有13C标记的亮氨酸和缬氨酸。时间点对应于图中的红色箭头。b、，使用标记饮食调查长期池中血浆BCAA水平的贡献的实验图表。两组小鼠被用于这些实验，一组在喂食状态下处死，另一组在禁食状态下在红色箭头指示的时间点处死。c、，禁食KP腓肠肌蛋白水解液中总氨基酸的分数标记–/–C小鼠和对照鼠（n=8 KP–/–C、 n=6控制）。日期：，KP血浆氨基酸的分数标记–/–C和处于喂养状态的对照小鼠（n＝3KP–/–C、 n=4控制）。e、，短期和长期BCAA池对血浆中BCAA的计算贡献。f、，腓肠肌平均重量（±SEM）（左侧面板，t吨-测试，P（P）=0.01），主要是快速收缩肌肉，心脏重量（右面板）标准化为体重（n=6 KP–/–C、 n=10控制）。

为了确定长期BCAAs库对血浆水平的贡献，我们在小鼠早期快速生长期间将其暴露于有标签的饮食中，然后将其转换为无标签的饮食三天，以从短期库中获取标签(图3b). 尽管外周组织蛋白标记相似(图3c和补充图8c)4周龄KP血浆中标记BCAA的比例升高–/–相对于窝友对照组的C小鼠(图3d). 此外，通过比较喂食条件下的血浆标记（由标记的长期和未标记的短期血池决定）和禁食条件（只有标记的长期血池才起作用），我们计算出BCAA从长期体内储存增加的释放量是KP中BCAA升高的唯一原因–/–C小鼠(图3d–e和补充图8d). 这些数据表明，PDAC的早期后果是组织蛋白的分解增强，导致血浆BCAA升高。与此假设一致，KP–/–患有早期PDAC的C小鼠具有较小的快速抽搐肌肉，但保留了慢速抽搐和心肌(图3f和补充图9). 值得注意的是，与长期禁食和晚期恶性肿瘤相关的肌肉萎缩表现出类似的模式30-32.

肌肉分解代谢增加是癌症相关恶病质的一个方面，恶病质是一种消耗综合征，经常影响晚期PDAC患者，并导致更糟糕的结果33-36然而，我们的研究结果表明，蛋白质分解开始的时间远早于先前认识到的时间，也早于临床恶病质的发病时间。免疫和/或肿瘤细胞产生的炎症细胞因子与恶病质有关31,37BCAA升高时疾病负担较低，提示激素也可能参与其中。组织氨基酸的释放可以支持胰腺癌细胞对氨基酸需求的增加38,39BCAA和/或组织分解产生的其他氨基酸有助于疾病进展。因为肝脏代谢使除BCAA外的所有氨基酸的血浆水平保持相对恒定27,29,40，组织氨基酸释放的增加预计会提高血液中的BCAA浓度。BCAAs升高与其他代谢性疾病状态之间的关系11,13,14,41提示血浆BCAAs可能是蛋白质周转增加的一般标志，BCAAs升高可能导致PDAC患者中常见的不确定期高血糖42.

在四个大型前瞻性队列的参与者中，循环BCAA与PDAC的未来发展相关。我们在两个PDAC小鼠模型中观察到类似的BCAA升高，并证明这些升高是由于外周蛋白存储的破坏所致。这些发现为了解早期疾病如何影响全身代谢提供了新的见解，并表明肌肉蛋白质损失在疾病进展中发生的时间比以前认识的要早得多。

在线方法

人类研究

研究人群

我们的研究人群包括来自四项前瞻性队列研究的胰腺癌病例和对照：健康专业随访研究（HPFS）、护士健康研究（NHS）、医生健康研究I（PHS）和女性健康倡议观察研究（WHI-OS）。HPFS成立于1986年，当时51529名40至75岁的美国男性在健康行业工作，填写了一份两年一次的邮寄问卷。英国国家医疗服务体系成立于1976年，当时121700名30-55岁的女护士完成了一份两年一次的邮寄问卷。PHS是1982年在22071名年龄在40-84岁的男性医生中开始的阿司匹林和β-胡萝卜素的完整试验。试验结束后，研究参与者作为观察队列进行随访。WHI–OS由93676名50–79岁的绝经后妇女组成，她们于1994–1998年在美国40个临床中心登记。参与者完成了基线临床访问和年度邮寄问卷。该研究得到了马萨诸塞州波士顿市布里格姆女子医院人类研究委员会的批准，参与者表示同意。

我们纳入了2010年采血后确诊的胰腺癌病例，这些病例有可用血浆，且无癌症病史。病例通过自我报告或死亡随访确定。根据近亲、邮政服务或国家死亡指数确定死亡人数；这种方法捕获了98%以上的死亡43.医生在不了解暴露数据的情况下审查医疗记录，以确认胰腺癌的诊断。与这些队列中的先前研究类似4,44-46根据预先确定的分析计划，我们仅纳入采血后2年以上确诊的病例，因为胰腺癌引起的体重减轻和胰岛素抵抗在确诊前2年内就已表现出来42,47对于每个病例，我们随机选择了两个对照组，按队列配对（也按性别配对）、出生年份（+/-5年）、吸烟状态（从未、过去、现在、失踪）、禁食状态（<8小时，≥8小时）和采血月/年（HPFS为+/-3个月，NHS为+/-3月，PHS为+/-6个月，WHI为精确配对）。对照组在该病例的诊断日期未患癌症，并提供了血样。如前所述，共变量数据来自PHS和WHI的基线调查问卷以及HPFS和NHS采血前的调查问卷4,45在HPFS、NHS和PHS中，根据病历审查直接将病例中的癌症分期分为：（1）适合手术切除的局部疾病；（2） 不能切除但无远处转移的局部晚期疾病，或（3）远处转移疾病。在WHI中，使用监测流行病学最终结果汇总分期对病历进行编码，该分期将肿瘤分为局部、区域或远处。然后按照与HPFS、NHS和PHS相同的方式将这些阶段分别归类为局部、局部晚期和转移性疾病。

初始数据集包括454例病例和908例对照。七个对照组的血浆不足以进行代谢物分析。由于缺少10%以上代谢物的数据，排除了一例病例和对照组。

血浆样本

1993年至1995年，从18225名HPFS男性、1982-1984年14916名PHS男性、1994-1998年93676名WHI-OS女性和1989-1990年32826名NHS女性的肝素试管中采集了EDTA试管中的血样。对血液采集队列和完整队列中的参与者特征进行了比较补充表7。参与者采集HPFS和NHS中的血样，隔夜用冷包装邮寄，然后旋转以收集和储存血浆（延迟处理），而PHS和WHI参与者的全血立即分别放入血浆中并储存。下文概述了从每个队列收集和储存样本的程序，并总结为补充表8.

健康专业人员随访研究

到达血液实验室后，对小瓶进行离心分离，以分离各个组成部分。用适当的研究成员身份证号码标记低温储存管，并将分离的血液成分移到其中。这个过程为每个队列成员产生了5管血浆、2管白细胞和1管红细胞。然后将试管储存在液氮冷冻柜中。每当冷冻柜的传感器指示需要冷却液时，一个可容纳3000加仑液氮的散装罐就会自动为每个冷冻柜供油。

护士健康研究

将血样分离成成分（血浆、白细胞和红细胞），用移液管移到8个装有5管血浆、2管白细胞和1管红细胞的冷冻管中。样品立即在气相液氮冷冻机中冷冻。NHS血液实验室将与血液研究相关的所有生物样本储存在一个大型液氮（LN2）冷冻农场中。冷冻管储存在液氮冷冻柜的气相中；冷冻柜顶部附近的最高冷冻温度为-130°C，液氮底部附近的最低温度为-196°C。NHS实验室工作人员或中央安全服务台（夜间和周末）持续对所有冷冻柜进行报警和监控。

医生健康研究

向所有参与者发送了血液采集包，并说明将血液抽取到提供的EDTA试管中。两个试管离心分离血浆，第三个试管用于全血。在提取后24小时内，在实验室中用冷藏袋接收样本。收到样品后，将其冷藏并重新等分到九个1.2 mL试管中（三个全血和六个血浆），所有试管均在-82°C下冷冻。

妇女健康倡议

在禁食状态下的基线诊所就诊时，采集了所有WHI–OS参与者的血样。将血样保持在4°C下长达一小时，直到血浆或血清从细胞中分离出来。在收集后的两个小时内，将离心的小份样品放入-70°C的冷冻柜中。通过隔夜交付将样品冷冻后运至中央设施，并保存在-70°C的冷冻柜内。

血浆样本根据队列进行分组，以便来自单个队列研究的所有病例和对照组作为一批接受代谢产物分析。样本三联体（胰腺癌病例、匹配对照组#1和匹配对照组#2）在批次内随机分布，病例顺序和每个三联体中的两个匹配对照也被随机指定。因此，案例及其两个控件始终在同一批中运行，并且在分析运行中始终彼此直接相邻，从而限制了匹配案例-控件三元组之间平台性能的可变性。

对于来自所有四个队列的参与者，将血浆样本解冻一次，将其从大容量小瓶中分为较小容量，然后运至马萨诸塞州理工学院博德学院和哈佛大学（马萨诸塞州立大学剑桥分校）。样本在布罗德研究所再次冷冻，然后再次解冻以进行代谢物分析。因此，对于所有病例和对照组，在进行代谢物分析时，血浆样品已解冻两次。

我们之前在Nader Rifai博士（马萨诸塞州波士顿儿童医院）的实验室中使用罗氏诊断公司（印第安纳波利斯）的试剂测量了389例患者和757名对照者的血红蛋白A1c（HbA1c）。我们使用诊断系统实验室（德克萨斯州韦伯斯特）和Millipore Corporation（马萨诸塞州比勒里卡）的试剂测量了386例患者和743名对照组的血浆胰岛素，388例患者和74名对照组患者的血浆胰岛素原，408例患者的血浆C肽和785名对照组。来自质量控制（QC）血浆池的随机插入样本的HbA1c、胰岛素、胰岛素原和C肽的平均分析内变异系数（CVs）分别为2.0%、5.4%、3.1%和4.9%4.

代谢物剖面

内源性极性代谢物的剖面是在麻省理工学院布罗德学院和哈佛大学（马萨诸塞州剑桥）使用液相色谱-串联质谱（LC-MS）获得的。LC-MS方法旨在使用低血浆样本量广泛测量代谢标记物和中间产物，包括来自中央代谢和氨基酸代谢的代谢物48.目标分析的LC-MS参数，包括色谱保留时间和质谱多反应监测设置（去簇电位、碰撞能量和透镜电压），是使用300多种商用参考化合物测定的。使用两种不同的亲水相互作用液相色谱（HILIC）方法组合，可在血浆中测量133种极性代谢物的子集，其中一种方法在酸性流动相条件下操作，并进行正离子模式MS检测，另一种方法则在基本洗脱条件下进行负离子模式MS探测。

使用正电离模式MS分析的酸性HILIC方法与Wang等人11简单地说，LC-MS系统由4000 QTRAP三重四极质谱仪（AB SCIEX）和1100系列泵（安捷伦）以及HTS PAL自动取样器（Leap Technologies）组成。血浆样品（10μL）使用九体积的74.9:24.9:0.2（v/v/v）乙腈/甲醇/甲酸提取，其中含有稳定同位素标记的内标物（缬氨酸-d8，同位素；苯丙氨酸-d8），剑桥同位素实验室。样品离心（10分钟，9000 x g，4°C），上清液（10μL）注入Atlantis HILIC柱（150 x 2.1 mm，3μm粒径；Waters Inc.）。以250μL/min的流速用5%流动相a（10 mM甲酸铵和0.1%甲酸水溶液）等速洗脱柱1分钟，然后在10分钟内线性梯度至40%流动相B（乙腈和0.1%乙酸）。离子喷射电压为4.5 kV，源温度为450°C。

使用基本HILIC分离和负电离模式MS检测的第二种方法建立在LC-MS系统上，该系统由ACQUITY UPLC（Waters Inc.）和5500 QTRAP三重四极质谱仪（AB SCIEX）组成。使用120μL含有内标肌苷的80%甲醇（VWR）提取血浆样品（30μL）15N个4，胸腺嘧啶-d4和甘胆酸–d4（剑桥同位素实验室）。将样品离心（10 min，9000 x g，4°C），将上清液直接注入Luna NH2柱（150 x 2.0 mm，5μm粒径；Phenomenex），以400μL/min的流速洗脱，初始条件为10%流动相a（20 mm醋酸铵和20 mm氢氧化铵（Sigma–Aldrich）存于水中（VWR）)和90%流动相B（10 mM氢氧化铵，75:25 v/v乙腈/甲醇（VWR）），然后10 min线性梯度至100%流动相a。离子喷涂电压为-4.5 kV，源温度为500°C。

使用MultiQuant 1.2软件（AB SCIEX）对原始数据进行处理，用于自动LC–MS峰值积分。手动审查所有色谱峰的整合质量，并与每种代谢物的已知标准进行比较，以确认化合物的特性。对内部标准峰面积进行监测，以进行质量控制，评估系统随时间的性能，并识别需要重新分析的异常样本。在20组研究样品之后，还对合并的血浆参考样品进行了分析，作为分析性能的额外质量控制措施，并作为跨样品批次缩放原始LC-MS峰面积的参考。信噪比<10的代谢物被认为是无法量化的。代谢物信号与胰腺癌风险相关，如LC-MS峰面积，与代谢物浓度成正比，适合代谢物聚类和相关分析。

在测量的133种代谢物中(补充图10)83人被纳入我们的嵌套胰腺癌病例对照分析(补充表9). 试点工作中49，我们确定了32种代谢物在延迟处理的样品中的再现性较差，因此排除了这些代谢物，因为它们无法在两个参与队列中进行可靠测量。在当前研究中，三个肝素血浆池（57个QC样品总数）和三个EDTA血浆池（128个QC样品总量）随机分布在参与者样品中，作为盲法QC样品。我们计算了QC血浆池中每种代谢物的平均CV，并设置了一个先验的符合再现性要求的阈值≤25%。根据这一标准，我们的分析排除了13种平均CV>25%的代谢物。五种代谢物在10%以上的参与者中检测不到，也被排除在外。我们用肝素管和EDTA管同时采集的血浆评估了10名志愿者的血浆。对于支链氨基酸，肝素和EDTA样品之间的Spearman相关系数分别为异亮氨酸0.85、亮氨酸0.88和缬氨酸0.95。

对于在多假设校正后满足统计显著性阈值的代谢物（异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸），使用稳定同位素标记标准将LC-MS峰面积转换为绝对浓度。简单地说，MS响应的外部校准曲线是使用同位素标记溶液测定的13C类6,15N-亮氨酸，13C类6,15N–异亮氨酸（剑桥同位素实验室）和d8–缬氨酸（同位素）。在水中制备每种标准品的1μg/μL溶液。将20μL每种储备溶液添加到180μL参考混合血浆中，然后使用混合血浆对所得溶液进行连续稀释，以生成校准曲线。对于多反应监测MS分析，键断裂产物、碰撞能量和去簇电位设置与内源性代谢物相同：天然亮氨酸132/86，CE=18，DP=50；13C类6,15N–亮氨酸134/87，CE=18，DP=50；天然异亮氨酸132/86，CE=18，DP=50；13C类6,15N–异亮氨酸139/92，CE=18，DP=50；天然缬氨酸118/72，CE=18，DP=25，d8–缬氨酸126/80，CE=18，DP=25。在每个浓度下制备三个单独的血浆样品，并使用上述酸性HILIC LC-MS方法进行分析。计算参考混合血浆中内源性异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的中位浓度，并根据与分析队列中最近的参考混合血浆样品相关的响应比确定每个研究样品中每种代谢物的浓度。

统计分析

为了比较基线特征，我们使用条件logistic回归，以匹配因子为条件，并包括感兴趣的协变量。计算代谢物和协变量的部分Spearman相关系数。代谢物进行对数转换以提高正常值，并作为连续变量纳入条件logistic回归模型中，条件Logistics回归模型以匹配因素为条件，并根据抽血时的年龄（年，连续）、禁食时间（<4、4-8、8-12，≥12小时，缺失）和种族/民族（白人、黑人、其他，缺失）进行调整。使用保守的Bonferroni校正进行多假设检验50，代谢物P（P）≤0.0006（0.05/83）被认为具有统计学意义。

为了估计影响程度，根据对照组中的对数转化代谢物水平，将重要代谢物分为五分位后，在条件logistic回归模型中进行检验。考虑到禁食时间可能对代谢物水平产生的影响，分别为空腹（自最后一餐起≥8小时）和非空腹（从最后一餐开始<8小时）参与者生成了五分位数。五分位数是从选定的对照人群中产生的，这可能不能准确反映整个队列人群的特征。还根据对数转化代谢物水平的标准偏差（SD）变化计算了比值比（OR）和95%置信区间（CI）。为了控制可能的混杂因素，我们评估了校正了体重指数（BMI）、体力活动、糖尿病史、糖化血红蛋白、血浆胰岛素、血浆胰岛素原和血浆C肽的回归模型。在通过自我报告排除糖尿病受试者或血液采集时糖化血红蛋白≥6.5%（流行糖尿病）后，我们还评估了回归模型。我们进一步评估了排除采血后、癌症诊断前2年以上患糖尿病的受试者的模型（意外糖尿病不被认为是胰腺癌近期发病）42,47.

当LC-MS峰值低于检测限时，代谢产物值被认为缺失。在初步分析中，任何代谢物数据缺失的病例或对照均被排除在该代谢物分析之外。然而，我们还进行了敏感性分析，在该分析中，缺失值的参与者被分配了检测下限或检测下限的一半，我们的结果没有改变。

我们使用Cochran’s评估了不同队列代谢产物与胰腺癌风险的异质性问–统计51我们通过性别、吸烟状态、BMI和禁食状态检查了预定义亚组的相关性。通过将代谢物和分层变量的主要效应项和交叉乘积项输入模型，评估似然比检验，评估统计交互作用。我们还检查了采血时间与患者癌症诊断之间的关系。在这些基于时间的分析中，一个阶层包括40例胰腺癌患者，他们在诊断后2年内采集了血液，并与之匹配。这些病例和对照组不是主要分析人群的一部分，而是按时间进行分层分析，以更全面地描述诊断前代谢产物与胰腺发育的关系。我们还检测了循环BCAA与我们队列中先前探讨的胰腺癌风险因素的相关性(补充表10)诊断为癌症阶段(补充表11).

由于标记物与疾病的关联并不表明标记物作为疾病筛查试验的适用性，因此我们研究了两种方法，以量化胰腺癌多因素风险识别工具中代谢物的价值。歧视量化了一个或多个疾病标记物将病例（患有该疾病的个体）与对照组（没有该疾病的个人）区分开来的能力。我们调查了在测量循环BCAA后的十年内预测胰腺癌诊断的风险模型的差异，即胰腺癌的十年风险。

在第一种方法中，我们研究了接收机工作特性（ROC）曲线分析，并计算了ROC曲线下的面积（AUC），也称为一致性（C）统计16,52基础模型包括采血时的年龄（连续）、队列（HPFS、NHS、PHS、WHI；这也考虑了性别）、种族/民族（白人、黑人、其他/失踪）、吸烟状态（从未吸烟、过去吸烟、现在吸烟、失踪）和禁食时间（<4、4-8、8-12、≥12小时，失踪）。随后的三个模型反映了基本模型，但还包括：（1）体重指数、体力活动和糖尿病史，（2）循环BCAA，或（3）体重指数，体力活动，糖尿病史和循环BCAA。ROC曲线上的每个点都显示了将风险估计转化为事件发展预测的规则的效果。ROC曲线的y轴是真正的阳性率或敏感性（即正确预测患有胰腺癌的个体比例）。x轴显示假阳性率，这是特异性的补充（即，没有胰腺癌的个体被错误预测患有胰腺癌的比例）。ROC曲线下的面积AUC衡量模型对病例受试者和对照受试者的区分程度。与病例受试者和对照受试者的随机分类相对应的ROC曲线是一条AUC为50%的直线。与完美分类相对应的ROC曲线AUC为100%。包含新标记的模型的AUC改进被定义为使用具有和不具有新标记的模式计算的AUC差异53.

就背景而言，乳腺癌风险评估工具，通常称为盖尔模型54,55，使用临床可用信息估计女性患乳腺癌的风险，这些信息包括当前年龄、初潮年龄、第一次活产年龄、患乳腺癌一级亲属的数量、以往乳腺活检的数量、显示不典型增生的乳腺活检以及种族/民族。盖尔模型用于指导女性进行适当的乳腺癌筛查试验56，三苯氧胺作为化学预防剂的应用57，以及用于确定预防策略随机临床试验中的样本量计算58一些研究使用ROC曲线分析评估了Gail模型的辨别能力，并计算出AUC为0.58至0.6352,59-61随访研究表明，当在原始Gail模型中添加乳房密度作为额外预测因子时，AUC为0.62至0.6659,60,62.

虽然ROC曲线是常用的，但它们有许多局限性，当添加到先前定义的预测因子中时，可能低估了新标记物对风险预测的贡献能力63-66评估模型识别的另一种方法是评估新标记在预先定义的风险类别之间上下移动个人风险的能力。这被称为标记的预测增量，并已被编入称为净重分类改进（NRI）的方法中17NRI（有时称为净重新分类指数）分别为有事件和无事件的参与者构建了重新分类表，并量化了风险类别之间的正确变动；也就是说，对于有事件的参与者来说，风险类别较高，而对于没有事件的参与者而言，风险类别较低。此外，风险类别的错误变动（事件向下，非事件向上）减少了研究人群中个人的净正确重新分类。

NRI计算由以下公式表示：

NRI=[P（P）（向上D类= 1) − P（P）（向下D类= 1)] − [P（P）（向上D类= 0) − P（P）（向下D类= 0)]

向上移动（向上）定义为基于新模型向高风险类别的变化，向下移动（向下）定义为基于新模型向低风险类别的变化，其中P（P）表示概率和D类表示事件指示器（1，事件；0，非事件）。

使用NRI，我们评估了预测模型（包括循环BCAA）与基本模型相比，将个人适当重新分类为风险组的能力。使用条件logistic回归计算基础模型，以匹配因素为条件，并根据种族/民族、体重指数、体力活动和糖尿病史进行调整。随后的模型包括基础模型中的协变量以及循环代谢物。与之前的研究一样67-69，我们将高危人群定义为胰腺癌风险至少比平均风险高2倍的人群。

就背景而言，新兴风险因素合作70研究了将新的风险因素整合到心血管疾病风险预测模型中。在这些研究中，在已知的心血管疾病风险预测模型中添加了额外的潜在风险预测因子，包括年龄、性别、吸烟状况、血压、糖尿病史和胆固醇。然后计算三种10年心血管疾病风险类别的净重分类改善。C反应蛋白是全身炎症的标志物，许多研究表明，CRP升高与心血管事件风险增加有关71-73循环CRP目前用于告知诊所有关筛查和风险降低策略的决策74,75设计临床试验，测试减少心血管事件的新疗法76,77在对近250000人的分析中78增加CRP以了解心血管疾病风险因素与ROC曲线下区域的统计学显著改善以及10年心血管疾病风险的NRI为1.52%相关。相反，其他分析表明，体重指数、腰围、腰臀比、血浆纤维蛋白原和循环载脂蛋白的NRI改善<1%78-80，因此这些额外预测因子的临床效用仍不清楚75.

所有分析均采用SAS 9.2统计软件包进行。全部P（P）–价值观是双向的。

小鼠研究

所有研究均由麻省理工学院动物护理委员会（IACUC）批准。

实验小鼠

所有实验组均按基因型分配。对所有动物进行编号，并进行盲法实验。数据收集后，显示基因型，并将动物分组进行分析。

KPC公司

实验KPC小鼠是混合背景的雄性小鼠，条件型lox–stop–lox杂合喀斯特G12D系列等位基因，条件lox–stop–lox杂合Trp53基因172H兰特Pdx–1启动子控制下的等位基因和表达的Cre–重组酶(Tg（Ipf1-core）1塔夫)19Littermate控件缺少LSL–喀斯特G12D系列等位基因、Cre等位基因或两者兼而有之。将对照组小鼠与其携带肿瘤的窝友同时处死。

KP公司–/–C类

实验KP–/–C小鼠是混合背景的雄性小鼠，条件型lox–stop–lox杂合喀斯特G12D系列等位基因，loxP位点纯合，位于Trp53基因并在Pdx–1启动子的控制下表达Cre–重组酶(Tg（Ipf1-core）1塔夫)20Littermate对照小鼠缺乏Cre重组酶等位基因，LSL–克拉G12D系列等位基因，或两者兼而有之。如有需要，还对含有相同等位基因的近交C57B6/J雄性小鼠进行了检测，并将从这些小鼠获得的癌细胞系用于同基因再植入研究。

非小细胞肺癌

6个月大的雄性小鼠，纯129背景，条件lox–stop–lox杂合喀斯特G12D系列等位基因，loxP位点纯合，位于Trp53基因给药2.5x107如前所述，表达Cre腺病毒的pfu21,22高滴度腺病毒从基因转移载体核心（爱荷华大学）获得。

后肢肉瘤

混合背景下4周龄雄性小鼠，条件型lox–stop–lox杂合喀斯特G12D系列loxP位点侧翼外显子2–10的等位基因和纯合子Trp53基因给药2.5x108先前描述的表达Cre的腺病毒的pfu23高滴度腺病毒从基因转移载体核心（爱荷华大学）获得。

再植入、胰腺炎和BCAA饮食研究

研究开始时，年龄为4-6周的雄性C57B6/J小鼠被用于这些实验。

饮食

标准饮食：RMH 3000（Prolab）。

氨基酸定义饮食

1x BCAA（TD.110839）和2x BCAA。

标记氨基酸定义饮食

20%13C–亮氨酸和20%13C-缬氨酸标记的饮食以TD.110839饮食为基础，由剑桥同位素公司和哈伦·特克拉德公司生产。

代谢组学血浆

在指定的时间点为每次实验收集血浆。小鼠在2%的异氟烷-氧气混合物下麻醉，并在光周期开始后约4.5小时进行逆眼眶出血。血液立即放置在EDTA预处理试管中，并离心分离血浆。对血浆进行校准，并在-80°C下冷冻，以进行进一步分析。隔夜禁食16小时后，早上第一件事就是以同样的方式采集禁食血液样本。

食品消费

小鼠被单独饲养48小时，剩余的食物颗粒分别在0、24和48小时称重。然后计算每只小鼠的两天平均值。第二天测定体重。为了评估BCAA定义的饮食的消耗量，将小鼠单独饲养并喂食5天。在喂食2天后和第5天再次称量食物，并计算72小时内每24小时的平均消耗量。

血糖、血浆胰岛素、葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验

四周龄KP–/–将C组小鼠禁食一晚，并使用单触式Ultra手持式血糖仪测量血糖。取同一小鼠的25μL血浆，置于肝素化试管中，进行校准，并在-80°C下冷冻，以进行进一步分析。使用超灵敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒（Crystal Chem，#90080）测定血浆胰岛素水平。在测量了空腹参数后，按照公布的方案进行了葡萄糖耐量试验81简言之，清醒的小鼠在时间零点接受2g/kg葡萄糖的腹膜内注射。随后在上述注射后15、30、60、90和120分钟测量血糖。对于胰岛素耐受性测试，四周大的KP–/–C小鼠在白天禁食6小时。在初始血糖测量后，清醒小鼠接受0.75 IU/kg重组人胰岛素的腹腔注射（诺和林，诺和诺德）。随后在上述注射后15、30、60和90分钟测量血糖。

KP公司–/–C细胞系与再植入研究

从C57B6/J KP解剖末期肿瘤–/–C小鼠，并在胰蛋白酶分解前进行机械切割，使肿瘤细胞在含有10%FBS、2mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM中繁殖。细胞株支原体阴性。在皮下再植入研究中，受体小鼠被吸入2%的异氟烷-氧气混合物麻醉，低代细胞系（每个系的第5代）以2.5 x 10的速度重新悬浮5无菌PBS中细胞/100μL，在同基因小鼠的侧面注射100μL PBS（对照）或细胞悬浮液。在原位再植入研究中，通过吸入2%异氟烷-氧气混合物、在左侧小腿中线腹部垂直切口、调动脾脏以及25μL含有1.0 x 10的PBS或PBS对受体小鼠进行麻醉5将细胞（每行第3代）注入胰腺尾部。

Caerulein诱导的慢性胰腺炎

如前所述，通过每天腹腔注射，每周5天，连续10周，给小鼠注射USP级生理盐水或5μg蓝绿色素（Sigma）25取血，最后一天处死小鼠。组织用10%福尔马林固定，以进行随后的组织学分析。

胰腺炎的血浆标志物

血浆淀粉酶和脂肪酶测量由IDEXX生物研究实验室（马萨诸塞州北格拉夫顿）进行。

BCAA饮食研究

给小鼠喂食1x或2x BCAA饮食10周。在实验的最后一天采集血液并处死小鼠。组织用10%福尔马林固定，以进行随后的组织学分析。

确定BCAA海拔来源的研究

急性摄入和处置

在16小时的通宵禁食后，给老鼠喂食20%13C-亮氨酸和缬氨酸饮食两个小时后才取下食物，在此期间的食物消耗量如上文所述进行量化。在中红色箭头指示的时间点图3a，在肝素化管中从清醒小鼠的尾静脉中采集10–25μL血浆，并离心分离血浆。血浆被校准并在-80°C下冷冻，以进行随后的GC-MS分析。然后将亮氨酸和缬氨酸的GC-MS分析的总离子计数归一化为去甲缬氨酸内标，并乘以分数标记，以确定存在的标记量。然后将每只动物的这一数字标准化为该动物的食物摄入量，以控制标记食物消费中的动物间差异。

BCAA对血浆的长期池贡献

小鼠接触20%13C-亮氨酸和缬氨酸标记的饮食，从7天到24天，然后是三天的未标记饮食（根据图3b). 本研究使用了两组小鼠。第27天在喂食状态下处死一组小鼠，第28天在16小时的通宵禁食后处死第二组小鼠（图中红色箭头所示的点）图3b). 在牺牲时，麻醉小鼠被最终放血，并在5分钟内收获组织，使用Biosqueezer（BioSpec Products）在液氮中快速冷冻，并在–80°C下储存，用于随后的GC–MS分析。血浆被校准并在-80°C下冷冻，以进行随后的GC-MS分析。

根据以下等式计算短期和长期资金池的总供款：

L（左）o（o）n个克T型e（电子）第页米P（P）o（o）o（o）我(F类e（电子）d日%L（左）一b条e（电子）我e（电子）d日F类一秒t吨e（电子）d日%L（左）一b条e（电子）我e（电子）d日)×对e（电子）我一t吨我v（v）e（电子）F类e（电子）d日P（P）o（o）o（o）我S公司我z（z）e（电子）S公司小时o（o）第页t吨T型e（电子）第页米P（P）o（o）o（o）我对e（电子）我一t吨我v（v）e（电子）F类e（电子）d日P（P）o（o）o（o）我S公司我z（z）e（电子）L（左）o（o）n个克T型e（电子）第页米P（P）o（o）o（o）我

原始数据和计算汇总于补充表12.

组织和体重

为了测量组织重量，小鼠在处死前称重，然后解剖并称重腓肠肌、胫骨前肌、比目鱼肌和心脏。将每只小鼠的肌肉重量标准化为该小鼠的体重。

LC-MS血浆氨基酸测量

在麻省理工学院科赫研究所（马萨诸塞州剑桥市）通过LC–MS测量血浆氨基酸，使用类似的方法评估人类血浆中的代谢物。使用开放存取MAVEN软件工具将原始数据作为峰面积顶部进行分析82.

GC-MS评估13C-亮氨酸和缬氨酸标记

血浆极性代谢物在冰-冷4:1甲醇：水中用去甲缬氨酸内标物提取（200μL提取液中的5μL血浆）。通过离心对提取物进行澄清，上清液在氮气下蒸发，并在-80°C下冷冻，以便随后衍生。将干燥的极性代谢物溶解在20μL吡啶（Thermo）中的2%甲氧基胺盐酸盐中，并在37°C下保持1.5小时。溶解和反应后，通过添加25μL引发叔丁基二甲基硅烷基衍生化N个–甲基–N个–（叔丁基二甲基硅基）三氟乙酰胺+1%叔丁基二甲基氯硅烷（Sigma），并在37°C下培养1小时。酸水解方案改编自Antoniewicz及其同事83简单地说，通过在100°C下将1-5mg组织在1mL 18%盐酸中煮沸过夜，对快速冷冻的组织进行组织蛋白的酸水解。在氮气下蒸发50μL上清液，并在-80°C下冷冻，以进行后续衍生化。在叔丁基二甲基硅烷基衍生化之前，将干燥的水解产物重新溶解在吡啶（10μL/1mg组织）中，该衍生化通过添加N个–甲基–N个–（叔丁基二甲基硅基）三氟乙酰胺+1%叔丁基二甲基氯硅烷（12.5μL/1mg组织，Sigma），并在37°C下培养1h。

使用配备30m DB–35MS毛细管柱的Agilent 7890 GC进行GC/MS分析，该毛细管柱连接至Agilent 5975B MS，该MS在70eV电子冲击电离下运行。使用氦气作为载气，以1min的流速，在270°C下以无分流模式注入1微升样品−1为了测量氨基酸，将GC烘箱温度保持在100°C下3分钟，并在3.5°C下增加到300°C−1MS源和四极分别保持在230°C和150°C，探测器以扫描模式运行，记录100–605范围内的离子丰度米/z（z）通过整合适当的离子片段来确定MID83在中列出补充表13并使用Ferandez及其同事的算法对天然同位素丰度进行校正84.

统计

必要时进行适当的统计测试。双方未成对学生的t吨–除非另有规定，否则使用Mircosoft Excel for Mac:2011（Microsoft）或GraphPad Prism 6（GraphPad-Software）对所有统计分析进行测试。进行双侧重复测量方差分析，比较葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验中的平均血糖水平85，使用SAS 9.2统计包。

补充材料

1

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02

单击此处查看。（182K，pdf）

致谢

作者感谢布罗德研究所的A.Deik和K.Bullock协助进行LC–MS样本分析，并感谢科赫研究所Swanson生物技术中心的Tang组织学设施协助处理小鼠组织。剑桥同位素实验室提供13C-BCAA饮食用于小鼠标记研究。作者想感谢C·纽加德和A·戈德堡对这份手稿进行了深入的讨论。作者还想感谢HPFS、NHS、PHS和WHI的参与者和工作人员所做的贡献，以及以下州癌症登记处的帮助：AL、AZ、AR、CA、CO、CT、DE、FL、GA、ID、IL、IN、IA、KY、LA、ME、MD、MA、MI、NE、NH、NJ、NY、NC、ND、OH、OK、OR、PA、RI、SC、TN、TX、VA、WA、WY。NHS和HPFS由NIH拨款P01 CA87969、P01 CA55075、P50 CA127003、R01 CA124908、R01 CA 49449、1UM1 CA167552支持。小灵通由NIH拨款CA 97193、CA 34944、CA 40360、HL 26490和HL 34595支持。WHI项目由NIH通过合同N01WH22110、24152、32100–2、32105–6、32108–9、32111–13、32115、32118–32119、32122、42107–26、42129–32和44221资助。我们感谢F30 CA183474对JRM的额外支持；雀巢研究中心奖授予布罗德研究所；从R01 DK081572至TJW和REG；由Robert T.和Judith B.Hale胰腺癌基金、Perry S.Levy胃肠癌研究基金、Pappas胰腺癌家庭研究基金向CSF提供；从Burroughs Wellcome基金会、Damon Runyon癌症研究基金会、Smith家族和Stern家族到MGVH；来自NIH/NCI K07 CA140790、美国临床肿瘤学会征服癌症基金会、霍华德·休斯医学研究所和宝马紫色承诺。MGVH还感谢5–P30–CA14051–39的支持，霍华德·休斯医学研究所向宝马公司提供了该项目的主要支持，卢斯特加顿基金会向CSF、MGVH和宝马公司提供支持。

脚注

作者贡献

所有作者都参与了数据的分析和解释。CW、CBC、PK、CY、YB、MKT和BMW对人类数据进行了统计分析。CBC、MKT、SST、TJW、REG和BMW评估了大型队列研究中血浆代谢物分析平台。CBC、JRM、AS和KP进行了代谢物分析实验。PK、YB、MKT、SST、SO、MJS、ELG、ZRQ、DAR、JM、HDS、JMG、BBC、SL JWW、JEM、MNP和CSF协助四项队列研究的数据采集、管理和解释。JRM和MET在BPF、SMD、TP、AY TLD和ACK的协助下进行了所有小鼠实验。CW、CBC、JRM、CSF、MGVH和BMW设计了这项研究，并根据所有作者的意见起草了手稿。

作者报告称，没有经济利益冲突。

参考文献

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