v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物（myc）在人类肿瘤中通常过度表达(1,2)与人类癌症的临床侵袭性密切相关(三,4). MYC尤其与淋巴瘤和上皮性肿瘤等造血肿瘤的发病机制有关(5,6). 例如，在伯基特淋巴瘤中，c-Myc公司该基因在几乎所有肿瘤中都易位到一个Ig位点(5,7,8). MYC癌基因作为转录的全球调节器参与许多细胞程序，包括细胞生长、代谢和脂质合成，从而促进肿瘤的发生(9,10). MYC诱导与厌氧糖酵解相关的全球代谢转变，这一现象称为Warburg效应(11). 一些研究表明，淋巴瘤中MYC的调节和代谢之间存在关系，尤其是与糖酵解和谷氨酰胺水解过程有关(12,13). 一些报告表明，MYC调节脂肪酸合成，特别是棕榈酸(14); 然而，关于MYC表达与淋巴瘤中各种脂类的上调或下调之间的关系，人们知之甚少。
我们已经培育出转基因小鼠，以单独或与大鼠肉瘤（RAS）、BCR-ABL和BCL2等癌基因结合，有条件地调节MYC癌基因的表达，从而产生多种癌症转基因模型，包括T细胞急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、骨肉瘤、肺腺癌、，和肝细胞癌（HCC）(15–18). 最近，我们描述了解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI）和转基因小鼠模型用于检测MYC诱导的肝癌的脂质谱(19). 在这里，我们使用我们的条件转基因小鼠模型、高质量分辨率和高质量精度DESI-MSI、统计分析和分子生物学方法来研究和识别MYC诱导的淋巴瘤和人类淋巴瘤中脂质谱的变化。
DESI-MSI是质谱中的环境电离技术(20,21)最近出现了一种无需大量样品制备就能对生物样品进行成像的方法。DESI-MSI在直接从组织切片研究各种人类癌症中诊断脂质和代谢物的分布方面特别强大(22–24). 样品被溶于数百种脂类和代谢物的微滴轰击。飞溅形成二次微滴，进入质谱仪，提供样品表面分子分布的详细化学图。使用DESI-MSI，我们观察到MYC诱导淋巴瘤的脂质特征。由于微星提供了如此丰富的化学信息，我们使用了称为微阵列显著性分析（SAM）的统计方法(25,26)选择MYC诱导淋巴瘤中丰度增加或减少且具有统计学意义的分子。尽管SAM传统上用于分析基因表达微阵列，类似地，在DESI-MSI中，从单个成像实验中获得数百个数据点。在我们的研究中，SAM选择了104个在MYC诱导的淋巴瘤中丰度增加或减少的分子离子，与假发现率（FDR）小于5%的对照组织相比。大多数选定的分子离子通过串联和高分辨率质谱鉴定为具有生物相关性的复合甘油磷脂，包括许多不同的亚类。我们还分析了15例人类淋巴瘤样本，与动物模型结果类似，在MYC高表达的淋巴瘤与MYC低表达的淋巴瘤中观察到不同的脂质谱。我们的结果表明，特异性脂质代谢和途径的改变可能与淋巴瘤中MYC的表达有关。我们特别鉴定了86个具有潜在诊断和预后价值的分子。
结果
MYC诱导淋巴瘤的特异性脂质特征。
我们之前描述了一种使用Tet-off系统调节癌蛋白表达的条件转基因淋巴瘤模型的产生(15). 简言之，转基因在缺乏强力霉素的情况下表达，而转基因在强力霉素存在的情况下被关闭。我们使用负离子模式DESI-MSI研究了转基因Emu-tTA/TetO-MYC小鼠和正常对照小鼠胸腺组织中分子的分布和丰度。特别是，我们将负离子模式分析集中在米/z700–1100范围内，与甘油磷酸胆碱和鞘氨醇最丰富的正离子模式相比，通常检测到各种不同类别的复合甘油磷脂(27). 在相同的实验条件下，使用DESI-MSI耦合到高质量分辨率-质量精度质谱仪（LTQ-Orbitrap XL）对三个MYC诱导的淋巴瘤样品（淋巴瘤A、B和C）和三个正常胸腺样品（TY、T01和T02）进行成像。DESI-MSI实验中使用了由二甲基甲酰胺：乙腈（1:1）组成的组织相容溶剂系统，以便在同一组织切片上进行组织学评估。该方法允许对先前通过DESI-MSI分析的相同组织切片或细胞进行H&E染色，从而在脂质特征和组织疾病状态之间提供明确的相关性(28). 有关材料和方法的详细信息，请参阅SI材料和方法.
显示了从MYC诱导淋巴瘤（淋巴瘤a）组织样品和对照正常胸腺（胸腺T02）组织样品中获得的代表性质谱和选定的2D离子图像。通过检查，可以清楚地观察到MYC诱导的淋巴瘤和正常胸腺组织的光谱存在显著差异。例如米/z771.5161,米/z773.5321，以及米/z淋巴瘤A样本中观察到795.5163个()，而相对丰度较高米/z810.5275和米/z对照胸腺1组织中观察到834.5275个(). DESI-MSI分析的其他小鼠组织样品获得了高度重复性的结果(图S1). 通过Western blot分析评估胸腺组织样本中MYC的表达，如，以及作为负载对照的α-微管蛋白的表达。结果证实，与对照胸腺组织样本TY、T01和T02相比，淋巴瘤A、B和C组织样本中MYC的高过表达。淋巴瘤A和对照胸腺T02的二维DESI离子图像如所示，显示所选的强度米/z整个组织切片的值。苏木精和伊红（H&E）染色组织切片的组织病理学评估证实，样本淋巴瘤A完全由肿瘤细胞组成，而对照样本完全由正常胸腺细胞组成。2D离子图像中观察到整个组织切片中离子分布的一些异质性，这与组织病理学评估证实的淋巴瘤细胞浓度存在轻微差异的区域有关。
MYC诱导淋巴瘤的DESI-MSI显示特异性脂质特征。具有代表性的负离子模式DESI质谱(A类)MYC诱导淋巴瘤（样本淋巴瘤A）和(B类)正常对照胸腺（样本T02）组织米/z显示700–1100范围。MYC和α-微管蛋白的Western blot分析结果如所示C类对于MYC诱导的淋巴瘤样本A、B和C，以及正常胸腺对照样本TY、T01和T02。选定分子离子的DESI-MS离子图像米/z885.5478,米/z773.5321,米/z788.5435，以及米/z795.5163如所示D类淋巴瘤和对照样本。
使用SAM鉴定MYC诱导淋巴瘤中丰度变化的具有统计学意义的脂质。
通过2D DESI离子图像检查，可以评估MYC诱导的淋巴瘤和正常胸腺之间特异性离子相对丰度的一般差异。高质量分辨率DESI-MSI在离子图像中每个像素的单个质谱中获得的信息的复杂性和丰富性要求使用精细的生物统计工具。我们将SAM应用于从分析的所有组织样本中获得的DESI-MSI数据集，以确定MYC诱导的淋巴瘤中分子离子丰度的变化是否具有统计学意义。SAM是一种统计技术，通常用于分析基因表达微阵列，在单个实验中包括数千个数据点(25). SAM确定不同表型或实验条件之间分子丰度的变化是否具有统计意义。
在DESI-MSI数据中，从单个成像实验中获得数百个数据点。因此，我们采用SAM来识别具有统计意义的离子(米/z)通过计算分数，d日，它测量了标准化峰值丰度的平均变化米/zMYC诱导的淋巴瘤和正常胸腺之间。重复排列用于确定变化是否与表型显著相关，并估计偶然识别的分子离子的百分比，这称为FDR。从中检测到的所有离子米/z所有分析样品的范围为700–1200，179个不同米/z与对照样品相比，在MYC诱导的淋巴瘤中，s被选为大量改变，FDR小于5%。为了鉴定这些物种，我们使用了串联质谱分析和高质量精度测量。将获得的片段模式与文献中报道的不同脂质类别的特征进行比较(29)，并与用于脂质鉴定的高质量精度测量相结合。高质量分辨率-准确度测量允许我们在不需要色谱分离的情况下，分离和识别具有相同标称质量的不同类别的脂质。例如，两者米/z766.5015和米/zSAM选择766.5379作为MYC诱导淋巴瘤组织中的下调基因。这些米/z数值符合脱质子脂质PS（P-18:0/18:4）和PE（18:0/20:4）的化学公式，质量误差分别为1.70和-1.76 ppm。串联质谱分析米/z766.5显示了表征PS和PE脂质及其各自脂肪酸链的片段混合物。
通过LipidMaps数据库的搜索进一步证实米/zs可以指定给这些特定的脂质。然而，请注意，179人中有许多人米/zSAM选择的值具有统计显著性，FDR<5%，对应于13同一类脂物种的碳同位素峰值。因此，经过仔细评估质谱数据，共有104个不同米/zs被鉴定为单同位素米/z不同种类的脂质，其中86种不同米/zs被鉴定为甘油磷脂，40个在MYC诱导的淋巴瘤中丰度增加，46个丰度减少，如表S1.脂质的绝对质量误差小于3 ppm。请注意，甘油磷脂脂肪酸（FA）链中双键的异构使精确的结构分配复杂化，这就是为什么FA链只是暂时分配的原因。完全正确米/z确定的每种脂质的数值、质量误差、化学公式和统计分数见表S2和第3章.
如中所示表S1，大多数被发现下调的甘油磷脂种类是甘油磷酸丝氨酸（PS，21脂）和甘油磷酸乙醇胺（PE，14脂），在一些甘油磷酸肌醇（PI，8脂）、甘油磷酸（PA）、甘油磷酸酯（PG，1脂）和心磷脂（CL，1脂质）中。PS是一种次要的膜磷脂，占哺乳动物细胞总磷脂的2-10%。PS的生物学作用之一是作为一种辅因子激活多种信号蛋白，如蛋白激酶C(30). PE是第二丰富的哺乳动物膜磷脂，占总细胞磷脂的20-30%，众所周知，PE脂质在膜融合和裂变事件中发挥作用。相反，大多数甘油磷脂被发现上调(表S1)是PG（23种脂质）、酰基甘油磷脂（酰基PG，4种脂质）和CL（4种脂质）。此外，还观察到少量PE（三脂）、PI（三脂）、PS（两脂）和PA（一脂）。酰基-PG是一种常见于细菌细胞中的不寻常脂质，据报道在哺乳动物凋亡细胞的有丝分裂期组分中积累(31)并在高尔基体膜中显著存在(32). PG脂质在大多数动物组织中以低水平（1-2%）存在，可作为线粒体膜中CL的前体。CL是一种复杂的磷脂，几乎只存在于线粒体内膜中，与维持线粒体功能和膜完整性密切相关。我们最近报道了在米/z与胃腺癌相比，正常胃组织中723.4768的丰度增加(24). 有趣的是，与正常胸腺对照组相比，SAM选择了同样的CL，其双脱质子化形式在淋巴瘤中的丰度降低，而其他四种双键少一到三个的CL物种（72:7、72:6、72:5和74:7）在淋巴瘤组织中丰度更高。这些发现与早期研究一致，早期研究显示肿瘤细胞中存在未成熟的CL，其恢复率较低，FA链较短(33).
除了MYC诱导的淋巴瘤中某些脂质类丰度的变化外，我们还观察到淋巴瘤组织中甘油磷脂的FA链成分饱和度的变化，与对照组织相比，甘油磷脂丰度更高。在评估甘油磷脂的饱和硬脂酸FA（18:0）和单不饱和油酸FA的链组分时，共有32个被鉴定为在淋巴瘤中发现丰度降低的甘油磷脂中的链，27个FA（18:0），5个FA。引人注目的是，在35个淋巴瘤组织中，只有7个是饱和脂肪酸（18:0），28个是饱和FA（18:1）。单不饱和脂肪酸油酸由饱和脂肪酸硬脂酸通过硬脂酰辅酶A去饱和酶-1（SCD1）产生，该酶催化饱和脂肪酸合成单不饱和脂肪酸。SCD1已被报道为MYC靶基因数据库和其他研究中记录的MYC癌基因的靶点(34). SCD1基因表达增加已在各种人类恶性组织中检测到，如结肠癌、食管癌、肝细胞腺瘤以及人类淋巴瘤细胞系(35). 与油酸类似，我们还观察到，与对照组织相比，淋巴瘤组织中发现的甘油磷脂中的单不饱和棕榈酸FA（16:1）作为FA链的数量高于饱和棕榈酸FA（16:0）(图S2).
在RAS-与MYC-诱导的淋巴瘤细胞系中观察到不同的脂质分布。
为了评估通过DESI-MSI和SAM鉴定的淋巴瘤脂质特征是否是癌基因特异性的，我们通过体外分析检查了甘油磷脂丰度的变化是否与MYC或RAS癌基因激活有关。从MYC或RAS诱导的淋巴瘤模型中分离出的肿瘤衍生细胞系接受强力霉素治疗，以抑制癌基因表达。当MYC或RAS被激活时（MYC ON或RAS ON），以及在癌基因抑制后的两个不同时间点（4小时和16小时MYC OFF）采集肿瘤细胞。细胞样本在用于淋巴瘤和胸腺组织成像的相同实验条件下进行分析。显示了从MYC ON和RAS ON细胞样品获得的负离子模式DESI-MSI质谱。在显示每个淋巴瘤细胞系甘油磷脂的质量范围内观察到明显不同的质谱图。与在淋巴瘤组织中观察到的结果一致，SAM和DESI-MSI确定的许多甘油磷脂在MYC诱导的淋巴瘤中增加，例如甘油磷酸甘油PG（18:1/18:1）在米/z773.5321和PG（18:1/22:6）米/z819.5163和甘油磷酸肌醇PI（18:0/18:2）米/z861.5475和PI（18:0/20:3）米/z从MYC ON淋巴瘤细胞获得的质谱中也观察到887.5679。有趣的是，这些特定PG和PI物种的相对强度随着MYC灭活而降低，如MYC OFF 4 h的质谱所示，而MYC OFF 16 h的质谱更为剧烈(). 同时，甘油磷酸丝氨酸PS（18:0/22:5）在米/z836.5440和PS（18:0/18:1）米/z788.5435，与正常对照组织相比，MYC诱导淋巴瘤的丰度较低，随着MYC失活而增加。在RAS ON淋巴瘤细胞系中，在米/z861.5471,米/z863.5631，以及米/z835.5314分别鉴定为甘油磷酸肌醇PI（18:1/18:1）、PI（18:0/18:1(). 这些结果支持了我们使用MYC诱导的转基因小鼠模型的发现。我们推断淋巴瘤中甘油磷脂的丰度与癌基因的表达随意相关，而不仅仅与疾病状态有关。
在MYC诱导的和RAS诱导的淋巴瘤细胞系中观察到不同的脂质分布。具有代表性的负离子模式DESI质谱(A类)MYC诱导的淋巴瘤细胞：(顶部)MYC开启；(中部)MYC关闭4小时；(底部)MYC关闭16小时(B类)RAS诱导的淋巴瘤细胞：(顶部)RAS开启；(中部)RAS关闭4小时；(底部)RAS关闭16小时。
MYC高表达和低表达人淋巴瘤的脂质谱。
我们评估了在MYC诱导的淋巴瘤小鼠模型中鉴定的脂质特征是否可以在具有不同MYC蛋白表达水平的人类淋巴瘤组织标本中观察到。利用DESI-MSI对15个不同亚型的人类淋巴瘤样本进行了研究，其中包括3个弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、7个滤泡性淋巴瘤和5个Burkitt淋巴瘤，实验参数与小鼠样本相同。许多人类淋巴瘤样本显示出空间异质性，包括坏死组织、邻近正常组织和血管区域，正如H&E染色组织切片的组织病理学评估所确定的那样。评估的DESI质谱是从肿瘤细胞明显聚集的选定区域提取的。为了量化人类淋巴瘤中的MYC水平，我们使用了纳米流体蛋白质组免疫分析（NIA），这是一种我们以前开发的用于测定临床标本中癌蛋白表达的高灵敏度方法(36). NIA已被用于检测和量化人类淋巴瘤标本中的MYC，其结果与Western blot分析相当(36). 我们已经表明，0.2个相对发光单位（RLU）的截止值对于表征MYC高表达和低表达水平的样品具有统计意义。在本研究使用的人类淋巴瘤样本集中，9个人类淋巴瘤样本，包括所有DLBCL和4个Burkitt淋巴瘤，MYC的表达水平较高（>0.2 RLU），而其余6个样本，2个滤泡淋巴瘤和1个Burkit淋巴瘤，MY的表达水平较低(图S3).图S4显示了HL02、MYC高表达的人类DLBCL淋巴瘤（0.90 RLU）、样本HL18、MYC-高表达的人Burkitt淋巴瘤（0.95 RLU），样本HL07、MYC/低表达的人滤泡性淋巴瘤（0.13 RLU）和样本HL08以及MYC低表达的人类滤泡性恶性淋巴瘤（0.17 RLU）的质谱。当将人类样本的质谱数据与小鼠数据进行比较时，发现MYC高表达的人类淋巴瘤样本与MYC诱导的淋巴瘤样本之间存在很强的相似性。DESI-MSI和SAM在MYC诱导的淋巴瘤中鉴定出的许多高丰度脂类物种在MYC-高表达的人类淋巴瘤样品中也观察到较高的相对丰度。为了证明脂质表达的总体趋势，我们选择了SAM发现的18种具有代表性的脂质物种（FDR=0%，统计得分|d日|>2）在MYC诱导淋巴瘤中增加或减少，并计算分析的三个MYC诱发淋巴瘤样本、九个MYC-高表达人类淋巴瘤样本和六个MYC-低表达人类淋巴瘤标本的标准化丰度。呈现饼图，显示各组脂质的平均标准丰度。总的来说，在MYC诱导的小鼠淋巴瘤和MYC高表达的人类淋巴瘤样本中观察到类似的脂质表达模式，而不是在MYC低表达的人类恶性淋巴瘤样本中。
MYC高表达的人类淋巴瘤的脂质谱与MYC诱导的小鼠淋巴瘤相似。饼图显示了三个由MYC诱导的淋巴瘤样本、九个MYC高表达（>0.2 RLU）的人类淋巴瘤样本（HL01、HL02、HL04、HL10、HL12、HL14、HL15、HL17和HL18）和六个人类淋巴瘤样本的选定脂质物种的平均归一化丰度（HL05、HL06、HL07、HL08、HL09和HL13）MYC低表达（<0.2 RLU）。在FDR=0%的SAM诱导的MYC淋巴瘤中，所选脂质被发现增加或减少[PG（18:1/16:1）、PG（18:2/18:1）、PG（18:1/8:1）、PG（20:4/18:1）和PG（18：1/22:6）]，或降低[PS（16:0/18:1|d日| > 2. “其他”类别是指不太丰富的脂质的平均标准化丰度之和：PE（P-16:0/20:4）、CL（20:3/18:1/16:1）、PE（18:0/18:2），PE（P-16.0/22:6）、PG（18:2/20:4。
讨论
我们将DESI-MSI与SAM结合，在转基因小鼠和人类淋巴瘤中鉴定MYC-相关脂质物种。与用于脂质分析的传统方法（如高效液相色谱质谱法（HPLC-MS）和气相色谱质谱仪（GC-MS））不同，DESI-MSI允许直接快速分析淋巴瘤组织和细胞，而无需大量样品制备。检测到多种脂质，并已确定其2D分布与疾病状态之间的明确相关性。我们还使用了一种先进的统计技术SAM，以一种以前未使用的方式，在MYC诱导的淋巴瘤的复杂MSI数据中识别具有统计学意义的分子特征。结合高质量分辨率、高质量准确度和串联质谱法，我们总共鉴定出86种不同的甘油磷脂，包括PS、PI、PG、PE、PA、酰基-PG和CL类物种，具有各种重要的生物作用。SAM选择的淋巴瘤中大量增加的大多数脂质种类被鉴定为PG和CL，而PE、PS和PI类脂质被鉴定为大量减少。
MYC癌基因调节FA对β氧化的输入，这可能在维持淋巴瘤细胞的生存中起重要作用(37,38). 在我们的研究中发现的MYC诱导的淋巴瘤中具有统计学意义的丰度变化的不同类别的特定脂质物种可能具有诊断和预后价值，并可以深入了解MYC在淋巴瘤肿瘤发生中的作用。由于PG在MYC诱导的淋巴瘤中的丰度增加，以及其作为CL前体的主要作用，PG特别令人感兴趣，CL是一种复合脂质，几乎只存在于线粒体膜中(39). PGs的增加与MYC对线粒体生物发生的诱导一致(40). CL异常可损害线粒体功能和生物能量学，并导致肿瘤中不可逆的呼吸损伤，这与Warburg癌症理论有关(33). 据报道，肿瘤细胞和非肿瘤细胞中CL分子种类的含量和分布不同(41)以及白血病患者的高增殖细胞和慢增殖细胞(42). 我们发现，与正常对照组织相比，MYC诱导的淋巴瘤中具有较少双键的特异性CL物种显著增加。体外和体内研究都表明MYC与线粒体的生物发生和功能有许多联系(43,44)虽然据我们所知，MYC表达与淋巴瘤中CL成分之间的相关性似乎在以前没有报道过。除了识别某些类别脂质丰度的变化外，我们的方法还能够识别MYC诱导的淋巴瘤中FA链组成与正常组织相比的显著变化，淋巴瘤组织中的单不饱和FA与饱和FA相比数量更多。
我们还研究了MYC诱导的和RAS诱导的淋巴瘤细胞的脂质谱，发现它们之间存在显著差异。癌基因失活4小时和16小时后，每个细胞系中脂质的相对丰度也发生变化。RAS诱导的淋巴瘤中PI的相对丰度高于PG。这一发现可能与典型的RAS-PI3K-Akt通路有关，该通路需要磷脂酰肌醇进行信号传导。磷脂酰肌醇代谢物PIs由磷脂酶A2和溶血磷脂酶催化，已知其依赖于RAS(45). 溶血磷脂酶催化磷脂酰肌醇产生PI，这一过程通过成纤维细胞和其他细胞中的RAS转化大大增强，表明甘油磷脂代谢在RAS中的重要性(46–48). 我们的结果可以反映出一般特异性癌基因与独特的脂质特征相关。注意，我们在脂质谱中观察到的一些变化可能反映了原始胸腺和活化的肿瘤衍生T细胞之间的差异。然而，由于我们确定的脂质特征似乎可以区分MYC和RAS诱导的淋巴瘤，我们推测这些变化中的许多是MYC的病因特异性，但这仍有待检验（请参阅SI讨论以供进一步讨论）。
我们的MYC诱导癌症的转基因小鼠模型重述了人类癌症的许多特性，从而成为剖析MYC如何调节癌细胞代谢的一种简便方法(49). 我们使用DESI-MSI检查了15个不同类型的人类淋巴瘤样品，发现SAM鉴定的许多在MYC诱导的淋巴瘤中过度表达的脂质物种在MYC高表达的人类淋巴瘤样本中也观察到较高的相对丰度。这些结果表明，人类淋巴瘤中脂质丰度与MYC癌基因表达之间存在相关性。
我们的方法提供了一种原位分析特定代谢特征的方法，该方法可能有助于检测、诊断和预测MYC相关人类肿瘤。我们研究中发现的脂质种类可能为MYC如何调节癌症中的细胞代谢提供新的生物学见解。未来的研究将确定MYC改变脂质结构的生物学机制，并评估这些脂质特征是否可以作为癌症检测和治疗的生物标记物。
