致癌物。作者手稿；PMC 2015年7月22日发布。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院550246
TFAP2C在乳腺发育和癌变过程中调控子宫内膜上皮表型
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安东尼·塞尔
1美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学外科
2美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学放射肿瘤学系
米哈伊尔·库拉克
1美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学外科
Jung M.公园
1美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学外科
玛丽亚·波加切克
1美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学外科
菲利普·斯潘海默
1美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学外科
乔治·W·伍德菲尔德
1美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学外科
洛拉·S·怀特-贝尔
1美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学外科
云霞Q.O'Malley
1美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学外科
艾丽西娅·奥利维尔
三美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学病理学系
弗雷德里克·多曼
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三美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学病理学系
罗纳德·魏格尔
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4美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学生物化学系
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三美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学病理学系
4美国爱荷华州爱荷华市爱荷华大学生物化学系
*这些作者为本手稿做出了同等贡献
- 补充资料
1
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摘要
乳腺癌的分子亚型以不同的基因表达模式为特征，这些基因表达模式可以预测预后和治疗反应。内腔型乳腺癌亚型由ER-alpha（ERα）相关基因的表达定义，其中许多基因对转录因子激活蛋白2C（TFAP2C）直接反应。TFAP2C参与控制外胚层发育期间细胞生长和分化的基因调控网络ESR1/ERα以及乳腺癌中的其他管腔细胞相关基因。TFAP2C已被确定为人类乳腺癌的预后因子，但其在致癌和乳腺发育过程中管腔细胞表型的建立和维持中的作用尚不明确。在此，我们证明了TFAP2C在维持人类乳腺癌管腔表型和影响正常乳腺发育过程中管腔细胞表型方面的关键作用。管腔型乳腺癌细胞中TFAP2C的敲除诱导EMT，其形态学和表型改变的特征是管腔相关基因表达的丢失和基础相关基因表达随之增加。小鼠同源基因的条件性敲除TFAP2C型,Tcfap2c型在MMTV-Core驱动的小鼠乳腺上皮中，促进了乳腺树的异常生长，导致CD24的减少你好/CD49f型中间腔细胞数量和CD24的伴随增益中间/CD49f型你好成熟时的基础细胞群。我们的结果确立了TFAP2C是维持人类乳腺癌管腔表型的关键转录调控因子。此外，Tcfap2c影响乳腺发育过程中管腔细胞类型的发育。数据表明，TFAP2C在调节管腔特异性基因中发挥重要作用，可能是乳腺癌可行的治疗靶点。
关键词：TFAP2C、乳腺癌、乳腺发育、管腔、基因表达、EMT
简介
TFAP2C（AP-2C，AP-2γ）与乳腺癌的发生发展有关；然而，TFAP2C在乳腺上皮分化和癌变中的作用需要更详细的分析。在成人乳腺内，TFAP2C在上皮和肌上皮细胞中表达1,2TFAP2C的过度表达发生在乳腺癌中，然而，关于TFAP2C的高表达是否与更糟糕的临床结果相关，存在相互矛盾的数据2,三TFAP2C参与调节在乳腺癌生物学中起关键作用的基因，包括雌激素受体α（ERα）4,5和HER2/c-erbB26–8TFAP2C靶向许多表征管腔ERα阳性乳腺癌表型的基因9TFAP2C的转录调控可能进一步涉及与ERα和FOXA1的协同调控10这些发现表明TFAP2C可能对管腔型乳腺癌表型的发展至关重要。然而，还需要更多明确的研究来阐明TFAP2C在控制管腔型乳腺癌亚型中的作用。
TFAP2C型是一种发育调控基因，控制外胚层表皮分化的早期阶段11,12.小鼠同源物的过度表达TFAP2C型,Tcfap2c型在MMTV/neu转基因小鼠模型中，肿瘤数量减少，潜伏期延长，但似乎促进了增殖和肿瘤进展13Tcfap2c的过度表达可能导致非生理效应，基因敲除可能为人类TFAP2C在乳腺发育和肿瘤发生中的作用提供明确的证据。总基因敲除Tcfap2c型胎盘缺陷导致胚胎死亡的基因14Jager等人成功击倒Tcfap2c型在整个动物中使用Sox2cre，并报告其对乳腺导管分支、发育和小鼠乳腺上皮细胞（MMEC）增殖的影响15这种影响似乎不是激素表达改变的结果。然而，这些动物的存活率很低，这就引发了人们对罕见的选择性效应以及这种效应可能仅次于基因敲除的问题Tcfap2c型在MMEC以外的单元格中。
本研究旨在阐明TFAP2C在腔性乳腺癌和乳腺发育中的作用。为了更好地描述TFAP2C在腔性乳腺癌模型中的作用，我们评估了在瞬时和稳定敲除系统中，TFAP2C表达下调对基因表达和细胞形态的影响。为了阐明TFAP2C在乳腺发育中的作用，我们利用MMTV-Core对小鼠乳腺上皮细胞（MMEC）中的基因敲除，研究了小鼠TFAP2C-Tcfap2c同源物的条件敲除引起的表型效应。为了更好地理解TFAP2C基因调控在乳腺正常和癌症状态下的分子效应，我们尽可能地描述了人类乳腺癌和小鼠乳腺系统中的常见生理效应。
结果
TFAP2C靶向子宫内膜乳腺癌基因表达簇
先前的研究表明TFAP2C在调节ERα和其他激素反应相关基因的表达中起着重要作用5ChIP-SEQ提示TFAP2C靶向与管腔型乳腺癌表型相关的许多基因9如中所示，对TFAP2C结合位点的ChIP-SEQ分析表明，与ERα相关基因调控区相关的峰值包括ESR1、GATA3、FBP1、FOXA1、MYB、RET、KRT8和MUC1公司.的第一个介绍CD44细胞还发现TFAP2C结合有一个主要位点，可能表明TFAP2C-介导的对该关键表型标记的抑制作用。
根据已发表的不同表型乳腺细胞系的分子图谱16，我们将ChIP-SEQ数据与表征基因谱各亚类的基因进行了比较，包括基底细胞、发光细胞角蛋白、ERα相关和发光分化基因集。这些基因的特征是要么是TFAP2C靶基因，要么不是TFAP2C靶基因，或者不确定是否读取不能唯一地分配给分析中的基因。分析总结如所示和显示，几乎所有被指定为发光分化和ERα相关的基因都被发现是TFAP2C的直接靶向基因。大约60%的内质细胞角蛋白被发现是TFAP2C靶点。相比之下，TFAP2C仅针对Basal类别中10%的基因。由于ChIP-SEQ数据实验是在MCF-7细胞中进行的，尚不清楚表观遗传改变或其他分子差异在多大程度上会改变TFAP2C靶向基因组的方式，这在基础细胞系中可能有所不同。然而，数据表明TFAP2C的基因组结合模式与管腔型乳腺癌亚型相关的一组基因之间存在非随机关联。
为了评估结合的功能效应，在两个管腔型乳腺癌细胞系MCF-7和T47-D中敲除TFAP2C的表达，并通过RT-PCR和western blot评估几个管腔靶基因的表达。MCF-7和T47-D细胞表达TFAP2C蛋白，被认为是激素反应性Luminal A（ERα阳性，ERBB-2非扩增）乳腺癌的功能模型。如中所示如RNA和蛋白质减少所示，TFAP2C的敲除抑制了两种细胞系中管腔靶基因的表达。这个CD44细胞该基因通常在管腔中下调，在基底细胞类型中上调，在MCF-7和T47-D细胞中表现出相反的作用，随着TFAP2C的敲除而表达增加。这些数据表明，TFAP2C在调节管腔型乳腺癌亚型特征基因的表达方面起着关键作用。此外，数据表明TFAP2C可能参与与基础表型相关基因的主动抑制。
膜细胞系中TFAP2C的敲除与非靶向（NT）siRNA相比，使用siRNA在MCF-7和T47-D细胞中敲除TFAP2C。A。基因的相对RNA表达显示与NT siRNA的表达一致（线为1.0），并显示TFAP2C和管腔靶基因显著减少，CD44表达增加。B。蛋白质表达的Western blot显示，随着CD44表达的增加，TFAP2C和管腔基因的表达降低。C、。T47-D细胞的相对RNA表达与A组相同。D。用T47-D对C组的蛋白质表达进行Western blot。
TFAP2C的稳定敲除诱导了发光-基底转变
TFAP2C表达的短暂下调不允许对影响进行完整评估，其中一些可能涉及表观遗传改变，需要长时间观察。此外，基因表达改变的动力学可能因特定基因而异，并且敲除的完整性可能因转染实验而异。我们试图描述稳定的TFAP2C敲除对管腔型乳腺癌细胞的表型和基因表达模式的影响。为了进一步探讨TFAP2C在管腔癌细胞中的作用，我们使用慢病毒介导的shRNA传递技术，通过敲除TFAP2C，生成了稳定的细胞克隆(). 扩展嘌呤霉素选择后，分离出具有非靶向shRNA载体（sKD-NT）和具有TFAP2C靶向shRNA-载体（sKD-C，克隆45和46）的稳定MCF-7克隆。与sKD-NT细胞相比，sKD-C细胞在RNA和蛋白质水平上都表现出TFAP2C的显著敲除，同时同源家族成员TFAP2A的上调()，进一步证实了TFAP2C家族成员敲除的特异性。sKD-NT细胞保留了与亲代MCF-7相似的形态学外观，而sKD-C细胞发育出形态改变的多个伪足，如明亮视野显微镜所示().
TFAP2C诱导EMT的稳定击倒通过稳定表达靶向TFAP2C的shRNA（sKD-C）获得的MCF-7细胞克隆45与使用非靶向shRNA获得的细胞克隆（sKD-NT）进行比较。用于此图中所有数据的克隆是sKD-C-clone 45。A。通过RT-PCR检测TFAP2A和TFAP2C在稳定细胞克隆中的表达模式。B。细胞形态学使用400倍放大的亮场显微镜。C、。将sKD-NT与sKD-C细胞进行比较的表达阵列切片表明，细胞壁分化标记下调，间充质标记上调。D。Western blot显示AP-2蛋白的蛋白表达以及管腔分化和间充质标志物的示例。E.公司。通过对TFAP2C进行RT-PCR，CD44基因的相对表达显示sKD-C细胞中CD44 RNA增加，证实了A中的阵列和D中的蛋白。F类流式细胞术检测MCF7稳定细胞克隆中CD44/CD24亚群的分布表明CD44增加+/你好/CD24型−/低人口。
基于获得的间充质样形态，我们比较了间充质标记与细胞间分化标记对基因表达模式的影响17,18如中所示微阵列测定的基因表达模式表明，与sKD-NT细胞相比，sKD-C细胞中的管腔分化标记物作为一组下调。western blot证实了几个关键标记的变化(). 如两种微阵列所示，TFAP2C的稳定敲除导致VIN/波形蛋白和CDH2/N-钙粘蛋白的上调，以及CDH1/E-钙粘素的抑制()和western blot(). CD44表达，在基底部乳腺癌和上皮-间质转化（EMT）期间上调19通过微阵列、western blot和RT-PCR发现，在sKD-C细胞中上调(). 由于CD24被抑制（如微阵列上所示），CD44被稳定敲除TFAP2C上调，数据表明对癌症干细胞（CSC）人群有潜在影响。为了确定这些变化是否发生在相同的细胞中，我们对sKD-C细胞和sKD-NT细胞进行了CD44和CD24的流式细胞术比较+/你好/CD24型−/低sKD-C细胞与sKD-NT细胞的比较(). 这些数据表明，在Luminal A MCF-7细胞系中TFAP2C的缺失促进了与EMT一致的间充质变化，表达癌症干细胞标记物的细胞百分比增加。
数据表明，TFAP2C的丢失与从腔型向基底型乳腺表型的转变有关。因此，我们分析了管腔亚型和基底亚型的基因表达特征。使用高确定的分类模式等.16基因表达模式分为发光或基底基因簇。与sKD-NT对照细胞相比，sKD-C细胞表现出近全面的管腔型基因表达缺失，同时上调了大量的基础型基因(). 为了证实这些结果，我们对两组的多个基因进行了RT-PCR和western blot分析。在管腔型基因中，sKD-C细胞表现出GATA3、FOXA1、FBP1、MYB、RET、ESR1、KRT8、和MUC1公司与sKD-NT细胞相比，RNA和蛋白质水平的表达(). 通过转染来自基因不同部分的不同TFAP2C shRNA获得的单独细胞克隆（克隆46）获得了相同的结果。此外，从基础型基因来看，MMP14、KIRREL、CALD1、GSTP1、，和SFRP1系统均被证实在sKD-C细胞（克隆45和46）中与sKD-NT相比具有升高的表达(). 综上所述，这些结果证实了微阵列分析中确定的模式，并明确说明了在TFAP2C稳定丢失后，MCF-7细胞中基因表达从管腔模式向基础模式的迁移。
sKD-NT和sKD-C稳定细胞克隆的表达谱A。与sKD-NT克隆相比，克隆45的sKD-C管腔相关基因的选定基因热图（p<0.01）。B。管腔标记基因的RNA表达归一化为sKD-C、克隆45和克隆46在sKD-NT细胞（1.0行）中的表达。C、。Western blot显示与sKD-NT细胞相比，sKD-C、克隆45和克隆46中管腔靶基因的蛋白表达受到抑制。D。sKD-C克隆45的选定基础基因热图（p<0.01）。E.公司。选择的基础基因的RNA表达归一化为sKD-C、克隆45和克隆46在sKD-NT细胞（1.0行）中的表达。F、。Western blot显示与sKD-NT细胞相比，sKD-C、克隆45和克隆46的选定基础基因的蛋白表达。经western blot证实，TFAP2C在sKD-C克隆46中的表达已被废除（注：TFAP2C在克隆45中的表达在).
Tcfap2c的条件KO
为了阐明TFAP2C在管腔发育中的作用，我们使用了一个条件敲除TFAP2C-Tcfap2c小鼠同源物的小鼠模型。我们利用MMTV-Core检测了一个条件敲除，以特异性地消除Tcfap2c型小鼠乳腺上皮细胞（MMEC）20,21(补充图S1). 为了解决TCFAP2C缺失对乳腺发育的累积影响，我们评估了6周龄和12周龄动物的整体坐骑(,S2系列). 6周时，KO导管延迟了通过乳腺脂肪垫的迁移，TEB侵入乳腺脂肪垫百分比降低（48%对67%，p=0.05）(). KO腺体也出现了质的不同，可见更多的终芽样结构(，插图）。使用定义的10平方面积6二甲苯2在等倍放大的数字图像中，KO腺体位于淋巴结（LN）的远端并以淋巴结为中心，与对照腺体相比，KO腺的分支点较少（31对46，p=0.04），末端芽较多（67对50，p=0.02）(). 这些差异在12周龄KO小鼠的腺体中不存在，尽管芽结构的质量差异仍然可以识别(图S2).Tcfap2c型升/重量MMTVCre（多媒体电视Cre）+和Tcfap2c型重量/重量MMTVCre（多媒体电视Cre）+动物在6周时没有表现出任何明显的定量或定性表型(图S3)，表明所述的影响归因于Tcfap2c的作用。KO和对照动物都能支持幼崽（数据未显示），这表明KO动物的发育缺陷不足以破坏乳腺功能。
整个乳腺——特定Tcfap2c型敲除鼠标A。具有代表性的4-6周龄处女动物的整个乳腺。插图显示了整个腺体结构之间的质量差异，包括KO腺体中更多的端芽和更少的分支点。B。与对照组（wt/wt）相比，对整个坐骑的定量显示，KO（−/−）动物的TEB远端迁移减少，脂肪垫侵入减少，每组n=6个腺体，来自双尾Student T检验的统计数据。C、。与对照腺体（wt/wt）相比，KO（−/−）腺体中分枝点和末端芽的定量显示，末端芽结构增加，分枝点减少。N=每组6个腺体，来自双尾学生T检验的统计数据。
6周龄婴儿的免疫组织化学Tcfap2c型升/升MMTVCre（多媒体电视Cre）+动物（KO）显示乳腺导管内腔MMEC中TCFAP2C蛋白丢失(). TCFAP2C蛋白在KO和对照动物的肌上皮细胞层中表达。细胞角蛋白-5（CK5）和细胞角蛋白-8（CK8）染色的免疫组织化学分别用于识别乳腺上皮内的肌上皮和管腔亚群(). 从定性上讲，KO组和对照组的管腔和基底细胞角蛋白染色模式相似。在6周龄KO乳腺中，大部分导管具有复层上皮，但由于对照人群的差异，在统计学上没有差异（数据未显示）。有趣的是，我们注意到管腔结构中存在CK5阳性细胞()这与对照动物明显不同。此外，KO动物的TEB结构中CK5染色增强。为了量化这些差异，对管腔细胞区CK5阳性细胞的数量进行了计数，并证实与对照动物相比，KO在统计学上显著增加(). 测定了TEB结构中CK5阳性细胞的百分比，并证明KO动物中CK5阴性细胞的百分比在统计学上显著增加().
Tcfap2c基因敲除小鼠的免疫组织化学分析A。6周龄处女对照小鼠和KO小鼠乳腺3的免疫组织化学分析。KO（Tcfap2c−/−)腺体在管腔细胞群中表现出TCFAP2C活性的丧失，但在肌上皮基底细胞群中没有。对照组和KO组动物同一代表性导管的CK5和CK8染色显示肌上皮层的CK5染色和管腔细胞的CK8染色。最后一个小组注意到，KO动物的末端芽（TEB）结构中CK5染色，CK5阳性细胞增多。B。KO动物单细胞衬里乳腺导管结构中管腔细胞CK5染色的示例。C、。CK5染色的定量显示KO动物的统计学增加。D。TEB结构中CK5染色的定量显示KO动物的统计学增加；n=每组3只小鼠，数据来自10 TEB/只小鼠；p=0.01，学生t检验。
在研究TFAP2C敲除对腔性乳腺癌细胞的影响的背景下，我们假设Tcfap2c KO在MMEC中的一些影响可能是由于腔细胞与肌上皮细胞（或基底细胞）室的改变。例如，发现Tcfap2c的KO在管腔内CK5阳性肌上皮细胞增加，表明Tcfap2 c的丢失可能干扰管腔上皮的正常发育。这种影响也可能解释了整个坐骑上的差异。使用内腔和肌上皮细胞的明确标记物进行流式细胞术，以评估上皮细胞室中的内腔和基底细胞群，并进行门控以去除基质元素，以检查Lin−MEC群。对合并和单独分离的乳腺进行FACS分析(). 与对照组相比，从KO腺分离的细胞中，我们发现CD24减少你好CD49f型中间管腔数量（平均减少11.9%，p=0.002）和伴随的CD24增加中间CD49f型你好基础种群（平均增长14.9%，p=0.014）。此外，正常的管腔：基底比率下降，KO腺体的管腔与基底比率平均为对照组的33.4%（p=0.0003）。综上所述，数据强烈表明TCFAP2C基因敲除导致了管腔发育的改变以及从管腔向基底室的转移。
流式细胞术分析Tcfap2c型乳腺缺失A/B公司。单个流式细胞术的代表性图像来自不同的窝。A。CD31-、CD45-和Ter119-阴性（Lin−）细胞来源于从5只对照组和5只KO 10-12周龄成年动物收集的乳腺4。B。从对照动物和KO动物分离的单个乳腺的数据示例。对于FACS分析，对CD31-、CD45-和Ter119-阴性（Lin−）细胞进行门控。C–E类。基于所有实验的流式细胞术定量分析，包括汇总和单个乳腺数据。FACS流量数据的总数为五个对照（wt/wt）和五个KO（−/−）样本（一个FACS来自五个集合腺体，四个FACS则来自单个乳腺）。KO腺体细胞中可识别的管腔细胞在统计学上显著减少(C类)，可识别基底细胞显著增加(D类)以及管腔/基底比率的统计学显著降低(E类); 使用Student T检验进行统计分析。
讨论
临床乳腺癌亚型由基因表达的特征模式定义，可以预测治疗结果和反应。因此，确定建立不同乳腺癌亚型基因表达模式的机制可能会成为新的治疗策略的基础。目前的研究增进了我们对建立管腔型乳腺癌亚型的转录机制的理解，并提供了额外的证据，证明类似的转录机制在乳腺发育过程中影响管腔上皮细胞的发育。数据证明了Tcfap2c在MMEC中建立管腔乳腺室的功能作用，以及TFAP2C在维持激素敏感型乳腺癌管腔分化表型中的关键作用。维持管腔内的激素反应性乳腺癌表型是一个需要TFAP2C和其他转录因子的活跃过程，因为TFAP2C的缺失诱导了基因表达模式的管腔到基底的转变。在两种不同的细胞系中使用siRNA进行短暂敲除，以及在MCF-7细胞克隆中使用靶向TFAP2C mRNA不同区域的shRNA盒进行稳定敲除，都获得了定性相似的结果。尽管在正常乳腺中的影响不如在细胞培养中那么深远，但Tcfap2c型敲除和该过程相对不完整的性质可能与MMTV-核心表达有关，从而限制了Tcfap2c消除的影响程度。然而，在MMEC和人类乳腺癌细胞系中发现平行的分子变化表明，TFAP2C控制的类似转录机制在腔性乳腺发育和腔性乳腺癌中起作用。
诱导管腔向基底细胞转变的转录过程近来引起了人们的极大兴趣。转录因子ELF5被证明可以抑制ERα和一组ERα相关基因，从而促进乳腺癌的基本特征22与TFAP2C的作用类似，PDEF最近被证明可以诱导基底上皮细胞的管腔分化23.英寸p18/墨水4c缺陷小鼠，杂合生殖系突变布尔卡1减少管腔前体细胞的发育，抑制管腔标记物的表达，诱导具有基底样特征的肿瘤24据报道，MMEC室中ErbB3的丢失与Akt和MAPK信号受损有关，并诱导基因表达从管腔模式向基底模式转变25此外，Akt和MAPK信号通路的激活部分挽救了管腔基因表达的变化，表明管腔基因的调控对Akt及MAPK的激活敏感。使用基于MMTV-PyVmT表达的肿瘤模型，ErbB3缺乏动物的乳腺肿瘤显示基础标记CK5的表达增加25腔型乳腺癌细胞系中FOXA1的敲除诱导了腔型表达信号向基础表达信号的部分转变26这些发现与其他研究一致，表明TFAP2C、FOXA1和ERα共同靶向管腔表达簇的许多基因10有趣的是，FOXM1具有相反的作用，并被发现抑制乳腺的管腔分化27与我们的结果类似，FOXM1在控制管腔上皮祖细胞的分化中起着重要作用；FOXM1的KO在妊娠早期破坏了小叶肺泡单位的发育，但在妊娠后期，这些差异不太明显，小鼠乳酸正常。鉴于FOXM1在调节乳腺癌表型中的作用，本文中与TFAP2C相关的数据证实了乳腺发育过程中的基因调节与乳腺癌中管腔相关基因的调节之间的关联。此外，研究结果支持AP-2和叉头转录因子在控制乳腺发育和乳腺癌表型基因表达模式中的关键相互作用。基于这些发现，很明显，管腔表型及其相关基因表达模式的维持是一个依赖于许多转录调节因子活性的积极过程。对维持乳腺癌表型的转录机制的深入理解，有可能改变原发性乳腺癌的临床特征，这将为激素不敏感的腔性乳腺癌或潜在的侵袭性基底癌表型提供新的治疗策略。
乳腺癌干细胞（CSC）被确定位于CD44内+/你好/CD24型−/低肿瘤细胞数量28我们已经证明，管腔乳腺细胞系中TFAP2C的敲低导致CD44的诱导，并导致CD44增加+/你好/CD24型−/低人口。同样，MMEC中Tcfap2c的KO增加了以CD24为特征的基底细胞的百分比中间/CD49f型你好MMEC内的细胞数量。我们尚未直接检查乳腺干细胞（MaSC）室，这需要利用MaSC标记物进行更详细的分析29然而，本文提供的数据得出的结论是，在管腔型乳腺癌中，TFAP2C抑制CD44表达，从而减少表达癌症干细胞标记物的细胞数量。TFAP2C抑制CD44表达的进一步证据是基于最近的研究结果，即在不表达内源性AP-2蛋白的基底乳腺癌细胞系中强制过表达TFAP2C抑制CD44的表达30与其他乳腺癌亚型相比，基底或三阴性乳腺癌具有更高百分比的表达CSC标志物的细胞31,32化疗后具有CSC标志物的细胞百分比增加，表明该肿瘤细胞群的相对耐药性33因此，在基底部乳腺癌中诱导TFAP2C活性从而消除CSC人群可能是单独或与常规化疗联合的有效治疗方法。
总之，我们的发现提供了令人信服的证据，证明TFAP2C在维持管腔型乳腺癌管腔基因表达模式特征方面具有重要作用，并影响正常乳腺管腔细胞类型的发育。管腔型乳腺癌细胞系中TFAP2C的缺失可诱导管腔向基底细胞的转变，并与间充质表达模式的发展有关CDH1/E-钙粘蛋白以及VIN/vimentin（车辆识别号）和CDH2/N-钙粘蛋白表达式。还需要进一步研究，以更全面地描述随着关键转录因子（如TFAP2C）的丢失而发生的管腔-基底细胞转变（或上皮-间质转变，EMT）过程是否诱导了反映临床基底型或三阴性乳腺癌亚型的细胞类型。然而，本文的研究结果表明，改变AP-2因子的转录活性可能导致乳腺癌临床相关表型的改变，从而提供了一种新的治疗方法的潜力。
材料和方法
单元格行
MCF-7和T47-D细胞取自美国型培养物收集中心（ATCC，Manassas，VA，USA），并按照之前所述进行维护34.
稳定细胞系的产生
使用两种不同的MISSION shRNA慢病毒颗粒，基于pLKO.1-puro载体，其中包含靶向TFAP2C Cat#TRCN0000019745（产生克隆45）、Cat#TRCN0000019746（产生克隆46）和非哺乳动物shRNA对照Cat#SHC002（Sigma-Aldrich，St。路易斯，密苏里州，美国）。所有实验均采用早期传代（<20代细胞）。通过测定STR谱并与ANSI/ATCC ASN-0002-2011数据库（人类细胞系认证：STR谱标准化）进行比较，确认MCF-7来源于稳定细胞系。
RNA分离、cDNA合成和实时PCR
使用Rneasy Mini Kit（美国加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）从细胞系中分离出总RNA，并使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（应用生物系统公司，美国加利福尼亚州福斯特市）从1μg总RNA合成cDNA。通过实时定量PCR监测基因表达。TaqMan基因的引物和检测探针为：TFAP2A Hs01029413_m1、TFAP2C Hs00231476_m1，GATA3 Hs00232122_m1和FOXA1 Hs00270129_m1；FBP1 Hs00983323_m1，SFRP1 Hs00610060_m1、CD44 Hs01075861_m1、GAPDH Hs02758991_g1（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）。表达值标准化为18S rRNA 4319413E-0803037（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）的平均值，作为内源性对照。
蛋白质斑点
将蛋白质分离到添加了Halt蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中（cat 78430，Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）。根据制造商的说明，使用以下推荐稀释度的主要抗体进行免疫印迹：TFAP2-α3154-1、TFAP2-γ2384-1、FBP1 3288-1、ERα1115-1、CALD1 1089-1、SFRP1 5467-1、KRT8 2032-1、GSTP1 6689-1、MMP14 2010-1、MUC1 2900-1、MYB 3195-1、RET 3454-1（Epitomics，加利福尼亚州伯灵盖姆，美国）；KIRREL（NEPH1）F-16、GATA3 HG3-31、FOXA1（HNF-3α）Q-6、GPDH 6C5（美国加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司）。
微阵列
所有需要的RNA样品制备、随后的杂交和执行微阵列分析都是在爱荷华大学DNA设施根据制造商推荐的方案完成的。以生物三倍体和技术副本进行排列（因此每个克隆有六排）。简单地说，使用Ambion TotalPrep RNA扩增试剂盒Cat#AMIL1791（Ambion，Austin，TX，USA）将200 ng总RNA转化为扩增的生物素-cRNA。将生物素-cRNA与Illumina杂交缓冲液混合，放置在Illumiana HumanHT-12v4 BeadChips零件号BD-103-0204（Illuminia，San Diego，CA，USA）上。杂交在58°C下进行17小时，并在Illumina杂交烤箱（分类号SE-901-1001）中摇晃（Illuminia，San Diego，CA，USA）。根据Illumina全基因组基因表达直接杂交分析方案，对阵列进行清洗、封闭并用链霉亲和素-Cy3 Cat#PA43001（Amersham/GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA）染色。使用Illumina iScan System ID#N054（Illumina，San Diego，CA，USA）扫描珠芯片，并使用GenomeStudio软件v2011.1（Illumina，San Diego，CA，USA）收集和分析数据。微阵列数据可在NCBI的GEO数据库中获得，登录号为{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE44203”，“term_id”：“44203“}}GSE44203标准.
流式细胞术
根据生产协议，使用小鼠抗人CD44（Pgp-1）Cat#GWB-1F90D6（GenWay Biotech，San Diego，CA，USA）对CD44进行染色，并使用抗人CD24 PE克隆：eBioSN3 Cat#12-0247-42（eBioscience，San Disego，CA，USA，）对CD24进行染色。用FxCycle紫染猫对所有样本进行活细胞对照染色#{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“F10347”，“term_id”：“683005”，“term_text”：“F1 0347”}}10347层（Life Technologies，美国纽约州格兰德岛）。流式细胞术在FACS（荧光激活细胞分选）DiVa（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA）机器上进行。首先在Fx紫罗兰周围选通细胞，然后进行侧向和正向散射，以消除粘附细胞。为CD44和CD24阳性建立门控阈值，以分析CD44+你好/CD24型−低推测的癌症干细胞群体。
TFAP2C乳腺敲除小鼠及其特性研究
携带外显子6 LoxP的小鼠侧翼Tcfap2c型(Tcfap2c型升/升)等位基因从Trevor Williams博士处获得，携带MMTV-Core等位基因的小鼠从Jackson Laboratories（003553，Bar Harbor，ME，USA）购买35所有用于研究的动物均来自F4子代品种，以限制遗传变异。Transnetyx，Inc（美国田纳西州科尔多瓦）对从尾夹活检中采集的组织进行基因分型。所有动物都按照爱荷华州大学动物护理和使用委员会制定的指南进行护理。根据Plante，按照之前的描述完成了整个底座等，使用乳腺435对乳腺3的FFPE样品进行免疫组织化学分析。使用Student的双尾T检验评估整个坐骑测试的数据。
小鼠乳腺流式细胞术
从10–12周龄雌性动物身上分离出乳腺4，并按前述方法制备流式细胞术36,37对于混合腺体分析，我们使用EasySep乳腺干细胞富集试剂盒（cat 19757，干细胞技术，加拿大温哥华），通过在根据制造商的协议进行细胞分析之前去除CD31-、CD45-和Ter119-阳性（lin+）细胞来富集乳腺上皮细胞。对于单腺体分析，使用负门控策略消除Lin+细胞。使用BDFACSCanto II仪器（BD，美国新泽西州富兰克林湖）完成流式细胞术。流式细胞术的抗体均来自BD Biosciences（San Jose，CA，USA），如下所示：CD49f-AlexaFluor 647（克隆GoH3，cat.562494），CD24-FITC（克隆M1/69，cat.56 1777），TER-119-PECy7（克隆TER-119，cat.557853），CD45-PECy7（克隆30-F11，cat.55 2848），CD31-PECy8（克隆390，cat.5.61410），CD16/CD32-FcBlocker（克隆2.4G2，类别553142）。细胞与适当浓度的所有抗体混合培养。在CD24和CD49f分析中，TER-119/CD45/CD31阳性细胞被选通。FlowJo（TreeStar，Inc）完成了计算和门控。对数据进行正态性检验，并使用双尾Student’s T检验进行比较。
致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R01CA109294（PI:R.J.Weigel）、T32CA14862（PI:R J.Weegel）、K99/R00CA158055（PI:W.Zhang）、病理学系启动基金（PI:W·Zhang。PMS由NIH拨款T32CA148062支持。
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