摘要 自噬是一种细胞成分被降解以维持基本活性和生存能力以应对营养限制的过程。 广泛的遗传学研究表明，酵母ATG1激酶在自噬诱导中具有重要作用。 此外，AMP活化蛋白激酶（AMPK）促进自噬，AMPK是关键的能量传感器，调节细胞代谢以维持能量平衡。 相反，雷帕霉素（mTOR）是一种整合生长因子和营养信号的中央细胞生长调节剂，其哺乳动物靶点可抑制自噬。 在这里，我们证明了调节哺乳动物自噬起始激酶Ulk1（酵母ATG1的同源物）的分子机制。 在葡萄糖缺乏的情况下，AMPK通过磷酸化Ser 317和Ser 777直接激活Ulk1来促进自噬。 在营养充足的情况下，高mTOR活性通过磷酸化Ulk1 Ser 757和破坏Ulkl和AMPK之间的相互作用来阻止Ulk 1的激活。 这种协同磷酸化对Ulk1的自噬诱导很重要。 我们的研究揭示了Ulk1调节和自噬诱导对营养信号的响应的信号机制。
在营养缺乏的情况下，细胞会启动一种溶酶体依赖的自我消化过程，称为自噬，细胞质内容物，如受损的蛋白质和细胞器，会被水解产生营养物质和能量，以维持基本的细胞活动 1 – 4 自噬是一个严格调控的过程，自噬缺陷与许多人类疾病密切相关，包括癌症、肌病和神经变性 5 – 7 自噬也与清除病原体和抗原呈递有关 8 – 10 .基因研究 酿酒酵母 定义了自噬机制 11 – 13 在这一机制的组成部分中，ATG1激酶与ATG13和ATG17形成复合物，是自噬启动的关键调节因子 14 – 18 哺乳动物具有ATG1同源物Ulk1和Ulk2（参考文献 19 , 20 )，ATG13和ATG17的哺乳动物对应物分别报告为mATG13与FIP200 三 , 21 – 22 然而，尽管有报道称营养缺乏诱导了适度的Ulk1激活，但Ulkl调节的机制基本上尚不清楚 18 , 21 , 23 .
mTOR复合物1（mTORC1）在自噬中的抑制功能已被证实 24 – 26 .mTORC1活性反映细胞营养状态 27 因此，了解mTORC1如何调节自噬非常重要，因为它可能将营养信号与自噬调节联系起来。 已在酵母中阐明ATG1激酶与TORC1之间的联系 28 .ATG13是ATG1复合体的重要组成部分 29 TORC1对ATG13的磷酸化导致该复合物的破坏 16 , 30 越来越多的报告表明，哺乳动物细胞中的Ulk1和mTORC1之间也存在关系 21 , 23 , 31 然而，mTORC1在自噬调节中的分子基础仍有待解决。 另一个潜在的自噬调节候选基因是AMPK，因为它能感知细胞能量状态以维持能量平衡 32 有证据支持AMPK在应对各种细胞应激（包括葡萄糖饥饿）时诱导自噬中的作用 33 – 37 然而，尽管一般认为AMPK通过在TSC2水平抑制mTORC1来刺激自噬，但AMPK如何调节自噬的分子机制在很大程度上尚不清楚。 38 )和猛禽 39 在本研究中，我们提供了AMPK和mTORC1如何通过Ulk1的协同磷酸化调节自噬的分子见解。
结果 葡萄糖饥饿通过AMPK依赖性磷酸化激活Ulk1蛋白激酶 我们检测了葡萄糖饥饿对Ulk1的影响，并观察到Ulkl在葡萄糖饥饿中的显著激活，如Ulk1autophosphorylation增加所示( 图1a ). 此外，葡萄糖剥夺诱导了Ulk1迁移率的改变，这种改变被磷酸酶治疗逆转，这表明葡萄糖饥饿诱导了Ulk1磷酸化( 图1b ). 这种转变在phos-tag凝胶上更为明显 40 并通过化合物C（6-[4-（2-哌啶-1-乙氧基）-苯基）]-3-吡啶-4-基-吡唑啉[1,5-a]嘧啶对AMPK的抑制而被抑制； 裁判。 41 ; 补充信息，图S1a ). 一直以来，葡萄糖饥饿诱导的Ulk1迁移率变化被AMPKα激酶（DN）突变体的共同表达所抑制，该突变体主要干扰AMPK信号传导，如AMPK底物ACC（乙酰辅酶A羧化酶）磷酸化降低和S6K（p70S6激酶）磷酸化增加所示， mTORC1底物对葡萄糖饥饿的反应( 图1c ). 此外，野生型AMPKα的过度表达足以诱导Ulk1迁移率的改变，即使在富含葡萄糖的条件下，也会被化合物C阻断( 图1c ). 值得注意的是，抑制S6K磷酸化的氨基酸饥饿并没有引起明显的Ulk1迁移率改变或ACC磷酸化。 总之，这些数据表明AMPK可能与葡萄糖饥饿诱导的Ulk1磷酸化有关。
图1。
葡萄糖饥饿通过AMPK依赖的磷酸化激活Ulk1蛋白激酶。 ( 一 )如图所示，HEK293细胞缺乏葡萄糖（4小时），内源性Ulk1被免疫沉淀，并进行了自身磷酸化分析。 蛋白质通过SDS–PAGE进行解析，并通过放射自显影（顶部）或蛋白质印迹（WB；底部）进行可视化。 ( b条 )如图所示，在无葡萄糖培养基中培养细胞（4小时）并进行裂解。 如图所示，用lambda磷酸酶（λPPase）培养裂解液。 western blotting检测内源性Ulk1迁移率。 ( c（c） )将HA–Ulk1与野生型（WT）AMPKα1或激酶死亡（DN）突变体一起转染HEK293细胞。 细胞缺乏葡萄糖（4 h；Glu）或氨基酸（−A.A），并用化合物C（20µM，C.C）处理，如图所示。 通过western blotting测定ACC和S6K的Ulk1迁移率以及磷酸化水平。 ( d日 )从转染的HEK293细胞中免疫纯化HA–Ulk1蛋白，如图所示，该细胞经历了葡萄糖饥饿（4 h）。 用λPPase处理HA–Ulk1蛋白，并且 在体外 在GST–ATG13存在的情况下进行激酶分析。 蛋白质通过SDS-PAGE进行解析； 磷酸化蛋白用放射自显影法显示，HA–Ulk1用western blotting显示，GST–Atg13用考马斯染色显示。 ( e（电子） )在富含葡萄糖的培养基下，从转染的HEK293细胞中免疫纯化HA–Ulk1，并在冷ATP存在下用AMPK处理15分钟，然后按照 d日 . ( （f） )AMPK野生型（WT）和α1/α2双敲除（DKO）MEF在有或无葡萄糖的情况下培养（4 h）。 对内源性Ulk1进行免疫沉淀，并测量自身磷酸化（平均值±标准差。， n个 = 3). 自磷酸化活性标准化为Ulk1蛋白水平； 在富含葡萄糖的条件下，通过对AMPK野生型MEF的Ulk1活性进行归一化，计算相对活性。 ( 克 )将HA–Ulk1与载体（Vec）或AMPKα1激酶缺失突变体（DN）一起转染HEK293细胞。 细胞缺乏葡萄糖（−Glu）或氨基酸（−A.A），或在裂解前用50 nM雷帕霉素（Rapa）处理3 h。 左：自磷酸化活性评估和标准化如 （f） （平均值±标准差。， n个 = 3). 右图：与富营养条件下细胞的Ulk1自磷酸化相比，Ulkl自磷酸化中的折叠诱导。 斑点的未裁剪图像如所示 补充图S5 .
为了确定葡萄糖饥饿诱导的磷酸化对Ulk1活性的影响，用lambda磷酸酶处理从葡萄糖饥饿细胞制备的Ulkl免疫复合物 在体外 然后测量激酶活性。 在这个实验环境中，我们证实磷酸酶被有效去除，因为预先标记的磷酸酶没有去磷酸化 32 P-GST–TSC2发生( 补充信息，图S1b ). 我们观察到，磷酸酶治疗大大降低了葡萄糖饥饿诱导的Ulk1激酶活性，这表现为GST-ATG13的自磷酸化和反磷酸化降低( 图1d ). 同样，lambda磷酸酶处理使内源性Ulk1失活，并增加了Ulkl的流动性( 补充信息，图S1b ). 这些数据表明，葡萄糖饥饿诱导的磷酸化可能有助于Ulk1的激活。
由于葡萄糖饥饿以磷酸化依赖的方式激活了Ulk1，并且这种磷酸化被显性负AMPK或化合物C抑制，我们研究了Ulk 1是否可以被AMPK直接激活。 HA–Ulk1从培养在富含葡萄糖培养基上的转染细胞中免疫沉淀，然后在冷ATP存在下与AMPK孵育 在体外 然后进行Ulk1激酶检测。 AMPK预处理显著增加了Ulk1激酶活性并降低了Ulk 1迁移率( 图1e ). 作为对照，AMPK在缺乏ATP或AMPK抑制剂（化合物C； 补充信息，图S1c )表明AMPK直接磷酸化并激活了Ulk1。 Ulk1自动磷酸化 32 P-autoradiogram不是AMPK污染的结果，因为Ulk1激酶激活突变体（K46R）在相同的实验条件下没有显示任何Ulk1autophosphorylation，即使Ulk1,1 K46R公司 被AMPK磷酸化，表现为迁移率降低( 补充信息，图S1d ). 此外，即使在富含葡萄糖的条件下，AMPK的过度表达也可以激活共同转染的HA–Ulk1，这与葡萄糖饥饿对Ulkl的激活相当( 补充信息，图S1e ).
在自噬过程中，LC3的羧基末端脂质修饰是形成自噬体所需的一种特征鲜明的现象，通过增加电泳迁移率（LC3-II）很容易检测到这种现象 42 葡萄糖饥饿与雷帕霉素处理类似地增加了LC3-II，这种作用被化合物C阻断( 补充信息，图S1f )支持AMPK通过葡萄糖饥饿诱导自噬的作用。 为了进一步确定AMPK在生理条件下Ulk1激活中的功能，我们测量了AMPKα1/α2双敲除（DKO）细胞中的Ulkl活性。 我们观察到内源性Ulk1的基础活性较低，重要的是不能被葡萄糖饥饿激活( 图1f ). 总之，这些数据表明，葡萄糖饥饿诱导的Ulk1激活是由AMPK介导的，AMPK通过磷酸化直接激活Ulkl。
研究了同样诱导自噬的氨基酸饥饿对Ulk1活性的影响。 与最近的报告一致 21 , 23 ，氨基酸饥饿增加了Ulk1自身磷酸化活性( 图1g ). 有趣的是，尽管这些细胞中的总Ulk1活性较低，但氨基酸饥饿仍然可以刺激表达AMPK-DN突变的细胞中的Ulkl活化。 同样，雷帕霉素可以激活这些细胞中的Ulk1。 相反，AMPK-DN在很大程度上阻断了葡萄糖饥饿诱导的Ulk1活化。 这些观察结果与AMPK直接参与细胞能量感应但不参与氨基酸信号传递的事实一致。 一直以来，氨基酸饥饿可诱导自噬标记物LC3脂质氧化（LC3-II， 补充信息，图S1g )和绿色荧光蛋白（GFP）–LC3点形成( 补充信息，图S1h )AMPK-DKO小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中，而这些细胞在葡萄糖饥饿诱导的自噬过程中有缺陷。 这些数据表明，Ulk1激酶可以通过AMPK依赖性（葡萄糖饥饿）和非依赖性（氨基酸饥饿）方式激活。
AMPK通过磷酸化Ser 317和Ser 777激活Ulk1 为了了解AMPK激活Ulk1的机制，我们测定了Ulkl中的AMPK磷酸化位点。 我们最初在Ulk1测试了AMPK共识站点。 令人惊讶的是，Ulk1中AMPK共识位点（Ser 494、Ser 555、Ser 574、Ser622、Thr 624、Ser693和Ser 811）的突变对AMPK的Ulkl磷酸化没有显著影响 在体外 （未显示数据）。 接下来，我们进行了系统的Ulk1缺失实验，发现AMPK磷酸化了Ulk的富含丝氨酸/苏氨酸的结构域（S/T结构域）( 图2a ). 进一步的缺失和突变分析确定Ser 317和Ser 777是主要的AMPK磷酸化位点( 图2b ). Ser 317和Ser 777的突变显著降低了AMPK对全长Ulk1的磷酸化，尽管不是完全降低 在体外 ( 补充信息，图S2a )这表明Ulk1中存在额外的AMPK磷酸化位点。 然而，由于AMPK磷酸化和自身磷酸化导致的葡萄糖饥饿诱导的Ulk1迁移率变化在转染细胞中的S317/777A突变中显著降低( 图2c )表明这两个残基是AMPK对葡萄糖饥饿反应的主要位点 体内 .确认Ulk1磷酸化 体内 制备抗体并验证其对AMPK磷酸化的重组Ulk1片段的特异性 在体外 317号和777号( 补充信息，图S2b ). 使用这些抗体的蛋白质印迹表明，AMPK共转染增加了Ulk1 Ser 317和Ser 777的磷酸化( 图2d ).
图2。
AMPK直接磷酸化Ser 317和Ser 777的Ulk1。 ( 一 )AMPK磷酸化Ulk1 S/T结构域 在体外 顶部：用于绘制磷酸化位点的Ulk1结构域结构和缺失结构的示意图。 小鼠Ulk1蛋白由N末端激酶域（KD；1–278）、丝氨酸/苏氨酸富集域（S/T域，279–828）和C末端域（CTD，829–1051）组成。 底部：从转染的HEK293细胞中免疫纯化所示Flag–Ulk1缺失突变体，并用于 在体外 AMPK分析作为底物。 磷酸化通过 32 western blot检测P-放射自显影和蛋白水平。 ( b条 )Ulk1中AMPK磷酸化位点的测定。 所示的重组GST–Ulk1突变体从 大肠杆菌 ，用作 在体外 AMPK磷酸化。 缺失分析表明，S/T结构域中的两个Ulk1片段279-425和769-782被AMPK高度磷酸化 在体外 Ser 317突变消除了Ulk1片段279-425中的大部分磷酸化。 在片段769–782中，五个丝氨酸残基（Ser 774、Ser 777、Ser 77 8、Ser 7 79和Ser 780）突变为丙氨酸，表示为（769–78 2）5SA，完全消除了AMPK的磷酸化作用。 在该突变背景（769–782）4SA-S777中重组Ser 777，而不是其他四个残基中的任何一个，恢复了AMPK的磷酸化。 GST和GST–TSC2F（TSC2片段1300–1367包含Ser 1345的AMPK磷酸化位点）分别用作AMPK反应的阴性和阳性对照。 磷酸化测定方法 32 考马斯染色检测P-放射自显影和蛋白水平。 ( c（c） )葡萄糖饥饿诱导的Ulk1磷酸化需要Ser 317/Ser 777 体内 将HA–Ulk1和突变体转染到HEK293细胞中。 如图所示，细胞缺糖4小时。 HA–Ulk1进行免疫沉淀，并通过western blot检测其流动性。 ( d日 )AMPK诱导Ulk1 Ser 317和Ser 777的磷酸化。 如图所示，野生型HA–Ulk1或S317/777A突变体与AMPK共同转染到HEK293细胞中。 HA–Ulk1被免疫沉淀（IP），Ser 317和Ser 777的磷酸化被western blotting检测。 斑点的未裁剪图像如所示 补充图S5 .
为了测定内源性Ulk1的Ser 317和Ser 777磷酸化，用磷酸化-Ser 317-和磷酸化-Ser777-特异性抗体检测MEF细胞的总裂解物。 我们发现，葡萄糖饥饿诱导了317号和777号Ser的强烈Ulk1磷酸化( 图3a ). 值得注意的是，这些磷酸化在AMPK DKO细胞中完全减少。 这些数据证明了AMPK在Ulk1 Ser 317和Ser 777磷酸化中的重要作用。 Ser 317和Ser 777的磷酸化在30分钟时出现，在60–120分钟葡萄糖剥夺时达到峰值，这些磷酸化事件在重新添加葡萄糖后120分钟逐渐降至基础水平( 图3b ). 值得注意的是，氨基酸饥饿和雷帕霉素治疗不足以增加Ulk1 Ser 317和Ser 777的磷酸化，因为AMPK未被这些治疗激活。 此外，化合物C抑制了Ulk1的磷酸化，二甲双胍（AMPK激活剂）刺激了Ulk1磷酸化 43 )类似于AMPK底物ACC的磷酸化( 图3c ). 这一结果表明，AMPK激活对于Ulk1 Ser 317和Ser 777在葡萄糖饥饿时的磷酸化是必要的和充分的。 为了确定葡萄糖饥饿时内源性Ulk1 Ser 317/Ser 777磷酸化的水平，我们将内源性Ul k1的相对磷酸化与 在体外 磷酸化的Ulk1，根据迁移率变化，它几乎被AMPK完全磷酸化( 图3d ). 葡萄糖饥饿诱导内源性Ulk1磷酸化至约50%的水平 在体外 磷酸化的Ulk1，表明在葡萄糖饥饿时，内源性Ulkl的很大一部分确实被磷酸化。 这些数据表明，在生理条件下，Ulk1 Ser 317和Ser 777被AMPK磷酸化。
图3。
AMPK依赖性的Ulk1 Ser 317和Ser 777磷酸化是Ulkl激活应对葡萄糖饥饿的必要条件。 ( 一 )如图所示，AMPK野生型或DKO MEF缺乏葡萄糖（4小时）。 对总细胞裂解液进行Ulk1蛋白和磷酸化检测。 ( b条 )Ulk1 Ser 317和Ser 777磷酸化响应葡萄糖饥饿/再添加的时间进程。 MEF在指定时间内缺乏葡萄糖（−Glu）。 饥饿3小时后，将培养物切换至含葡萄糖（25 mM）培养基，并采集样品（Re-Glu）。 同时，用无氨基酸（−A.A）培养基或50 nM雷帕霉素（Rapa）处理细胞3小时( c（c） )Ulk1 Ser 317和Ser 777的磷酸化与AMPK活性相关。 MEF缺乏葡萄糖（4小时），如存在或不存在20µM化合物C（C.C）所示。 同时，在富含葡萄糖的培养基中用2 mM二甲双胍（Met，2 h）处理细胞。 ACC S79的磷酸化被测试为AMPK激活的阳性对照。 ( d日 )葡萄糖饥饿导致Ulk1在Ser 317和Ser 777高度磷酸化 体内 .测定Ulk1磷酸化水平 体内 ，免疫纯化的HA–Ulk1蛋白被AMPK磷酸化 在体外 （100%代表AMPK对Ulk1的完全磷酸化）。 体外 磷酸化的HA–Ulk1按指示稀释，并与在富含葡萄糖（+Glu）或无葡萄糖（−Glu，4h）培养基中生长的细胞的免疫沉淀的HA–Ultk1一起进行免疫印迹。 然后量化条带的密度。 通过这一测量，从葡萄糖缺乏细胞中分离出的大约50%的Ulk1在Ser 317和Ser 777上被磷酸化。 ( e（电子） )从在高糖培养基中生长的转染HEK293细胞中免疫纯化所示HA–Ulk1蛋白，然后在冷ATP存在下与AMPK孵育15分钟 在体外 反应后，通过大量洗涤去除AMPK，在存在的情况下对产生的Ulk1免疫复合物进行激酶活性检测 32 P-ATP。 ( （f） )HA–Ulk1蛋白（野生型或S317/777A突变型）从转染的HEK293细胞中免疫沉淀，在裂解前用葡萄糖或不加葡萄糖孵育细胞（4h）。 安 在体外 在GST–ATG13和FIP200存在下进行激酶反应。 斑点的未裁剪图像如所示 补充图S5 .
接下来，研究了Ser 317和Ser 777磷酸化在Ulk1激活中的功能意义。 AMPK显著激活野生型Ulk1，但未激活激酶活性K46R突变体或磷酸化缺陷型S317/777A突变体 在体外 ( 图3e ). S317/777A背景中单个AMPK共有位点的额外突变并未进一步显著降低Ulk1活性，这表明Ser 317和Ser 777是AMPK诱导Ulkl活化的主要位点( 补充信息，图S2c ). 与 在体外 实验数据，HA–Ulk1 S317/777A型 在转染细胞中，葡萄糖饥饿对其激活程度最低，而野生型HA–Ulk1的激活效率更高( 图3f ). 总之，我们的数据证明了Ser 317/Ser 777磷酸化在葡萄糖饥饿诱导和AMPK依赖性Ulk1激活中的重要性。
mTORC1通过磷酸化Ulk1 Ser 757干扰Ulk1-AMPK相互作用 在酵母中，营养素饥饿促进ATG1–ATG13–ATG17复合物的形成，并伴随ATG1激酶的激活 16 – 17 然而，类似的规定可能不适用于哺乳动物Ulk1，因为Ulkl复合物的形成不受营养物质的调节 22 – 23 相反，我们观察到Ulk1和AMPK之间的相互作用( 图4a ). 缺失分析表明，结合AMPK（α、β和γ）需要S/T结构域，尤其是Ulk1的片段（711-828）； 图4a、b ). 值得注意的是，AMPK结合域与ATG13-和FIP200-结合区（Ulk1、CTD的C末端域）不重叠。 Ulk1-AMPK和Ulk1-ATG13-FIP200的相互作用不受葡萄糖饥饿的影响（数据未显示）。 据报道，酵母TORC1破坏了ATG1复合物 16 ，但mTORC1对Ulk1–mAtg13–FIP200复合物没有类似的影响 22 – 23 有趣的是，我们发现Ulk1和AMPK之间的相互作用被mTORC1破坏。 mTORC1激活剂Rheb的过度表达 44 – 45 、减少Ulk1–AMPK联合免疫沉淀和雷帕霉素抑制Rheb的作用( 图4c ). 雷帕霉素治疗增加了内源性Ulk1和AMPK的相互作用( 图4d ). 考虑到mTORC1可以磷酸化Ulk1的报告，尽管磷酸化位点尚未确定 21 , 23 , 31 ，我们检测了mTORC1是否可以通过磷酸化Ulk1直接调节Ulk1-AMPK相互作用。 免疫沉淀Ulk1与mTORC1孵育 在体外 然后用于下拉AMPK。 mTORC1预培养显著降低了Ulk1下拉AMPK的能力( 图4e ). 这些数据表明，mTORC1通过直接磷酸化Ulk1抑制Ulk1-AMPK相互作用。
图4。
mTORC1干扰Ulk1–AMPK相互作用。 ( 一 )AMPK与Ulk1互动。 将各种Flag–Ulk1缺失突变体与AMPKα/β/γ、Atg13和FIP200一起转染HEK293细胞。 免疫沉淀Flag–Ulk1蛋白（用白色箭头表示），并用western blots检测AMPKα/β/γ、Atg13和FIP200的共同免疫沉淀。 ( b条 )负责AMPK相互作用的Ulk1区域的缺失分析。 所示Flag–Ulk1截断突变体是从共表达AMPK复合物（α/β/γ）的转染HEK293细胞免疫沉淀而来。 通过western blots检测AMPK亚单位的共免疫沉淀。 ( c（c） )Rheb抑制Ulk1–AMPK相互作用。 如图所示，将HA–AMPKα、Flag–Ulk1和Myc–Rheb联合转染到HEK293细胞中。 细胞在裂解前用或不用雷帕霉素（50 nM Rapa）处理1小时。 Flag-Ulk1被免疫沉淀，AMPKα的共免疫沉淀物通过蛋白质印迹法测定。 ( d日 )雷帕霉素处理增强内源性Ulk1和AMPK的相互作用。 从Ulk1或AMPK野生型和敲除（单敲除；KO或双敲除；DKO）MEF中免疫沉淀内源性Ulkl蛋白。 建议使用50 nM雷帕霉素治疗1小时（Rapa）。 western blot检测内源性AMPKα蛋白的共免疫沉淀。 箭头表示AMPKα蛋白。 （e）mTORC1磷酸化抑制Ulk1结合AMPK的能力 在体外 如图所示，用链霉亲和素珠从转染的HEK293细胞中纯化CBP/SBP–Ulk1，并用猛禽免疫沉淀法制备的mTORC1在冷ATP存在下培养Ulk1-珠复合物。 将产生的Ulk1复合物与含有AMPK的细胞裂解物孵育，然后广泛清洗。 western blot检测Ulk1和相关AMPKα。 斑点的未裁剪图像如所示 补充图S5 .
为了了解mTORC1在Ulk1调控中的作用，我们努力确定Ulkl中的mTORC1-磷酸化位点。 我们用mTORC1检测了各种Ulk1缺失的磷酸化 在体外 。如所示 图5a ，Ulk1 S/T结构域（残基279-828）被mTORC1磷酸化。 由于mTORC1磷酸化残基651–1051 在体外 23 ，我们假设mTORC1可能在残基651和828之间磷酸化Ulk1。 值得注意的是，该区域包括AMPK相互作用所需的片段（711-828）。 因此，我们通过mTORC1检测了Ulk1片段（711-828）的磷酸化。 Ulk1（711-828）被mTORC1磷酸化，但不被mTORC磷酸化( 补充信息，图S3a ). 进一步的缺失和诱变分析确定Ser 757为该片段中的mTORC1磷酸化位点( 图5b ). 使用磷酸化Ser 757的特异性抗体，我们发现当Rheb共同表达激活mTORC1时，Ser 757-磷酸化增加，雷帕霉素治疗抑制了Rheb的作用( 图5c ). 正如预期的那样，在Ulk1中未检测到这种磷酸化 S757A型 突变体，证实抗体的特异性。 我们一直观察到Rheb过度表达诱导了Ulk1迁移率的改变，并且这种改变在Ulkl中被消除 S757A型 突变体( 图5d )表明Ser 757是主要的mTORC1磷酸化位点 体内试验。 我们还将Ulk1的氨基末端区域映射为猛禽结合的重要结构域( 补充信息，图S3b )，是mTORC1的底物重结晶亚单位 46 为了进一步评估mTORC1在Ulk1磷酸化中的作用，我们检测了 Tsc1 −/− MEF，mTORC1活性升高 47 内源性Ulk1 Ser 757的磷酸化在 Tsc1型 −/− MEF，但仍被雷帕霉素抑制( 图5e )，证实了Ulk1 Ser 757磷酸化对mTORC1活性的依赖性。 此外，抑制mTORC1的葡萄糖饥饿降低了内源性Ser 757磷酸化( 图5e ). 葡萄糖饥饿导致的Ser 757磷酸化降低在 Tsc1型 −/− MEF，与葡萄糖饥饿对mTORC1的低效抑制相一致 坦桑尼亚先令 突变细胞 38 AMPK是抑制mTORC1以应对葡萄糖缺乏的必要条件 38 – 39 一直以来，葡萄糖饥饿对降低AMPK DKO MEF中Ulk1 Ser 757磷酸化的效果较差( 补充信息，图S3c )，进一步支持mTORC1在Ulk1 Ser 757磷酸化中的作用。
图5。
mTORC1在Ser 757处磷酸化Ulk1。 ( 一 )mTORC1磷酸化Ulk1 S/T结构域。 从转染的HEK293细胞制备Ulk1缺失突变体，用于 在体外 mTORC1分析。 磷酸化通过 32 通过western blot（底部）测定P-放射自显影图（顶部）和蛋白质水平。 ( b条 )Ser 757被mTORC1磷酸化。 左图：所示的重组GST–mUlk1突变体从 大肠杆菌 和用于 在体外 mTORC1分析作为底物。 缺失分析分离出片段（753-771）作为mTORC1的靶点。 Ulk1（753–771）片段包含五个保守的丝氨酸/苏氨酸残基，即Thr 754、Ser 757、Ser 760、Thr 763和Thr 770。 右：Ser 757突变通过mTORC1消除了Ulk1磷酸化 在体外 GST作为mTORC1磷酸化反应的阴性对照。 磷酸化测定方法 32 P-放射自显影（顶部），而蛋白质水平通过考马斯染色检测（底部）。 ( c（c） )Rheb增加Ulk1 Ser 757磷酸化。 从转染的HEK293细胞中免疫沉淀HA-Ulk1野生型和S757A突变体。 提示联合转染Rheb和雷帕霉素（Rapa）治疗。 western blot检测Ulk1 Ser 757磷酸化。 ( d日 )Rheb在野生型Ulk1中诱导迁移，但在Ulkl中没有诱导迁移 S757A型 突变体。 将HA–Ulk1转染到HEK293细胞中，无论是否含有Rheb。 在富含营养的培养基下，从细胞中免疫沉淀HA–Ulk1，并用western blot检测Ulkl的迁移率。 ( e（电子） )内源性Ulk1 Ser 757磷酸化在 Tsc1型 −/− MEF公司。 Tsc1型 +/+ （重量）和 Tsc1型 −/− （KO）MEF缺乏葡萄糖（4小时），或用50 nM雷帕霉素治疗（Rapa，1小时）。 用磷酸化-Ulk1 Ser 757抗体检测内源性Ulk1的Ser757磷酸化。 斑点的未裁剪图像如所示 补充图S5 .
接下来，我们确定了mTORC1依赖性磷酸化对Ulk1–AMPK相互作用的影响。 Ulk1 Ser 757突变为天冬氨酸或丙氨酸，我们发现这两种突变都大大降低了Ulk1-AMPK相互作用( 补充信息，图S3d ). 这不仅仅是因为Ulk1基因突变的全球结构改变 S757A型 仍然可以与Atg13和FIP200关联（未显示数据）。 因此，我们推测该位置（羟基）的化学性质对AMPK相互作用至关重要。 我们用结构上接近丝氨酸的半胱氨酸残基取代了Ser 757，并发现它与AMPK保留了一些相互作用，尽管较弱( 补充信息，图S3d ). 重要的是，S757C突变体和AMPK之间的相互作用不再受Rheb过度表达或雷帕霉素治疗的调节，如联合免疫沉淀法所确定的 体内 ( 图6a ). 此外，在 在体外 下拉试验表明，从雷帕霉素处理的细胞中制备的野生型Ulk1与AMPK的结合比从富含营养的培养条件下培养的细胞中获得的Ulkl更强( 图6b ). 然而，在S757C突变体中未观察到雷帕霉素增加Ulk1–AMPK相互作用的效果。 这些数据表明，mTORC1对Ser 757的磷酸化对调节Ulk1–AMPK相互作用很重要。 与此假设一致，两个AMPK位点Ser 317和Ser 777的磷酸化在 Tsc1型 −/− MEFs( 图6c )或通过Rheb联合转染( 图6d )这两种情况都会导致高mTORC1活性。 如所示 图6d AMPK位点Ser 317和Ser 777以及mTORC1位点Ser 757的磷酸化受激活或抑制AMPK和mTORC 1的条件的相互调节。 葡萄糖饥饿降低了Ulk1 Ser 757磷酸化，但增加了Ser 317和Ser 777磷酸化。 正如预期的那样，化合物C阻断了葡萄糖饥饿效应。相反，Rheb刺激了Ser 757磷酸化，但抑制了Ser 317和Ser 777磷酸化。这些效应被雷帕霉素逆转。 此外，Rheb的过度表达抑制了葡萄糖饥饿诱导的Ulk1活化，GST–Atg13的自磷酸化和转磷酸化证明了这一点( 图6e ). 这些数据表明，mTORC1通过Ulk1 Ser 757的磷酸化破坏了Ulk1-AMPK之间的相互作用，从而阻止了AMPK激活Ulk1-。
图6。
mTORC1对Ulk1 Ser 757的磷酸化抑制Ulk1-AMPK相互作用。 ( 一 )mTORC1需要Ulk1 Ser 757来调节Ulkl与AMPK的相互作用 体内 CBP/SBP标记的Ulk1（野生型或S757C）与HA–AMPKα和Rheb共同转染到HEK293细胞中，如图所示。 用链霉亲和素珠纯化Ulk1，并用western blot检测共沉淀的HA–AMPKα（Rapa，50 nM雷帕霉素处理1 h后细胞裂解）。 ( b条 )雷帕霉素需要Ulk1 Ser 757来增强Ulk1-AMPK相互作用 在体外 CBP/SBP Ulk1蛋白（野生型或S757C）是从转染的HEK293细胞中制备的，如图所示，这些细胞预先与50 nM雷帕霉素（Rapa，1h）孵育。 通过链霉亲和素珠纯化Ulk1蛋白，并将得到的Ulk1-珠与细菌纯化的AMPKα/β/γ复合物孵育。 AMPKα蛋白水平 在体外 使用AMPKα抗体通过western blot检测下拉试验。 有限责任公司。； 长期接触。 ( c（c） )Ulk1中AMPK位点Ser 317和Ser 777的磷酸化在 Tsc1型 −/− MEF公司。 Tsc1型 +/+ （重量）和 Tsc1型 −/− （KO）MEF缺乏葡萄糖（4小时），或用50 nM雷帕霉素治疗（Rapa，1小时）。 用western blotting检测内源性Ulk1的Ser 317和Ser 777磷酸化的Ulkl抗体。 ( d日 )Rheb以依赖于mTORC1的方式抑制Ulk1 Ser 317和Ser 777磷酸化。 如图所示，将HA–Ulk1、AMPKα激酶突变体（DN）和Myc–Rheb联合转染到HEK293细胞中。 用无葡萄糖培养基（−Glu，4 h）培养细胞，其中添加20µM化合物C（C.C.）或50 nM雷帕霉素（Rapa）。 如图所示，用在317、777、757和HA上磷酸化的Ulk1抗体检测总细胞裂解物。 ( e（电子） )Rheb抑制葡萄糖饥饿诱导的Ulk1激活。 将HA–Ulk1和Myc–Rheb转染到HEK293细胞中，在裂解前用无葡萄糖（−Glu）、无氨基酸（−A.A）培养基或50 nM雷帕霉素（Rapa）培养4 h。 对HA–Ulk1进行免疫沉淀，并进行激酶分析。 Ulk1活性的测量方法为 32 P-放射自显影图和检测中使用的HA-Ulk1和GST-Atg13的蛋白质水平分别通过蛋白质印迹和考马斯亮色染色测定。 斑点的未裁剪图像如所示 补充图S5 .
AMPK磷酸化是自噬中Ulk1功能所必需的 为了通过AMPK测定Ulk1磷酸化的生物学功能，将Ulkl野生型和S317/777A突变体引入 乌尔克1 −/− MEF公司( 补充信息，图S4a ). GFP–LC3也被引入这些MEF中，以监测GFP–LC3阳性自噬囊泡( 补充信息，图S4b ). 这个 乌尔克1 −/− （KO）细胞对葡萄糖饥饿敏感，凋亡明显( 图7a ). 敲除Ulk2不会进一步使 乌尔克1 −/− 细胞对葡萄糖的饥饿( 补充信息，图S4c )表明Ulk2在MEF细胞中起次要作用。 这个 乌尔克1 −/− 细胞自噬缺陷，如LC3脂质过氧化、GFP–LC3点形成和自噬体/自溶体形成 42 ( 图7b–d ). 野生型Ulk1（KO-WT）的表达挽救了 乌尔克1 −/− 细胞。 相比之下，Ulk1 S317/777A型 突变体（KO-S317/777A）在保护细胞免受葡萄糖缺乏诱导的凋亡方面效果较差( 图7a ). 在表达Ulk1的细胞中，葡萄糖缺乏诱导的自噬也显著减弱 S317/777A型 LC3脂质化显示的突变( 图7b 和 补充信息图S4d ). 正如预期的那样，葡萄糖饥饿增加了野生型的自噬流量，但没有增加 附件5 −/− 或 乌尔克1 −/− 单元格( 补充信息，图S4d ). 重新表达Ulk1而不是S317/777A突变体恢复了自噬。 一贯地， 乌尔克1 −/− 表达Ulk1的细胞 S317/777A型 GFP–LC3聚集有缺陷( 图7c , S4e系列 )和自噬体/自溶体形成( 图7d , S4f系列 ). 基于上述数据，我们得出结论，通过AMPK磷酸化Ser 317/Ser 777激活Ulk1在葡萄糖饥饿诱导自噬中起着关键作用。
图7。
AMPK磷酸化是葡萄糖饥饿时Ulk1自噬功能所必需的。 ( 一 )Ulk1需要Ser 317/Ser 777来保护细胞免受葡萄糖饥饿。 存活率（24小时，平均值±标准差。， n个 = 4; 顶部）和PARP裂解（8小时；western blot，中部；定量， n个 =2，底部） 乌尔克1 +/+ （重量）， 乌尔克1 −/− （KO）， 乌尔克1 −/− 重新表达野生型Ulk1（KO-WT），以及 乌尔克1 −/− 重新表达Ulk1 S317/777A突变体（KO-S317/777A）MEF。 western blot中的箭头表示PARP无劈开和劈开。 ( b条 )Ulk1 S317/777A突变体在LC3脂质化中受到损害，以应对葡萄糖饥饿。 ULK1 MEF在无葡萄糖培养基中培养指定时间。 通过western blotting测定LC3-II水平，并用α-微管蛋白标准化LC3-II积累，并进行定量（底部， n个 =3，平均值±标准差）。 显示了一个具有代表性的western blot。 本实验中使用的LC3抗体似乎优先识别脂质修饰的LC3-II，后者在凝胶上迁移更快。 ( c（c） )Ulk1 S317/777A突变体在自噬体形成方面存在缺陷。 所示MEF缺乏葡萄糖（4小时），通过共焦显微镜检查GFP–LC3阳性自噬体的形成。 GFP–LC3； 绿色和DAPI； 蓝色。 比例尺，20µm。 ( d日 )用电子显微镜进行自噬液泡分析。 低清晰度图像 乌尔克1 −/− （KO，左上面板）， 乌尔克1 −/− 用野生型Ulk1（KO-WT，两个中间面板，附带高倍图像）进行重建，以及 乌尔克1 −/− 图中显示了用Ulk1 S317/777A（KO-S317/777A，左下面板）重建的。 右上和右下面板显示了KO-WT自噬体的高分辨率图像。 低倍图像上的箭头和高倍图像中的箭头所示的自噬体/自溶体样结构。 比例尺； 低倍率，1µm； 高增感，200nm。
讨论 作为一种自噬启动激酶，Ulk1调节机制对理解自噬调节至关重要。 这项研究证明了上游信号激活Ulk1的生化机制以及这种调节在自噬诱导中的功能重要性。 AMPK感应细胞能量状态并通过协调级联激活Ulk1激酶( 图8 ). 在葡萄糖缺乏的情况下，激活的AMPK抑制mTORC1以减轻Ser 757磷酸化，导致Ulk1–AMPK相互作用。 然后，AMPK磷酸化Ser 317和Ser 777上的Ulk1，激活Ulkl激酶，最终导致自噬诱导。 值得注意的是，最近的自噬相互作用蛋白质组 48 和联合免疫沉淀研究 49 也显示了Ulk1和AMPK之间的物理相互作用，这与我们的发现一致。 尽管AMPK可能磷酸化其他可能有助于Ulk1激活的位点，但为了激活Ulkl和有效诱导自噬以应对葡萄糖饥饿，需要磷酸化Ser 317/Ser 777。 我们注意到小鼠Ulk1中的Ser 777在人类Ulkl中不保守，这表明AMPK对人类Ulk中其他位点的磷酸化也可能有助于其在葡萄糖饥饿时的激活。 此外，Ser 317和Ser 777与AMPK共识基序不匹配 39 , 50 有趣的是，Ser 317和Ser 777都位于假定的AMPK共识位点的三个残基C末端，即Ser 314和Ser 77。 需要进一步研究来测试这是否代表一个新的AMPK识别基序。
图8。
AMPK和mTORC1对葡萄糖信号的Ulk1调节模型。 左图：当葡萄糖充足时，AMPK不活跃，mTORC1活跃。 活性mTORC1磷酸化Ser 757上的Ulk1，以防止Ulkl与AMPK相互作用并被AMPK激活。 右：当细胞能量水平受限时，AMPK被激活，mTORC1被AMPK通过TSC2和猛禽的磷酸化被抑制。 Ser 757的磷酸化减少，随后Ulk1可以与Ser 317和Ser 777上的AMPK相互作用并被其磷酸化。 AMPK-磷酸化的Ulk1激活，然后启动自噬。
TORC1是最重要的自噬调节因子之一。 最近，DAP1（死亡相关蛋白1）被报道为一种新的mTORC1底物，在自噬中具有抑制作用 51 在这里，我们证明mTORC1通过磷酸化Ulk1 Ser 757并干扰其与AMPK的相互作用来抑制Ulk 1的激活。 我们的研究扩展了mTORC1调控网络，其中Ulk1磷酸化代表了mTORC生物学的分解代谢臂。 然而，值得注意的是，通过氨基酸饥饿或雷帕霉素治疗抑制mTORC1可以以AMPK非依赖性的方式激活Ulk1，因为这些条件足以激活Ulk 1并诱导自噬，但不能激活AMPK。 因此，未来的研究需要全面了解Ulk1的调节，尤其是对氨基酸饥饿的反应。
mTORC1和AMPK对Ulk1的协同磷酸化可能为信号整合提供了一种机制，因此细胞可以对复杂的细胞外环境做出适当的反应。 例如，在适度葡萄糖限制和足够氨基酸的条件下，细胞有利于调节代谢，但不会启动自噬。 在这种情况下，AMPK的激活应通过磷酸化代谢酶改变细胞代谢，以促进氨基酸利用以生产能量。 尽管AMPK会抑制mTORC1，但当氨基酸可用时，不应完全抑制mTORC。 剩余的mTORC1活性可能阻止Ulk1激活，从而最小化自噬的启动。 因此，mTORC1和AMPK对Ulk1的磷酸化可以确保自噬不会启动，除非出现严重的饥饿状况。
将Ulk1确定为mTORC1和AMPK的直接靶点，是朝着了解细胞营养传感器/积分器如何调节自噬机制迈出的重要一步。 为了了解Ulk1激活如何导致自噬程序启动，针对识别Ulkl生理底物的进一步研究至关重要。
方法 抗体和试剂 抗-PARP（#9542，1:1000）、AMPKα（#2532，1:100）和LC3（#2775，1:2000）抗体购自细胞信号技术。 抗-Ulk1（A7481，1:1000）和α-微管蛋白（T6199，1:10000）抗体是从Sigma获得的，抗-HA（1:4000）和Myc抗体是从Covance获得的。 用磷酸肽免疫兔子，产生抗磷酸化Ser 317和Ser 757抗体。 磷酸特异性抗体经亲和纯化（细胞信号技术）。 用免疫家兔（Biomyx）制备抗磷蛋白Ser 777抗体。 HA–Ulk1野生型和GFP–LC3表达结构分别由J.Chung（韩国首尔国立大学）和N.Mizushima（日本东京医学和牙科大学）提供。 根据Quik-Change突变（Stratagene）进行突变。
细胞培养、转染与病毒感染 HEK293细胞或HEK293T在含有10%胎牛血清（FBS；Invitrogen）和50µg ml −1 青霉素/链霉素。 MEF在补充有β-巯基乙醇（Invitrogen）、1 mM丙酮酸和非必需氨基酸混合物（Invit罗gen）的DMEM培养基（完整培养基）中生长。 用聚乙烯亚胺（PEI）进行转染，如下所述 三 为了产生表达野生型或所示突变小鼠Ulk1蛋白的稳定细胞，用pQCXIH（Clontech）空载体或表达CBP（钙调蛋白结合肽）/SBP（链霉亲和素结合肽）的mUlkl构建物转染293个凤凰逆转录病毒包装细胞，进行逆转录病毒感染 mUlk1蛋白的N末端。 转染后（48小时），逆转录病毒上清液补充5µg ml −1 通过0.45-µm注射器过滤器过滤的聚brene，用于感染 乌尔克1 −/− （Ulk1 KO）MEFs。 感染后（36 h），用0.2 mg ml −1 完整培养基中的潮霉素（Invitrogen）。 为了在Ulk1-KO背景下建立Ulk2敲除稳定细胞，需要构建包含shRNA靶向小鼠的慢病毒构建物（pLKO.1-TRC系统，Addgene） Ulk2公司 （2592–2612，正向寡核苷酸：5′-CCGGaacctgagctgacatctCGAGAG AGATGTCACAGCTCAGGTT公司 TTTTT C-3′； 反式寡核苷酸：5′-AATTGAAAAAAaaccctgagctgacatctCTCGAGAG AGATGTCACAGCTCAGGTT公司 -3′; 小写字符和斜体字符分别是靶区的正反义序列），并与病毒包装质粒（psPAX2和pMD2.G）共同转染到HEK293T细胞中。 病毒上清液通过0.45-µm过滤器过滤，并应用于Ulk1-KO MEF。 在5µg ml的条件下获得稳定的池 −1 嘌呤霉素（西格玛）。
蛋白质印迹和免疫沉淀 用轻度溶解缓冲液（MLB；10 mM Tris，pH 7.5，2 mM EDTA，100 mM NaCl，1%NP-40，50 mM NaF，1 mM Na 三 VO（旁白） 4 蛋白酶抑制剂鸡尾酒； 罗氏）。 这些细胞裂解物用于西方分析。 对于免疫沉淀，所示抗体与TBST中1%牛血清白蛋白（BSA）中的蛋白G–Sepharose（Amersham bioscience）偶联（20 mM Tris，pH 8.0，170 mM NaCl和0.05%吐温-20）。 将该免疫复合物添加到细胞裂解物中，并在4°C下孵育2 h。在分析之前，用MLB将所得珠清洗五次。
蛋白质纯化和激酶分析 将含有指示基因的细菌表达构建物（pGEXKG）转化为 大肠杆菌 DH5α。 在0.5 mM IPTG（异丙基β- d日 -1-硫代吡喃半乳糖苷）在18°C下。 细胞在含有0.5%Triton X-100和2 mMβ-巯基乙醇的PBS中重新悬浮，然后进行超声处理。 根据制造商的协议（Amersham Bioscience），使用谷胱甘肽珠通过一步纯化蛋白质。 在pH 8.0和10%甘油的条件下，用20 mM Tris透析纯化的蛋白质。 纯化的细菌GST–Ulk1蛋白（0.5µg）用作mTOR或AMPK分析的底物，以确定磷酸化位点。 对于mTOR分析，从HEK293细胞制备mTORC1，其中Myc-mTOR和HA–Raptor被联合转染。 用Raptor免疫沉淀mTORC1，通过添加过量的HA肽从珠中洗脱，然后用脱盐旋转柱脱盐。 对于AMPK分析，使用10 ng纯化的AMPKα/β/γ复合物（细胞信号技术）。 mTORC1（参考。 4 )和AMPK（参考。 5 )如前所述进行分析。 GST–Ulk1蛋白的磷酸化由 32 P-自动放射自显影。
体外 Ulk1激酶测定
如图所示，用HA（Covance）或内源性Ulk1（Santa Cruz，N-17）抗体免疫沉淀Ulk 1蛋白。 免疫复合物用MLB（一次）和RIPA缓冲液（50 mM Tris，pH7.5，150 mM NaCl，50 mM NaF，1 mM EDTA，1 mM-EGTA，0.05%SDS，1%Triton X-100和0.5%脱氧胆酸盐）广泛洗涤两次，然后用含有20 mM HEPES的激酶分析缓冲液洗涤，pH7.4，1mM EGTA，0.4 mM EDTA,5 mM MgCl 2 和0.05 mM DTT（二硫苏糖醇）。 对于Ulk1自动磷酸化检测，免疫沉淀的Ulkl珠在含有10µM冷ATP和2µCi[γ- 32 P] 每次反应的ATP。 对于使用GST–ATG13和/或FIP200进行的激酶分析，从转染的HEK293细胞中对GST–ATA13进行细菌纯化，对HA–FIP200蛋白进行免疫纯化，并通过添加过量的HA肽（Sigma）进行洗脱。 通过脱盐自旋柱（Pierce）去除HA肽。 激酶反应在37°C下进行30分钟，通过添加SDS样品缓冲液终止反应，并进行SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和放射自显影。
Lambda磷酸酶/AMPK治疗 在体外 为了评估磷酸化对Ulk1激酶活性的影响，用lambda磷酸酶或AMPK对Ulk 1进行预培养 在体外 首先，细胞缺乏葡萄糖（4小时），然后如图所示免疫沉淀Ulk1（内源性Ulkl或HA标记的Ulk2）。 将Ulk1免疫复合物与磷酸酶缓冲液中的5U lambda磷酸酶（细胞信号技术）或添加0.2 mM AMP和0.1 mM冷ATP的激酶分析缓冲液中5 ng纯化的AMPK（细胞信号科技）孵育15分钟。 用RIPA缓冲液和激酶分析缓冲液对Ulk1结合珠进行广泛清洗，并通过离心回收。 检测产生的Ulk1–珠的Ulk 1自动磷酸化和/或GST–ATG13磷酸化[ 32 P] ATP。 为了排除残留AMPK或lambda磷酸酶污染可能影响Ulk1自动磷酸化（或GST-ATG13磷酸化）、激酶活性Ulkl（K46R）的自动磷酸化或 32 分别检测P预标记GST-TSC2（TSC2片段1300-1367中Ser 1345的磷酸化）作为AMPK和lambda磷酸酶的对照。
体外 下拉试验
如图所示，将CBP/SBP–Ulk1（野生型或S757C突变型）和Myc–Rheb联合转染到HEK293细胞中。 用或不用50 nM雷帕霉素处理细胞1小时，然后用链霉亲和素珠纯化Ulk1蛋白。 将得到的Ulk1–珠与细菌纯化的AMPKα/β/γ复合物孵育，并通过离心回收。 用MLB广泛清洗珠子。 For 在体外 通过mTOR对Ulk1进行磷酸化，从转染的HEK293细胞中纯化CBP/SBP–Ulkl蛋白，将其与50 nM雷帕霉素孵育1 h，以去除Ulk 1上任何mTORC1诱导的磷酸化，然后在补充20µM冷ATP的激酶分析缓冲液中与mTORCl孵育30 min。 Ulk1免疫复合物用RIPA缓冲液广泛清洗，并通过离心回收。 将得到的Ulk1蛋白与100 ng细菌纯化的AMPKα/β/γ复合物或包括内源性AMPK复合物在内的总细胞裂解物在4°C下培养15分钟，然后进行MLB洗涤三次。 通过添加SDS/样品缓冲液洗脱珠上的蛋白质，并使用Ulk1和AMPKα抗体进行SDS-PAGE和western blot。
GFP–LC3荧光分析 将稳定表达GFP–LC3的MEF镀在玻璃盖玻片上。 第二天，在实验前用完整的培养基替换培养基4小时。 葡萄糖饥饿4h诱导自噬。细胞用2%多聚甲醛固定20min，用PBS冲洗两次。 细胞在共焦显微镜（蔡司LSM，×64 PlanAPO油透镜）下安装和可视化。 为了量化GFP–LC3阳性自噬体，随机选择了五种不同的共聚焦显微镜图像，并在具有相同亮度和对比度设置的图像上检查GFP阳性点。 显示五个以上强GFP阳性点的细胞被计数为GFP–LC3自噬体。 通过DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）细胞核染色测定图像上的细胞总数。
电子显微镜 MEF在改良的Karnovsky固色剂（1.5%戊二醛、3%多聚甲醛和5%蔗糖，0.1 M二氯代甲酸缓冲液，pH 7.4）中固定8 h，然后在0.1 M二甲酸缓冲液中用1%四氧化锇处理额外1 h。MEF在1%醋酸铀酰中染色，并在乙醇中脱水。 将样品嵌入环氧树脂中，切片（60–70 nm），并放置在Formvar和碳涂层铜格栅上。 网格用乙酸铀酰和硝酸铅染色，图像使用JEOL 1200EX II（JEOL）透射电子显微镜获得，并在Gatan数码相机（Gatan）上拍摄。
致谢 我们感谢关实验室成员的讨论和试剂。 我们特别感谢I.Lian和C.Fang的技术援助，以及M.Farquhar、K.Kudicka和T.Meerloo在电子显微镜方面的帮助。 这项工作得到了NIH拨款GM51586和GM62694（给K.-L.G.）的支持。
脚注
注：补充信息可在Nature Cell Biology网站上获得
作者贡献
J.K.进行了实验； M.K.和B.V.分别建立了AMPK和Ulk1淘汰赛MEF； J.K.和K.-L.G.设计了实验，分析了数据并撰写了论文。 所有作者都对结果进行了讨论，并对手稿进行了评论。
竞争性金融利益
作者声明，他们没有相互竞争的经济利益。
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