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自然。作者手稿；PMC 2014年10月3日提供。
以最终编辑形式发布为：
自然。2014年4月3日；508(7494): 55–60.
2014年3月26日在线发布。 数字对象标识：10.1038/自然13165
预防性维修识别码：下午3976267
EMSID:EMS57101标准
PMID：24670647

毛细血管周细胞在健康和疾病中调节脑血流

凯瑟琳·霍尔，#1 克莱尔·雷内尔，#1 博迪尔·盖斯林，#2 尼古拉·汉密尔顿，#1 阿努沙·米什拉，#1 布拉德·萨瑟兰，三 弗格斯·M·奥法雷尔，1 阿拉斯泰尔·巴肯，三 马丁·劳里岑，2和戴维·阿特维尔1
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摘要

脑血流量增加，由神经元活动、能量神经计算诱发，是BOLD功能成像的基础。血液流动是完全由小动脉平滑肌控制，还是也由毛细血管周细胞控制，这是有争议的。我们证明，神经元活动和神经递质谷氨酸通过积极放松周细胞而引起信使的释放，从而扩张毛细血管。扩张由前列腺素E介导2但需要释放一氧化氮来抑制血管收缩性20-HETE的合成。体内当感觉输入增加血流量时，毛细血管在小动脉前扩张，估计会产生84%的血流量增加。在病理学上，缺血引起周细胞的毛细血管收缩。我们发现，这之后是周细胞在僵硬中死亡，这可能会不可逆转地收缩毛细血管并破坏血脑屏障。因此，周细胞是脑血流的主要调节器和功能成像信号的发起者。防止周细胞收缩和死亡可能会减少中风后对神经元造成损害的长期血流减少。

周细胞是毛细血管上分离的收缩细胞，可以调节脑血流1，2（以及稳定新形成的毛细血管三维持血脑屏障4-6，导致病理学中的“神经胶质瘢痕”7具有干细胞特性8). 周细胞可被神经递质收缩和扩张在体外1，9通过对信号通路了解不足，毛细血管血流异质性可能反映周细胞张力的差异10-12.周细胞会收缩体内，但有人建议2他们不会主动放松以增加血流13围绕周细胞在病理学中对血流的影响也存在类似的争议14，15我们现在已经描述了新皮质和小脑周细胞对神经元活动和缺血的反应。令人惊讶的是，我们证明周细胞是神经元活动过程中第一个扩张的血管元件，使它们成为功能成像信号的发起者。此外，他们很容易死于缺血性疾病，而缺血性疾病可能会加剧大脑损伤。

信号调节周细胞扩张

我们评估了小脑切片中扩张分子层毛细血管的信号系统1，使用95%或20%O2在超液中产生超常或生理[O2]在切片中16，17毛细血管被定义为直径小于10μm的血管，缺乏连续的平滑肌层。它们的直径较大（p=2.3×10−4)在下部[O2]20%时为5.36±0.30μm（n=59），95%O时为4.07±0.14μm（n=154）2). 毛细血管周细胞可以通过标记NG2蛋白聚糖或PDGFRβ受体来识别(图1a)，或在NG2启动子的控制下使用表达DsRed的小鼠18(图1b、c)和是与表达Iba1的血管周围小胶质细胞/巨噬细胞不同的细胞类别19(图1c). 对于P21大鼠的新皮质毛细血管，周细胞体密度为2.2±0.2/100μm毛细血管长度（在11个共聚焦堆栈中分析了950μm的毛细血管）。周细胞沿着血管及其周围延伸过程(图1a-c)调节毛细血管直径。

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控制毛细血管直径的信号通路

一异凝集素B标记大鼠小脑分子层毛细血管4; 周细胞（箭头）标记NG2或PDGFRβ抗体。b条NG2-DsRed小鼠小脑毛细血管；周细胞呈红色。c（c）NG2-DsRed小鼠新皮质毛细血管；标记为Iba1的小胶质细胞。d日大鼠小脑毛细血管对2μM去甲肾上腺素（NA）和500μM谷氨酸盐（Glut）的反应。线显示流明直径。e（电子）NA-诱发的长时间收缩（95%O2; 为了清晰起见，图中显示了一个大的收缩）。（f）NA中的直径不受[O影响2]（图表显示用药前基线直径的百分比）。克麸质扩张毛细血管（20%O2; 为了清晰起见，显示了较大的膨胀）。小时低[O时扩张较大2].我NOS阻断剂L-NG公司-硝基精氨酸（L-NNA，100μM）抑制谷氨酸诱发的舒张（20%O2).j个鸟苷酸环化酶阻滞剂ODQ（10μM）不能阻止扩张（20%O2).k个阻断20-HETE的产生（HET0016，1μM）消除了L-NNA（20%O）的抑制作用2).我L-NNA在高和低[O时减少谷蛋白诱发的扩张2]（方差分析p=0.002；事后t检验的p值）。米ODQ不影响谷蛋白激发的舒张功能。n个HET0016取消了L-NNA的作用。o、 第页阻塞EP4受体（L161982，1μM）抑制谷氨酸诱发的舒张（o，20%o2)高和低[O2]（p）。d-p的数据来自大鼠小脑毛细血管。q个欧洲药典4阻断消除大鼠新皮质毛细血管中谷氨酸引起的扩张（20%O2). 药物对基线直径的影响外部数据图2。

在不使用任何药物的情况下超过60分钟，毛细血管直径非常稳定（参见图4（见下文）。应用去甲肾上腺素（2μM）模拟其从蓝斑释放体内产生周细胞介导的持续收缩1(图1d-e)，不受[O影响2] (图1f). 叠加谷氨酸（500μM），模拟神经元谷氨酸释放13周细胞部位毛细血管扩张1(图1d，g;补充视频1). 作为不含药物的直径的百分比，20%时的扩张是95%时的两倍2(图1h)，可能是由于低[O]时血管收缩20-HETE的产生较少2]（见下文和外部数据图1). 独立于[O2]，大多数周细胞（95%O中72%2; 20%O中70%2)去甲肾上腺素收缩>5%，谷氨酸扩张>5%（95%O中为63%2（n=154）；20%O中66%2（n=59），大多数被去甲肾上腺素收缩的周细胞也扩张为谷氨酸（在95%的O中为71%2; 20%O中78%2). 在没有去甲肾上腺素的情况下，谷氨酸也会扩张一些毛细血管：在20%的氧中2，29%（7/24）周细胞扩张>5%，这是较少的（Chi2p=0.005），而66%的周细胞在应用去甲肾上腺素后扩张>5%。下面，去甲肾上腺素被用于预收缩毛细血管，以帮助分析谷氨酸引起的扩张的潜在信号。

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缺血时，周细胞收缩毛细血管，然后僵硬死亡

一上图：正常溶液中大鼠皮层切片中的毛细血管。底部：毛细血管暴露于模拟缺血。右：一小时后碘化丙啶（PI）标记，显示周细胞（P）和内皮细胞（EC）死亡。b条在指定区域，a中的血管直径随时间变化。c（c）缺血状态下9条毛细血管（在18个位置测量）和正常溶液中6条毛细血管的周细胞平均直径和死亡数/（100μm）（13个位置）。缺血直径与对照组相比减小（p=1.3×10−15和7.7.×10−1730分钟和60分钟）。缺血40分钟和60分钟时周细胞死亡较高（Mann-Whitney p=0.041和0.021）。在非缺血切片中，一些周细胞也在毛细血管上死亡，但没有收缩毛细血管（2条血管上有3个周细胞死亡，直径减少1.3±1.5%）。

这些实验并没有确定去甲肾上腺素和谷氨酸作用于哪些细胞，可能是神经元、星形胶质细胞或周细胞本身13，释放控制周细胞张力的下游信使。然而，我们可以排除去甲肾上腺素产生20-HETE来收缩周细胞的想法，因为用1μM HET0016阻断20-HETE合成并不影响去甲肾上腺素诱发的收缩(外部数据图2b，g).

谷氨酸通过激活NMDA受体释放一氧化氮（NO），这是一种血管舒张剂13NO供体（DETA-NONOate，100μM）诱发毛细血管扩张(外部数据图2米). 用L-N阻断NO合成酶G公司-硝基精氨酸（L-NNA，100μM）减少了谷氨酸引起的扩张(图1i、l; 方差分析p=0.002；使用的L-NNA和其他阻滞剂不能抑制去甲肾上腺素诱发的收缩：外部数据图2). 令人惊讶的是，ODQ（10μM，ANOVA p=1）阻断鸟苷酸环化酶不会影响扩张，因此NO不会通过升高周细胞中的[cGMP]发挥作用(图1j，m，外部数据图2e). 然而，当使用HET0016（1μM）阻断血管收缩20-HETE的产生时，L-NNA不再抑制扩张(图1k，n，l和n中黑色条的方差分析，p=0.0005），这意味着NO通过阻止20-HETE的形成促进扩张。由于在NO和20-HETE合成均被阻断的情况下发生了稳健的扩张(图1k，n)，另一个信使必须处于活动状态。用MS-PPOH（10μM）阻断花生四烯酸环氧衍生物的合成不影响扩张(外部数据图2i，方差分析p=0.92），但阻断EP4前列腺素E受体2（使用1μM L-161982）大大减少了(图1o-p，方差分析p=0.001）。阻断EP对毛细血管扩张的类似抑制作用4新皮质周细胞中可见受体(图1q，p=0.004）。使用前列腺素E2自身扩张的小脑毛细血管(外部数据图2n). 因此，我们将谷氨酸引起毛细血管扩张的信使确定为前列腺素E2（或在EP活跃的相关物种4受体），但这种扩张需要释放NO来抑制20-HETE的形成(外部数据图1b).

谷氨酸（500μM）或NMDA（100μM）(图2a-b、d)，或平行纤维刺激(图2c-d)，在斑贴于−55至−75 mV的周细胞中诱发外向膜电流（有时之前会有小内向电流：外部数据图3). 通过TTX阻断动作电位，抑制了刺激诱发的外向电流（配对t检验p=0.005）(图2c，在没有TTX的情况下降低到其振幅的15±12%（n=4），与零没有显著差异，p=0.28），而NMDA诱发电流不受TTX的影响（降低了12±19%，n=5，p=0.56），这与通过产生释放谷氨酸的动作电位来唤起外向电流的刺激一致。约30pA的刺激诱发电流有望使细胞超极化约9mV（见方法），并降低电压门控钙2+进入，导致主动放松9（尽管其他Ca2+来源和环状核苷酸也可能调节收缩张力9，20). 事实上，平行纤维刺激在20%O的21个毛细血管中产生了14.9±3.1%的扩张2(图2e-h;补充视频2)（与去甲肾上腺素诱发的收缩不同）通过TTX和EP阻断4受体(图2g-h).

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小脑片周细胞膜电流与毛细血管扩张

一小鼠小脑分子层中的DsRed标记的斑贴周细胞。吸管中的荧光素黄色与DsRed重叠。b条谷氨酸（Glut，500μM）和NMDA（100μM）诱发外向电流（−55mV）。c（c）平行纤维刺激诱发的外向电流（-74mV）被1μM TTX阻断。d日刺激、谷氨酸和NMDA（b-d）诱发的平均外向电流为95%2).电子-传真大鼠小脑薄片平行纤维刺激（NA 1μM）引起毛细血管扩张（20%O2).g-h（克-小时）NA收缩（g）不受TTX或EP的影响4阻断（L161982），取消刺激诱发的扩张（h）。利用Dunnett的事后检验从单因素方差分析得出P值。

负电位的外向电流与谷氨酸能离子型受体的激活不一致，但与钾离子型受体一致+电流激活。这些数据表明谷氨酸释放产生PgE2通过激活向外的K来扩张毛细血管+周细胞电流。PgE公司2类似地激活向外的K+主动脉平滑肌电流21，并使肾周细胞松弛22。

周细胞增加血流体内

评估周细胞松弛是否调节血流体内，我们电刺激触须垫（3Hz），并使用体感皮层血管系统的双光子成像（用FITC-右旋糖酐标记）来监测周细胞中表达DsRed的麻醉小鼠的穿透小动脉（从软脑膜进入皮层）和毛细血管的扩张(图3a). 毛细管直径体内633个毛细血管区域为4.4±0.1μm(外部数据表1). 周细胞在皮层（2/3层）深200μm处可见。短暂的触须垫刺激（2秒）诱发血管扩张，在刺激结束后达到峰值（约2.5秒，图3b). 较长（15秒）的刺激产生的扩张最初遵循相同的时间过程，然后在整个刺激过程中进一步扩张(图3b，外部数据图4). 大多数成像采用15秒刺激，这增加了响应幅度和测量精度。重复刺激产生可重复的反应(外部数据图5a-b). 我们根据血管的分支顺序来分割血管系统，零是穿透性小动脉，一是从小动脉分支出来的主要毛细血管，等等（参见外部数据图1、和外部数据表1对于静止直径、扩张和每种血管的数量）。触须垫刺激所有级别的扩张血管(图3c，外部数据表1). 在穿透性小动脉和一级毛细血管中，反应血管的比例（即扩张>5%）相似，而毛细血管反应的频率随着级数的增加而降低(图3c).

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周细胞主动扩张毛细血管体内在小鼠大脑皮层

一FITC-右旋糖酐填充血管的共焦叠加（90μm厚，最大强度投影）体内NG2-DsRed小鼠体感皮层（周细胞为红色）。放大（单幅图像）显示一个穿透性小动脉（0级）发出毛细血管（1级），毛细血管分裂为2级分支。b条45个毛细血管区域对2s和15s触须垫刺激的反应。c（c）不同级别的血管区域的百分比（在条形图上研究的数量）显示对刺激的扩张大于5%。d日穿透小动脉和一级毛细血管的同步成像（顶部，线条显示测量位置）：毛细血管在小动脉前3s扩张（底部：d-g中的平滑解释见方法和外部数据图4).e（电子）同时成像的穿透小动脉和一级毛细血管的扩张时间过程。（f）（j-1）级血管达到峰值扩张10%的时间（j≥4时为3级）减去j级血管的峰值扩张时间。毛细血管比小动脉扩张得快。克所有有反应（>5%）的穿透小动脉和一级和二级毛细血管的扩张时间过程。插入扩展初始响应。小时所有0-2阶反应血管达到峰值扩张10%的时间。我周细胞扩张大于5%的毛细血管部位百分比。j个464个周细胞和168个非周细胞位置毛细血管直径变化的累积概率（包括扩张<5%的“无反应”毛细血管）。直径变化<0%（收缩）代表随机变化和测量误差。k个j分布的平均响应（来自Mann-Whitney U检验的p）。

为了确定血管舒张的起始位置，我们同时对不同级别的血管成像。引人注目的是，一级毛细血管通常在穿透小动脉之前扩张(图3d-e;补充视频3)毛细血管扩张开始时间（评估为达到最大扩张10%的时间）比穿透性小动脉早1.38±0.38s(图3e-f，p=0.015）。沿着血管树，同时成像的相邻级毛细血管的扩张时间没有显著差异(图3f，外部数据图5c). 因此，毛细血管在进入毛细血管之前扩张。对相同顺序的所有血管（不仅仅是同时成像的血管）进行平均显示，毛细血管的扩张速度与穿透小动脉的扩张速度相似(图3g)穿透小动脉达到最大扩张10%的时间（3.7±0.3s）明显长于一级和二级毛细血管的值（~2.7s）（分别为p=0.040和0.039，图3h，外部数据图5d). 正如预期的那样，毛细血管中血流增加的时间进程，通过线扫描红细胞运动的速度进行评估23，随时间推移而增加，类似于毛细血管扩张(外部数据图5f).

毛细血管与小动脉相比扩张速度更快，表明毛细血管扩张不是对小动脉扩张产生的压力增加的被动反应。为了评估周细胞是否产生这种扩张，我们测量了DsRed标记周细胞所在位置的毛细血管直径变化（无论是体细胞还是突起，这些位置的反应没有显著差异：外部数据图5e)或者没有周细胞。存在周细胞体或突起的毛细血管静息直径（4.62±0.09μm，n=464）大于无周细胞区（3.72±0.08μm，n=168，Mann-Whitney p=2.7×10）−7)表明周细胞诱导毛细血管直径增加。周细胞部位扩张超过5%的频率更高(图3i; 芝加哥2p=7.5×10−11)，其中反应也较大（p=3.2×10−5Kolmogorov-Smirnov试验：图3j-k). 这些数据证实周细胞主动放松以产生毛细血管扩张。

缺血时周细胞收缩并死亡

周细胞对毛细血管直径的控制在病理学中也起作用吗？缺血时周细胞收缩一些视网膜毛细血管1，也许是因为周细胞[Ca2+]我当ATP耗竭抑制离子泵送时上升。大脑中动脉闭塞后皮质毛细血管也收缩14（MCAO）体内临床上，使用tPA可以在1-6小时内实现血栓闭塞动脉的再灌注24，25但是，即使动脉血流量恢复，脑血流量也会持续减少26-29这可能反映了周细胞收缩在缺血后持续时间更长14，但尚不清楚为什么收缩如此之长。我们使用碘化丙啶标记细胞死亡，检测缺血对周细胞健康的影响。

暴露于模拟缺血的大脑皮层切片的实时成像（糖酵解导致ATP合成的氧-葡萄糖剥夺，碘乙酸和抗霉素抑制氧化磷酸化）显示，在约15分钟内，周细胞附近的空间受限区域的灰质毛细血管收缩(图4a-c). 相反，未暴露于缺血的毛细血管直径在60分钟内保持稳定（减少3.2±3.0%，p=0.31，n=13，图4c). 虽然未暴露于缺血的毛细血管即使在一小时后也几乎没有周细胞死亡（通过碘化丙啶标记进行评估），但缺血导致毛细血管上的大多数周细胞在约40分钟后死亡，通常发生早期收缩的位置。我们检查的所有暴露于缺血的毛细血管都显示出一致的反应，周细胞首先收缩毛细血管，然后死亡(图4c). 周细胞在僵硬状态下死亡，在它们因能量供应丧失而收缩后，应使毛细血管床的阻力长期增加。

为了在对毛细血管直径进行实时成像时对更多的周细胞进行采样，并检查导致其死亡的机制，我们获得了暴露于模拟缺血的脑切片的共聚焦堆叠，然后对其进行固定并标记NG2和/或异凝集素B4缺血导致小脑白质中紧靠毛细血管的周细胞迅速死亡(图5a-b)和大脑皮层的灰质(图5c-d). 对于暴露于上述模拟缺血的周细胞，约90%的周细胞在一小时内死亡(图5b). 这不受阻断动作电位（TTX，1μM）的影响，但通过阻断AMPA/红藻氨酸（25μM NBQX）或NMDA受体（50μM D-AP5，50μM MK-801和100μM 7-氯氰尿酸）而减半，这意味着兴奋毒性对周细胞死亡的贡献。当单独使用氧-葡萄糖剥夺（OGD）（不含抗霉素和碘乙酸）时，为了在氧和葡萄糖恢复时生成ATP，约40%的周细胞在1小时后死亡，但OGD诱发的死亡在再灌注1小时内增加1.5倍(图5c-d). 离子型谷氨酸受体阻滞或清除外部钙2+再次显著减少了死亡人数(图5d)而阻断NO生成则具有较小的保护作用，并通过清除O降低自由基水平2.−.无显著影响(图5d，外部数据图6a). 阻断代谢型谷氨酸受体或20-HETE的产生，这可能会阻止[Ca2+]我升高或阻止线粒体钙摄取也没有影响(外部数据图6b).

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缺血周细胞死亡

一对照（白色箭头：活周细胞）或含有抗霉素和碘乙酸盐的缺血溶液（红色箭头：死周细胞）1小时后，标记NG2和碘化丙啶（PI）的大鼠小脑切片白质毛细血管。b条对照组或缺血1小时后周细胞死亡的百分比（如a）单独或动作电位阻滞（TTX，1μM）、AMPA/红藻氨酸受体（25μM NBQX）或NMDA受体（50μM D-AP5，50μM MK-801，100μM 7-氯氰尿酸）；利用Dunnett的事后检验从单因素方差分析得出p值。c（c）IB标记的大鼠新皮质层灰质毛细血管41小时对照溶液或氧+葡萄糖剥夺（OGD）后，NG2和PI。d日周细胞（如c中所示）在OGD（No-reoxy）或OGD后1小时死亡，随后是不含药物或iGluR阻滞（NBQX（25μM）、AP5（50μM）和7CK（100μM））的对照溶液（reoxy），0[Ca2+]o个，NOS阻断（100μM L-NNA）或自由基清除（150μM MnTBAP或100μM PBN，来自外部数据图5a)贯穿始终。OGD杀死周细胞（ANOVA，p=10−13)再灌注期间死亡增加（p=3.3×10−13). iGluR块或零[Ca2+]o个降低死亡率（用Dunnett的事后检验进行方差分析，p=2.7×10−4和6.0×10−7). 阻断NOS的保护作用较小（p=0.026）；ROS清除没有（p＝0.99）。电子-传真IB标记纹状体毛细血管的共焦图像4和PI（e）以及纹状体周细胞和内皮细胞死亡的百分比（f）体内MCAO治疗大鼠（90分钟，22.5小时后评估）、假手术大鼠（有或没有将灯丝插入颈内动脉（ICA））和幼稚对照动物。周细胞死亡多于内皮细胞（重复测量ANOVA，p=10−6). 对于周细胞，而非内皮细胞，受损半球的细胞死亡更大（半球的主要影响，p=0.004；半球-细胞类型的相互作用p=0.003），MCAO损伤动物的细胞死亡比未阻断ICA的幼稚或假动物的细胞死亡率更大（Tukey post-hoc测试，p=0.005和0.01）。请参见外部数据图5获取来自大脑皮层的数据。

与内皮细胞不同，紧贴毛细血管的周细胞也会死亡体内大脑中动脉闭塞（MCAO）90分钟后，再恢复22.5小时：图5e-f，外部数据图6c). 相比之下，仅闭塞颈内动脉的假手术（见方法）产生的周细胞死亡较少，而不闭塞动脉的假术（不影响血流：见方法）引起的死亡不比未经处理的幼年动物多。因此，周细胞死亡是脑血管床对缺血的快速反应，在脑切片和体内。

讨论

了解是什么引起了神经活动引起的血流增加，对于理解信息处理是如何进行的以及功能成像信号是如何生成的至关重要30大多数神经元更靠近毛细血管（海马体约8.4μm远31)而不是小动脉（距离70μm31)这表明神经元可能通过向周细胞发出信号来调节其能量供应(外部数据图1a). 我们的数据支持这一概念：神经元活动导致释放信使，激活周细胞的外向膜电流(图2)扩张小动脉前的毛细血管(图3). 毛细血管扩张意味着周细胞有一种静息状态，可能是蓝斑轴突释放去甲肾上腺素的结果，三分之二的血管周终末终止于毛细血管而非小动脉附近32.血管直径反应可以在相邻周细胞之间传播1，9但尚不清楚小动脉是从周细胞还是从到达小动脉晚于到达周细胞的血管活性信使接收到扩张信号。我们已经确定周细胞扩张的原因是EP4PgE激活受体2或相关化合物，尽管也需要NO生成来抑制血管收缩性20-HETE的合成(图1，外部数据图1b). 这些机制类似于控制小动脉扩张的机制，可能反映了谷氨酸释放激活星形胶质细胞或神经元中花生四烯酸及其衍生物的生成13。

周细胞部位毛细血管扩张的发生频率更高(图3i-k)毛细血管扩张比小动脉扩张更快体内(图3d-h)表明周细胞活跃地松弛以扩张毛细血管。我们的数据表明，毛细血管在调节脑血流量方面有两个概念上独立的作用。首先，由于更接近神经元，它们比小动脉更早检测到神经元活动，并可能将超极化血管舒张信号传回小动脉（通过周细胞或内皮细胞之间的缝隙连接）1，9第二，毛细血管扩张本身对增加血流量有显著作用。为了评估毛细血管扩张增加血流的程度，我们使用了小鼠皮层血管树上的数据33（见方法）。长时间（15s）刺激期间平均小动脉扩张5.9%(外部数据表1)，毛细血管扩张6.7%（所有毛细血管阶数的平均值，外部数据表1)忽略小静脉扩张，预测稳态血流增加19%。忽略毛细血管扩张预测流量仅增加3%。因此，据估计，毛细血管扩张产生100×（19-3）/19=84%的神经活动引起的血流稳态增加，毛细血管在穿透小动脉前扩张~1s(图3d-h). 这些结果表明，BOLD功能成像信号主要反映周细胞的毛细血管扩张。

对于缺血，我们的数据支持但修改了周细胞收缩的建议1，14这可能是导致脑血流持续减少的原因，即使在中风后动脉阻塞时也会出现这种情况26-29然而，先前设想毛细血管的收缩是由健康周细胞引起的，可以通过抑制氧化应激来逆转14我们发现，在缺血使他们收缩之后(图4)周细胞容易死亡(图5). 这种死亡部分是由谷氨酸介导的，但不能通过自由基清除而减少，这表明收缩和死亡至少在部分原因上有所不同。僵硬时周细胞死亡将导致毛细血管血流量长期减少26-29以及（pericyte-maintained）4-6)血脑屏障。这两种情况都会导致持续的神经元损伤，这突出了预防周细胞死亡作为中风后治疗策略的潜在重要性，尤其是在受影响区域的半影区。为了开发这种方法，有必要开发周细胞死亡的小分子抑制剂，在中风发生后不久，可能与组织纤溶酶原激活剂一起使用。

方法

动物

实验使用Sprague-Dawley或Wistar大鼠和NG2-DsRed C57BL/6J小鼠，无论性别。动物程序是根据1986年《英国动物（科学程序）法案》、丹麦国家道德委员会和欧洲指令2010/63/EU的指南进行的。每个实验在至少3个不同的实验日在至少3只动物的组织上进行。

脑片制备

制备切片（200-300μm厚）35在冰冷充氧（95%O）中的振动器上2/5%一氧化碳2)解决方案。这种溶液通常是人工脑脊液（aCSF），含有（mM）124 NaCl、2.5 KCl、26 NaHCO三，1氯化镁2，1 NaH2人事军官4，10葡萄糖，0.1-1抗坏血酸钠，2氯化钙2（在其中添加1个氰尿酸以阻断谷氨酸受体），切片在室温下在同一溶液中培养，直到用于实验。对于图2e-h，切片液含有（mM）93 N-甲基-D-葡聚糖氯化物、2.5 KCl、30 NaHCO三，10氯化镁2，1.2氢氧化钠2人事军官4，25葡萄糖，0.5氯化钙2将20个HEPES、5个抗坏血酸钠、3个丙酮酸钠、1个氰尿酸和切片在34°C的相同溶液中培养10分钟，然后在室温下培养，直到在与NMDG-Cl、MgCl类似的溶液中用于实验2，氯化钙2和抗坏血酸钠被（mM）92 NaCl，1 MgCl取代22氯化钙2和1钠抗坏血酸。

周细胞的免疫组织化学标记

异凝集素B4与内皮细胞分泌的基底膜中的α-D-半乳糖残基结合36，37包围周细胞。小脑片在FITC-结合的10μg/ml异凝集素B中孵育4（Sigma）在4%PFA中静置1小时，然后静置20分钟，在21°C下，在0.05%Triton X-100、10%山羊血清和磷酸盐缓冲盐水中孵育4-6小时，然后在21°C下搅拌一次抗体过夜，然后在20°C下用二次抗体孵育4~8小时。主要抗体为：豚鼠NG2（取自W.B.Stallcup，1:100）、兔NG2（Millipore AB5320，1:300）和兔PDGFRβ（Santa Cruz sc432，1:200）。次级抗体（山羊）为：抗兔（分子探针，1:200）和抗豚鼠（杰克逊实验室，1:100）。周细胞，毛细血管对数形态上有突起，或位于毛细血管交界处，标记NG2和PDGFRβ(图1). 由于血管周免疫细胞有时与周细胞混淆19，我们在5只NG2-DsRed动物的7个皮质和8个小脑切片中用Iba1抗体（兔Iba1，突触系统234003，1:500）标记前者，并发现135（皮质）和212（小脑）均未发现NG2-DsRed标记的血管周细胞与Iba1共标记（尽管Iba1标记了皮质切片中的110个细胞和小脑切片中的136个细胞，图1c)这意味着由毛细血管上的位置和NG2表达定义的周细胞与血管周围小胶质细胞/巨噬细胞不同。

脑切片中的毛细血管成像

如上所述，在31-35°C的温度下，用碳酸氢盐缓冲的aCSF对切片进行灌注，但不含氰尿酸。在使用20%氧气的实验中，灌注溶液是碳酸氢盐缓冲的aCSF，用20%氧气充气2，5%一氧化碳2和75%N2。

为了记录毛细血管直径的明亮视野，从出生后第10天（P10）-P21 Sprague-Dawley大鼠制备小脑矢状切片，或从P12大鼠制得冠状皮质切片。平均每张切片有1.3个毛细血管区域成像。毛细血管成像1使用x40水浸物镜、Coolsnap HQ2 CCD相机和ImagePro Plus或Metafluor采集软件，在小脑切片分子层或体感/运动皮层切片灰质内约30μm深处。每1-5秒采集一次图像，曝光时间为5毫秒。像素大小为160或300纳米。通过手动放置测量线（垂直于血管，图1d)使用ImagePro Analyzer、Metamorph或ImageJ软件，在图像上（在应用去甲肾上腺素时收缩的可见周细胞附近的位置），测量者不知道药物应用的时间。测量线的末端被放置在代表测量者对血管边缘下像素的强度变化率最大的最佳估计的位置，直径的估计精度为一个像素。必要时，通过手动跟踪偏移或使用Image Pro“Align Global images”宏对齐图像。焦点发生变化的实验被排除在进一步分析之外。将存在信号通路阻断剂的数据与不存在阻断剂的交错数据进行比较。

对于在分子层中刺激平行纤维的实验，使用冠状切片来保存平行纤维，并使用放置在距离成像血管约100μm处的贴片移液管电极，在50–90 V和12 Hz下施加60-100μs持续时间的刺激25秒。为了检查平行纤维是否被成功激活，使用填充有aCSF的4 MΩ贴片吸管监测分子层中的场电位。为了确保周细胞健康，我们排除了不收缩至1μM去甲肾上腺素的毛细血管。刺激引起扩张(图2e、f)除了2条毛细血管收缩外，推测是由于刺激使周细胞直接去极化，因为当TTX作用于其中一条血管时，在TTX中仍然可以看到刺激引起的收缩：这2条血管被排除在分析之外。

周细胞的斑贴灯记录

准备小脑冠状片35来自P10-P17 NG2-DsRed C57BL/6J小鼠。切片上涂有含有（mM）124 NaCl，26 NaHCO的碳酸氢盐缓冲溶液三，1 NaH2人事军官4，2.5 KCl，1 MgCl2，2.5氯化钙2，10葡萄糖，用95%O起泡2/5%一氧化碳2在21-23°C或33-36°C时，pH值为7.3（刺激诱发电流在这两种温度下没有显著差异，并合并）。周细胞被鉴定为位于毛细血管上的DsRed表达细胞（少突胶质细胞前体细胞也表达NG2-Ds红色，但这些细胞在形态上和在薄壁组织中的位置可以与周细胞区分开来）。用含有（mM）130 K-葡萄糖酸盐、4 NaCl、0.5 CaCl的溶液的移液管将周细胞夹持在−55和−75 mV之间2，10 HEPES，10 BAPTA，2 Na2ATP，2氯化镁2，0.5钠2GTP，0.05 Alexa Fluor 488，用KOH将pH设置为7.3。电极结电位得到补偿。通过染色填充，从形态学上证实斑贴细胞为周细胞。串联电阻为20-40 MΩ。17个细胞的平均静息电位为-47.6±2.1 mV，静息电位的平均输入电阻为292±27 MΩ。因此，由神经元活动诱发的30 pA外向电流（见正文）预计会使周细胞超极化约9mV。

血管成像体内

动物制剂

16只成年NG2 DsRed C57BL/6J小鼠（18-37 g，雌雄各半）通过气管插管进行机械通气实验（SAR-830；CWE，Ardmore，PA）。将导管插入左股动脉和静脉，并用生理盐水灌注。呼气末CO2（microCapstar终端CO2监视器（CWE）和血压（压力监视器BP-1；佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司）与动脉血样（pO）中的血气一起持续监测2115-130毫米汞柱；pCO公司235-40毫米汞柱；pH值7.35-7.45；ABL 700系列；Radiometer Medical，Brønshøj，丹麦），以确保动物在生理条件下饲养。在使用直肠温度计调节加热垫（TC-1000温度控制器；CWE）进行实验期间，测量温度并将其保持在37°C。手术期间，用木聚嗪（10 mg/kg i.p.）和氯胺酮（60 mg/kg i.p.）对动物进行麻醉，然后在实验期间切换到α-氯仿（50 mg/kg/h i.v.）。颅骨用氰基丙烯酸酯凝胶（乐泰粘合剂）粘在金属板上，并在实验装置中固定板。钻取一个直径约为4mm的开颅手术，中心位于大脑前角后方0.5mm，右侧3mm，位于感觉桶皮层区域。取出硬脑膜，用0.75%琼脂糖（III-A型，低EEO；西格玛-阿尔德里奇，密苏里州圣路易斯）覆盖制剂，并用人工脑脊液湿润（mM:120 NaCl，2.8 KCl，22 NaHCO三，1.45氯化钙2，1钠2高性能操作4，0.9氯化镁2和2.6葡萄糖；pH=7.4），37°C时，用95%空气/5%CO起泡2开颅手术用玻璃盖玻片盖住。实验完成后，通过静脉注射麻醉剂（戊巴比妥200 mg/ml和盐酸利多卡因20 mg/ml）对小鼠实施安乐死，然后斩首。

触须垫刺激

用一套定制的经皮双极电极刺激对侧三叉神经眶下支，激活小鼠感觉皮层。阴极位于眶下裂孔（IO），阳极插入咀嚼肌38以1.5 mA（ISO-flex；AMPI，Jerusalem）的强度进行丘脑皮层IO刺激，持续1 ms，以2秒或15秒的序列在3 Hz下进行。刺激由Spike2软件（7.02版；英国剑桥电子设计公司）中运行的定序器文件控制。

皮层反应成像

使用内在光学成像（IOS）检测每只动物对刺激的血流动力学反应，并用于识别通过触须垫刺激激活的大脑区域，以进行进一步的血管成像。然后在激活区域的中心附近进行血管的双光子成像。IOS记录在徕卡显微镜上，放大4倍，包括视野中的整个准备。光源由带绿光滤光片的LED和快速相机（QuantEM 512SC；Photometrics，Tucson）组成，在3 Hz刺激之前和15秒期间每秒采样29张图像。由于血红蛋白强烈吸收绿光，在脑血容量和流量变化期间，捕获的光强度随着总血红蛋白浓度的增加而降低39。从对照图像中减去刺激期间的图像40，可以显示在触须刺激期间血流增加的大脑区域。

双光子成像

向股静脉注射2%w/v异硫氰酸荧光素-提取物（FITC-右旋糖酐，分子量70000，50μl，Sigma-Aldrich），以标记血浆。体内血管直径和周细胞位置的成像使用商业双光子显微镜（SP5，Leica，Wetzlar，Germany）、MaiTai HP Ti:Sapphire激光器（Millennia Pro；Spectra Physics，Santa Clara，CA，平均输出功率10mW）和20×1.0 N.a.水浸物镜（Leica）进行。在900nm波长下激发组织，并过滤所发射的光以收集来自DsRed（周细胞）和FITC-葡聚糖（血管内腔）的红光和绿光。穿透性小动脉被明确识别体内有两种方法，一是通过追踪它们与周围有明显平滑肌的软脑膜小动脉的连接，二是通过观察红细胞从小动脉流入实质毛细血管的方向。对感兴趣区域拍摄Z轴叠加图像。在刺激期间，采用XY时间序列对周细胞和血管进行成像，帧大小为512×300像素（170 msec/帧；像素大小为93-201 nm，取决于使用的放大倍数，平均值为155 nm；像素驻留时间为1.1μsec）。

图像分析

红细胞（RBC）的存在导致毛细血管和小动脉（程度较小）图像上出现明显的空洞(外部数据图4a-b). 通过将显示FITC-标记血管管腔的绿色通道的总和以最大强度10帧（1.7秒）平滑图像，降低了图像噪声（参见外部数据图4a-d对于样本图像，这将对直径阶跃增加的表观时间以及中所示的膨胀产生影响图3d). 然后对该通道进行处理，以提取血管直径。以约20μm的间距（例如：。图3d). 使用ImagePro卡尺工具定位血管边缘，该工具可以找到沿直线的最大光强度梯度（其中d2强度/dx2=0). 对于上述脑切片成像，通过像素插值图像强度，原则上可以估计边缘位置的变化小于一个像素，但实际上我们测量的直径精度为一个像素。我们考虑了平滑处理是否可以人为地优先加速毛细血管的扩张。事实上，这是不可能的，因为平滑使用了所有10帧的最大强度总和：因此，通过RBC产生的黑色区域不会添加到总和图像中，并且只有在以后的帧中才能检测到直径的任何增加。因此，红细胞的通过只能延迟检测到扩张的明显时间，在红细胞运动较慢的毛细血管中，这种影响应该更大，但毛细血管在小动脉之前扩张(图3). 我们得出的结论是，平滑不能优先加速毛细管数据中的膨胀时间过程。对于图3e和g测量直径的时间进程也通过5点FFT程序进行平滑处理，该程序删除了1.16 Hz以上的频率（OriginLab软件），其效果如所示外部数据图4e反应毛细血管被定义为在超过5%的初始血管直径刺激后出现变化的毛细血管（因为4.99%是所有研究血管平均基线直径标准偏差的两倍）。如果单个血管上有多个区域响应，则取其响应时间的平均值，用于配对血管之间的比较(图3f和外部数据图5c). 使用线扫描成像技术，根据红细胞的速度评估毛细血管中的血流，红细胞在FITC-右旋糖酐标记血管内呈暗斑23在触须刺激（3Hz，15s）之前、期间和之后，沿血管轴线重复进行线性扫描（0.358 ms/行，512像素），以形成时空图像，其中移动的红细胞产生斜率等于速度倒数的条纹。使用自动图像处理算法计算斜率41所有研究毛细血管的红细胞平均基线速度为1.73±0.20 mm/sec（n=49）。

细胞死亡实验

化学性缺血

用于化学缺血实验(图4，5a-b类)，P21小脑矢状切面(图4)或P7(图5a-b)Sprague-Dawley大鼠在37°C的缺血溶液中孵育，在该溶液中用7mM蔗糖代替葡萄糖，并通过用5%CO平衡溶液来去除氧气2和95%N2此外，在缺血溶液中添加2 mM碘乙酸盐和25μM抗霉素，分别通过糖酵解和氧化磷酸化阻止ATP生成42.对照切片在脑脊液中孵育，像往常一样用5%CO充气2，95%O2向两种溶液中添加碘化丙酸（PI，37μM）以标记死细胞。在缺血溶液中孵育60分钟后，将切片固定在4%多聚甲醛中20分钟，并如上所述进行NG2免疫组化。

氧-葡萄糖剥夺

对于氧-葡萄糖剥夺实验，如图5c-d，从P21 Sprague-Dawley大鼠制备冠状前脑切片，然后在aCSF中孵育，其中用7 mM蔗糖替换葡萄糖，并用5%CO的平衡溶液去除氧气2和95%N2.对照切片在脑脊液中孵育，像往常一样用5%CO充气2，95%O260分钟后，将一些切片立即固定在4%多聚甲醛中，而将其他切片放置在对照aCSF中，再复氧60分钟。所有溶液还含有37μM PI和10μg/ml FITC-共轭异构酶B4分别标记死细胞和血管。切片在4%多聚甲醛中固定20分钟之前，在aCSF中快速清洗，在PBS中清洗3次，并在Dako硬固定介质中安装在显微镜载玻片上。然后使用蔡司LSM 700或710共焦显微镜对载玻片进行成像。PI-阳性的死亡血管和实质细胞由一名对其状况一无所知的实验者使用ImageJ软件进行计数。分析中排除了最靠近切片表面20μm的细胞，以防止切片引起的损伤。死的或活的周细胞是通过其在被隔离素B包围的血管上的“突起”形态来识别的4标签。检查周细胞是否可以通过隔离素B识别4单独标记，在平行实验中，我们标记切片中的isolectin B4和NG2：通过这种方法鉴定的周细胞中绝大多数（718个细胞中的93%）为NG2阳性。尽管缺氧或脑损伤后，一些周细胞可能会轻微离开毛细血管43，44，在本研究中，我们只计算了毛细血管旁的周细胞。

大脑中动脉闭塞

雄性Wistar大鼠（英国哈兰），体重253-312克，12小时光/暗周期饲养随意如前所述，接受短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）45简而言之，用4%的异氟醚麻醉动物，并将其维持在70%N中携带的1.5-2%异氟醚中2O和30%O2在颈部做中线切口，烧灼并切断右侧颈外动脉，暂时结扎右侧颈总动脉和颈内动脉。通过在颈外动脉残端进行小动脉切开，一根4-0尼龙丝尖端涂有硅胶（Doccol，美国）被提升至颈内动脉，在其起源处阻塞大脑中动脉。对于假动物，除了以下两种情况外，都遵循了整个过程：（i）在3分钟后拔出（假颈内动脉闭塞）前，纤维只向颈内动脉（ICA）的起始处推进，或（ii）永久性结扎颈外动脉（对脑血流量没有影响）暴露颈总动脉和颈内动脉，但不结扎，动物与假动物（未结扎ICA的假动物）保持麻醉时间相同。通过连接在加热垫上的直肠热敏电阻探针将核心温度保持在37°C。通过将激光多普勒探头（Oxford Optronicx，Oxford，UK）放置在大脑中动脉区域的变薄头骨上，持续监测脑血流，该头骨位于脑桥外侧约4mm，尾部约1.5mm。在MCAO动物中，在闭塞期间的平均值，治疗侧的脑血流在90分钟内降至基线的34.9±7.1%（n=6），而在ICA闭塞的假动物中，16分钟内显著低于基线的67.9±11.0%（n=3，t检验p=0.035）（这一较小的下降是由于ICA闭塞所致），在没有ICA闭塞的假手术动物中，血流不受影响（104.0±3.9%，基线，n=3）。MCAO 90分钟后，纤维被拉回，颈总动脉结扎被解除，以允许最大程度的再灌注。然后解除麻醉，再灌注22.5小时，通过调查肢体对称性、运动功能、活动和感觉刺激来评估神经功能缺损（修改自参考文献。46). 最高分数为15分表示严重的神经功能缺损，最低分数为0表示无神经功能缺损。MCAO动物的平均得分为7.5±1.7（n=6），显著高于ICA闭塞的假动物（0.3±0.3，n=3，p=0.027）和未闭塞的假鼠（0±0，n=3p=0.039，经多重比较校正）。然后对动物（包括另外3只幼稚对照动物）进行麻醉、斩首，并在振动仪上制备200μm前脑切片，并用PI和FITC-异构酶B标记4在脑脊液中放置60分钟，然后按照上述方法进行清洗、固定、贴装以及皮层和纹状体图像的拍摄。如上所述，在两个区域中对活的和死的周细胞进行计数，不同之处在于还对死的内皮细胞进行计数（通过其细长的细胞核进行鉴定）。图中，幼稚对照动物的脑切片中周细胞死亡更多体内一系列实验(图5f)而不是在切片中研究周细胞死亡的实验中(图5b、d); 这可能是因为，对于用于体内实验表明，与用于切片实验的年轻动物相比，杀死动物并取出其大脑所需的时间更长。假设周细胞与内皮细胞的比例为1:3，根据周细胞总数估计存在的内皮细胞总数以及死亡内皮细胞的百分比47。

统计

数据为平均值±标准偏差。P值来自ANOVA（单变量，除非另有说明）和事后Dunnett或Student t检验，Chi2测试、Kolmogorov–Smirnov测试或Mann-Whitney U测试（针对非正态分布数据）（视情况而定）。采用双尾试验。除非另有说明，文中引用的P值来自独立样本t检验。对于多次比较，使用等效于Holm-Bonferroni方法的程序对p值进行校正（对于N次比较，最显著的p值乘以N，第二大显著值乘以N-1，第三大显著值除以N-2，等等；如果校正后的p值小于0.05，则其具有显著性）。使用Kolmogorov–Smirnov检验评估数据的正态性。所有统计分析均使用IBM SPSS21或OriginLab软件进行。

毛细血管扩张对脑血流量增加的贡献

为了评估毛细血管扩张如何在稳定状态下增加血流，我们使用了最近对小鼠皮层血管树的分析数据33对于从皮质表面流出的血液（为了简单起见，我们假设血压恒定），通过穿透小动脉到达皮质的第4层，通过相互连接的毛细血管阵列，然后通过穿透小静脉返回皮质表面，这一分析33得出的结论是，该路径的小动脉、毛细血管和小静脉段的阻力（基线直径）分别为0.1、0.4（从小动脉到小静脉的路径相隔200μm，图5c和​和2克2克第页，共页。34)和0.2泊/微米三，因此毛细血管提供总阻力的57%。在长时间（15秒）刺激期间，平均神经元活动诱发小动脉扩张5.9%(表16.7%的毛细血管扩张（所有毛细血管阶数的平均值，表1)忽略小静脉扩张，则阻力与直径的四次幂成反比（泊伊叶定律），在稳定状态下，血流应增加19%。省略毛细管扩张预测流量仅增加3%，而省略小动脉扩张（使得只有毛细管扩张）预测流量增加15%。毛细血管中对泊松定律的偏离33对这些值只做一个小的修正。因此，毛细血管扩张预计会产生84%由长时间神经元活动引起的稳态血流增加。如果软脑膜小动脉扩张，这个数字会有所降低48显著增加了流量。例如，如果假设软脑膜小动脉与穿透小动脉扩张5.9%，阻力与穿透小血管相同，则毛细血管对血流增加的贡献预计为73%（然而软脑膜血管及其吻合口的直径越大）49提示它们对总阻力和血流控制的贡献将远小于穿透性小动脉）。

与早期工作的关系

先前未能观察到主动毛细血管扩张2可能反映了两个因素。首先，在该研究中2与我们的研究不同，作者无法通过触须垫刺激再现血流增加，因此使用荷包牡丹碱刺激神经元：可以想象，这会诱发癫痫样活动，可能会产生非生理性的血管收缩20-HETE释放，以及扩张信使。其次，在该研究中使用硫喷妥钠麻醉剂2可能减少了血流量的增加，因为同一组报告称，与使用α-氯醛糖（我们使用的麻醉剂）相比，密切相关的麻醉剂硫代丁巴比妥抑制神经源性血流量增加40%50此外，他们定义为毛细血管前小动脉的血管2（他们的图4h)它确实表现出活跃的扩张，表面似乎有孤立的周细胞（而不是连续的平滑肌），在我们的命名法中被称为一级毛细血管。

周细胞死亡后僵直持续时间

之所以会出现僵硬，是因为当ATP水平下降时，像周细胞这样的肌肉细胞无法从肌动蛋白上分离肌球蛋白头来放松。在整个身体层面上，死亡后的僵硬（骨骼肌僵硬死亡导致的僵硬）持续约18-36小时，具体取决于温度。因此，我们希望周细胞在僵硬状态下保持数小时（即缺血后血流量减少的时期26)除非被小胶质细胞切除。

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致谢

我们感谢贝弗利·克拉克（Beverley Clark）、阿拉斯代尔·吉布（Alasdair Gibb）、亚历克斯·古琳（Alex Gourine）、克莱尔·霍沃思（Clare Howarth）、雷诺德·朱利维特（Renaud Jolivet）、克里斯蒂安·马德里（Christian Madry）、彼得·莫布斯（Peter Mobbs。由Leducq基金会、欧洲研究委员会、惠康信托基金会、英国医学研究委员会、北欧基金会通过健康老龄化中心、伦德贝克基金会、NOVO北欧基金会和丹麦医学研究委员会提供支持。

脚注

补充信息链接到该论文的在线版本www.nature.com/nature（自然）。

重印和权限信息位于www.nature.com/reprints网站

竞争性金融利益：无

工具书类

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