Biochim生物物理学报。作者手稿；PMC 2015年5月1日提供。
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NIHMSID公司：NIHMS562612
MEKK2调节浸润性乳腺癌细胞黏附稳定性和运动性
美国伊利诺伊州梅伍德市洛约拉大学斯特里奇医学院分子药理学和治疗学系，邮编60153
地址：Bruce D.Cuevas，PhD，2160 South First Ave.，Maywood，IL，60153，ude.cmul@saveucb，电话：708-216-6408，传真：708-2016-6596 - 补充资料
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摘要
MEKK2是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，作为MAP激酶激酶（MAP3K）调节MAP激酶的激活。我们最近证明，切除侵袭性乳腺癌细胞中MEKK2的表达可显著抑制异种移植转移，但MEKK_2影响转移相关肿瘤细胞功能的机制尚不清楚。在本研究中，我们研究了MEKK2的功能，并证明沉默乳腺肿瘤细胞中的MEKK_2表达可显著提高细胞扩散面积和局部粘附稳定性，同时减少细胞迁移。我们发现，细胞与基质蛋白纤维连接蛋白或Matrigel的粘附可诱导MEKK2活化并定位于局部粘连。此外，我们发现MEKK2消融增强了病灶粘附大小和频率，从而将MEKK_2功能与病灶粘附稳定性联系起来。最后，我们发现MEKK2基因敲除抑制纤维连接蛋白诱导的ERK5信号和FAK自身磷酸化。总之，我们的结果强烈支持MEKK2作为信号调节器的作用，该信号调节器通过控制局部粘附稳定性来调节乳腺肿瘤细胞的扩散面积和迁移。
关键词：MEKK2、局部粘连、纤维连接蛋白、激酶
1.简介
乳腺癌从原发肿瘤向转移癌的进展需要肿瘤细胞能够从原发瘤块中分离出来，并通过周围的组织基质，通过循环或淋巴系统接近远处的组织[1]. 因此，肿瘤细胞迁移对转移的发生是绝对必要的，而阻断肿瘤细胞迁移的治疗干预有望抑制实体肿瘤转移。与其他粘附细胞一样，乳腺肿瘤细胞的迁移需要协同启动和释放基质的粘附[2]. 细胞对细胞外基质蛋白（如纤维连接蛋白）粘附的调节是通过与整合素受体相关的膜近端蛋白复合物实现的[三]. 整合素是具有细胞外结构域的二聚体细胞膜受体，选择性地与一系列基质蛋白配体结合以引发细胞反应[4]. 小整合素胞内结构域起着锚定多蛋白复合物形成的作用，该复合物被称为焦点粘连，包括细胞骨架蛋白肌动蛋白、塔利班和小病毒蛋白以及信号蛋白，该复合网络估计包括180多个蛋白质相互作用[5]. 局灶性黏附将信号蛋白如paxillin和局灶性粘着激酶（FAK）连接到整合素细胞质域，从而将细胞内肿瘤细胞调节信号与细胞外环境联系起来[6]. 因此，局部粘附复合物通过控制粘附来调节细胞迁移，促进或抑制局部粘附稳定性或分解的因素强烈影响细胞迁移[6]. 近年来，许多蛋白质被证明与黏附蛋白相关[6,7]，对信号网络如何协调对粘附稳定性的控制以促进细胞运动的理解是不完整的。
有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）是影响多种细胞功能的信号调节因子，包括（但不限于）细胞生存、分化、基因表达和细胞迁移。MAPK被分为四大类，包括ERK1/2、JNK、p38和ERK5，尽管已经鉴定出多种亚型，将其数量增加到至少12个成员蛋白[9]. MAPK是三激酶激活级联系统的末端激酶，在该系统中，MAPK被磷酸化，然后被MAPK激酶（MAP2K）激活，MAPK激酶本身被磷酸化并由MAPK激酶激酶（MAP3K）激活。MAP3K类MAPK调节蛋白包括20多个成员蛋白；超过MAPK或MAP2K蛋白组的总和。由于激活每个MAP3K的刺激物可以有很大差异，不同MAP3K蛋白的相对丰度代表了一种重要的调节机制，有助于MAPK激活的特异性。虽然ERK1/2、JNK和p38 MAPK都对来自几个不同MAP3K的激活信号作出反应，但ERK5的活性主要受MAP3K类中MEKK2和MEKK3成员的控制[9].
虽然序列相似（55%蛋白质序列相同）和预测的结构域相似，但基因敲除研究表明，MEKK2和MEKK3在小鼠中具有不同的功能发育作用[9]. MEKK3基因敲除与血管生成不足、心脏发育异常和随后的胚胎致死有关，而MEKK2基因敲除小鼠是可存活和可繁殖的。已证明MEKK2可磷酸化MAP2K蛋白MKK4和MKK7，进而磷酸化并激活JNK。除了JNK调节外，MEKK2还可以磷酸化并激活MAP2K蛋白MEK5，然后磷酸化并活化ERK5[9]. 除了在基因表达和细胞生存中确定的调节作用外[10,11]，JNK也与细胞迁移控制有关[12]. 而多个MAP3K蛋白可以影响JNK的激活[9]我们小组和其他研究人员发现，单个MAP3K信号传导模块对不同的环境输入作出响应，从而专门控制JNK的激活，这表明该蛋白家族中存在显著的功能冗余。例如，c-Kit在干细胞源性肥大细胞中诱导的JNK激活需要MEKK2，但不需要相关激酶MEKK1[13]，而FGF-2诱导成纤维细胞中JNK依赖性uPA的表达，该表达被MEKK1的消融阻断，但不被MEKK2阻断[14]. MEKK2如何特异性调节JNK活性以影响肿瘤细胞生物学尚未被研究，MEKK 2控制的肿瘤细胞功能也尚未确定。虽然JNK的调节和功能已被广泛研究，但目前对ERK5的理解要有限得多。敲除研究已将ERK5与血管和心脏发育联系起来[15,16]因此，对肿瘤细胞中ERK5的功能分析侧重于ERK5依赖性基因表达在肿瘤血管生成和血管生成中的重要性。有趣的是，Sawhney及其同事发现ERK5与整合素共同免疫沉淀并促进侵袭性肿瘤细胞中FAK的自身磷酸化和随后的活化[17]将ERK5与细胞粘附和迁移联系起来。然而，在这些复合物中介导ERK5活性的信号机制尚未确定。
MAPK信号控制下的一些细胞功能，包括细胞迁移，影响实体瘤的进展和转移过程。我们最近对MAP3K进行了shRNA筛选，以确定潜在的转移调节因子，我们报告称，沉默乳腺癌细胞中MEKK2的表达可以显著抑制乳腺癌异种移植引起的转移，而沉默MEKK3并不能减少转移[8]. 为了了解MEKK2在实体瘤进展中的作用，我们随后的研究重点是确定MEKK1乳腺肿瘤细胞生物学的机制。在本报告中，我们揭示了MEKK2通过控制局部黏附稳定性来调节乳腺肿瘤细胞的迁移，至少部分是这样。此外，我们证明了MEKK2被招募到局部黏附，并在粘附细胞外基质的下游激活。最后，我们检测了MEKK1表达对信号传导的影响，以提出MEKK2-依赖性肿瘤细胞迁移的机制。
2.材料和方法
2.1. 抗体和试剂
抗-MEK2、抗MEKK3和抗ERK2抗体购自Santa Cruz Biotechnology，抗病毒抗体购自Sigma。生长因子减少的Matrigel从BD Biosciences购买。磷酸化或总p38、JNK、ERK1/2、ERK5、FAK和MKK4特异性抗体购自细胞信号技术公司，抗MEKK3抗体购自上皮组学公司。蛋白质A和琼脂糖珠购自罗氏应用科学公司。Alexa Fluor®结合的卵磷脂和Alexa Fluor®偶联的二级抗体是从Invitrogen购买的。纤维结合蛋白和胶原蛋白购自Sigma。辣根过氧化物酶偶联二级驴抗兔药购自Jackson ImmunoResearch。辣根过氧化物酶偶联的次级绵羊抗小鼠抗体购自Amersham GE Health。BIX02189购自Selleck Chemicals，XMD 8-92购自TOCRIS Bioscience。
2.2. 质粒载体
先前描述了编码野生型HA标记的MEKK2和克隆到pCMV5中的激酶无活性突变体MEK02（K385M）的cDNA载体[18]. 通过PCR产生FLAG标记的MEKK2激酶结构域（氨基酸357-619）并克隆到pCDNA3中。编码非活性GST-MKK4的载体是Ajay Rana博士（芝加哥洛约拉大学）的慷慨捐赠。编码MEKK2 shRNA的慢病毒载体购自Open Biosystems（ThermoScific）
2.3. 细胞培养和转染
前面描述了稳定表达MEKK2 shRNA细胞的MDA-MB 231乳腺癌细胞[19]. 简单地说，通过用编码两个不同MEKK2 shRNA序列的慢病毒感染细胞（OpenBiosystems克隆ID TRCN0000002043和TRCN00000002045），然后用含嘌呤霉素的生长培养基（2μg/ml）进行选择，建立稳定的细胞系。HEK-293T细胞购自A.T.C.C.。所有细胞均在37°C下含10%（v/v）胎牛血清（亚特兰大生物制品公司）的DMEM（Dulbecco改良的Eagle's培养基）（Invitrogen）中培养，并保存在5%的CO中2在潮湿的空气中。按照制造商的建议，使用Lipofectamine Plus（Invitrogen）进行所有转染。
2.4. 免疫荧光
将表达空载体或MEKK2-特异性shRNA的MDA-MB 231细胞接种到基质蛋白涂层的玻璃盖玻片上，如下所示：在37°C下，在含有基质蛋白（20μg/ml纤维连接蛋白、100μg/ml Matrigel和20μg/ml胶原蛋白）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中培养无菌洗涤盖玻片1小时，然后取出并晾干。将培养细胞用无酶细胞分离缓冲液（Life technologies）分散，清洗并重新悬浮在无血清培养基中，然后接种到含有涂层盖玻片的培养皿中，并允许粘附指定时间。然后将细胞固定在PBS中的无甲醇4%（w/v）甲醛（Thermo Scientific）中15分钟。在三次PBS洗涤后，用0.1%Triton X-100在PBS中渗透细胞15分钟。洗涤后，将盖玻片在5%（v/v）山羊血清/PBS中在室温（23°C）下封闭1小时，然后用所示的抗MEKK2或抗vinculin抗体在4°C培养过夜。三次洗涤后，将盖玻片与Alexa Fluor®488缀合的抗兔、Alexa Fluor®594缀合的抗小鼠和Alexa Fluor®647缀合的鬼笔肽（Invitrogen）在封闭溶液中在4°C下孵育过夜。清洗后，将细胞安装在荧光凝胶中（电子显微镜服务）。在奥林巴斯IX81显微镜上使用60倍物镜采集图像。
2.5. 蛋白质共定位的量化
将接种在涂有Matrigel的玻璃盖玻片上的MDA-MB 231细胞固定，并与上述抗病毒素和抗MEKK2抗体孵育。在DeltaVision显微镜上以0.5μm的间隔拍摄了至少12个连续的Z轴叠加图像，并使用softWoRx软件（Applied Precision）进行解卷积。使用Imaris软件（Bitplane Inc.）对去卷积的图像进行三维渲染。然后在高维酮浓度区域周围使用维酮的恒定荧光阈值和最小体积0.4μm构建表面三使用软件的Surface Finder功能，并全局应用于所有图像。程序计算了MEKK2在规定焦点粘附表面内的总荧光强度，并以强度单位/μm报告三。使用皮尔逊相关系数检验计算统计相关性。
2.6. 焦点粘附定量
将接种在FN（20μg/ml）上并用抗小病毒抗体染色的固定MDA-MB 231细胞内检测到的局部粘连的总数和相关面积用ImageJ软件进行量化，该软件使用的程序改编自先前描述的方法[20,21]. 简单地说，包含细胞核和大部分细胞体的细胞的中心区域是手动追踪和掩盖的。分析的总细胞数为n=48个对照MDA-MB 231细胞，n=46个MEKK2敲除稳定的MDAMB 231细胞。像素强度的检测阈值最初由程序设置，以区分焦点粘连和背景荧光，然后全局应用于所有图像。然后将得到的像素转换为二值图像，并使用ImageJ中的“分析粒子”功能确定焦点粘连的数量和面积。使用GraphPad Software，Inc.（加利福尼亚州拉荷亚）的Prism 4对数据进行分析并绘制图表。使用unparied计算统计显著性吨-测试。
2.7. 附件分析
将细胞接种在FN包被的96孔板（20μg/ml）上，并在37°C下不受干扰地孵育30分钟。然后以2000转/分的转速旋转平板30秒，然后去除培养基和未附着的细胞。将附着的细胞固定在甲醇中，并使用配备相机和Micron成像软件的倒置显微镜采集图像。使用ImageJ v1.46h（NIH）统计涡流前后至少四口井的图像。使用GraphPad Software，Inc.（加利福尼亚州拉荷亚）的Prism 4对数据进行分析并绘制图表，并使用未配对吨-测试。
2.8. 扩散分析
将细胞接种在FN涂层的96-well板（20μg/ml）上，并在37°C下不受干扰地培养2小时，以便粘附和扩散。然后取出培养基，将细胞固定在甲醇中。使用配备摄像头和Micron成像软件的倒置显微镜采集图像。使用ImageJ v1.46h（NIH）追踪每个细胞的周长，以计算表面积；共享一个或多个边缘的细胞被排除在外。在至少四个孔的图像中测量了大约600个单个细胞。使用GraphPad Software，Inc.（加利福尼亚州拉荷亚）的Prism 4对数据进行分析和绘图，并使用Mann-Whitney U检验计算统计显著性。
2.9. 体外伤口愈合试验
该程序根据之前描述的程序进行了调整和修改[22]. 简单地说，将细胞接种并培养至融合。使用移液管尖端轻轻损伤细胞层，清洗并在37°C的完全培养基中孵育20小时或更短时间。使用配备摄像头和Micron成像软件的倒置显微镜采集图像，然后使用ImageJ v1.46h（NIH）进行处理，以测量细胞前沿移动的距离和伤口闭合率。细胞前沿速度(v（v）)计算为v（v）=d日/吨，其中d日是细胞前沿在时间上移动的距离吨.伤口愈合率百分比(W公司第页)计算为W公司第页= (1-(一个吨/一个0))/吨，其中一个0和一个吨是实验开始时和实验结束时的伤口面积吨分别是。使用GraphPad Software，Inc.（加利福尼亚州拉荷亚）的Prism 4对数据进行分析并绘制图表，并使用未配对吨-测试。
2.10. 免疫印迹法
蛋白质通过SDS-PAGE分离并转移到Protran硝化纤维素膜（Whatman）上。在TBST（20 mM Tris，137 mM NaCl和0.1%吐温-20，调节至pH 7.6）或5%无球蛋白BSA（Sigma）中稀释的5%（w/v）脱脂奶粉中封闭膜，并在4°C的适当抗体中培养过夜。在广泛清洗后，将膜与HRP（辣根过氧化物酶）-结合驴抗兔IgG（Jackson ImmunoResearch）或HRP-羊抗鼠IgG二级抗体（Amersham-GE Healthcare）在室温下孵育1小时。在大量洗涤后，通过ECL（增强化学发光，Thermo Scientific）检测靶向蛋白质。如有指示，用2%（w/v）SDS和100 mM 2-巯基乙醇在TBS中处理，剥离印迹，然后用所需的抗体进行再验证。
2.11. MEKK2激酶测定
将MDA-MB 231细胞分散，在无血清培养基中洗涤，然后接种在纤维连接蛋白涂层板上或在悬浮液中混合20分钟。然后在激酶裂解缓冲液（20 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM EGTA，1%Triton X-100，1 mM PMSF，1 mM钒酸钠，0.05 mM DTT和1μg/ml亮蛋白）中裂解细胞，并通过在4°C下以13000rpm离心10分钟进行清除，收集胞浆细胞裂解物。使用裂解缓冲液将500μg细胞裂解产物中的总蛋白体积增加至350μl，并在4°C下使用抗MEKK2抗体将其翻转过夜。然后将蛋白A珠（15μl填充体积）添加到裂解物中，并在4°C下再次反向旋转。混合2-4小时后，将珠子在裂解缓冲液中洗涤两次，在激酶缓冲液中清洗一次（20 mM HEPES，pH 7.5，10 mM MgCl2，5毫微米第页-硝基苯基磷酸盐）。然后在30°C的温度下，在50μl补充有1μg纯化MKK4的激酶缓冲液中培养小球20分钟。用SDS-PAGE分离混合物并转移到硝化纤维素膜上，然后用抗磷酸-MKK4抗体进行免疫印迹。
2.12. Transwell迁移分析
将MDA-MB 231细胞悬浮在无血清培养基中，该培养基含有MEK5抑制剂BIX021089（10μM）、ERK5抑制剂XMD 8–92（5μM）或DMSO。通过Transwell（Corning）分析评估趋化性，其中105让细胞通过过滤器（8μm孔）向4%的血清迁移5小时，然后用莱特染色法对迁移细胞进行染色，并按前面所述进行计数[22].
3.结果
3.1. 纤维连接蛋白粘附调节乳腺癌细胞MEKK2定位
为了确定MEKK2在乳腺肿瘤细胞中的位置，从而深入了解MEKK1促进肿瘤转移的可能机制，我们使用MEK02特异性抗体对固定的MDA-MB 231乳腺肿瘤细胞进行了免疫荧光分析。在这些实验中，我们将肿瘤细胞接种到无涂层玻璃盖玻片上，将细胞固定在甲醛中，并利用抗MEKK2抗体检测内源性MEKK_2蛋白。此外，我们还将细胞接种到涂有纤维连接蛋白的盖玻片上，以增强固定前的附着和细胞扩散。有趣的是，我们观察到，与粘附在未涂层盖玻片上的细胞中的MEKK2相比，当细胞粘附在纤维连接蛋白上时，MEKK_2的定位发生了显著变化。虽然MEKK2存在于贴附于未涂层盖玻片的细胞的细胞质中，但我们发现贴附于纤维连接蛋白的细胞会在贴附于纤维连接蛋白膜区附近的聚焦区域诱导明显的MEKK_2富集(). 由于这些MEKK2富集区中的一些类似于局灶性粘附复合物，我们将MEKK2的定位与局灶性粘附蛋白长春花蛋白的定位进行了比较(). 当纤维连接蛋白黏附细胞同时使用抗vinculin和抗MEKK2抗体处理时，我们观察到局部黏附中一些富含MEKK2-的区域与vinculin-共存(). 然后我们研究了细胞与其他基质蛋白的粘附是否同样会诱导MEKK2重新分布到局部粘附。我们发现，细胞附着在Matrigel上，而不是胶原蛋白上，也能诱导MEKK2与vinculin共存(). 这些发现强烈表明，MEKK2的再分配是通过连接一组整合素受体而诱导的。此外，由于基质主要由层粘连蛋白、IV型胶原和凝集素基质蛋白组成，而不是纤维连接蛋白，因此这些结果表明，至少两种不同的细胞外基质蛋白的结合可诱导MEKK2转定位到局部粘连。重要的是，我们在第二个乳腺癌细胞系（BT474）中检测到类似的MEKK2定位模式，表明局部粘连相关的MEK02不是细胞系特异性特征（数据未显示）。我们的结论是，MEKK2在侵袭性乳腺癌细胞中的定位与已知的调节细胞粘附和迁移的蛋白质一致，因此我们选择研究MEKK1在这些功能中的作用。
细胞粘附基质蛋白诱导MEKK2再分布。MDA-MB 231细胞接种在未涂层（第一排）或涂有胶原蛋白（第二排）、纤维连接蛋白（第三排）或Matrigel（第四排）的玻璃盖玻片上6小时，固定并用抗MEKK2（绿色）或抗vinculin（红色）抗体染色以进行免疫荧光分析。箭头表示MEKK2定位到焦点粘连的区域。比例尺代表20μm。图像是至少三个独立实验的代表。
3.2. MEKK2用于局部粘连
我们的结果表明，MEKK2被特异性募集到局灶性粘连中，以响应细胞对基质胶或纤连蛋白的附着。为了确定MEKK2定位的时间规律，我们首先确定了焦点复合体形成所需的时间，然后询问MEKK_2何时在这些复合体中共存。我们通过免疫荧光分析确定，在附着到Matrigel后的15分钟内，在固定细胞中可检测到局灶性复合物。我们开发了一种新的基于Imaris软件的方法来量化蛋白质共定位，然后利用我们的技术在一个小时的时间过程中量化MEKK2与vinculin在局灶黏附复合体中的共定位。使用维酮荧光作为常数来定义焦点粘附边界，使用Imaris程序的Surface Finder功能在维酮富集区域周围构建三维表面，显示锥形焦点复合物从细胞中心向外延伸到细胞外围(). 我们发现这些焦点复合物中的MEKK2浓度随时间增加()当进行皮尔逊相关系数测试时，与Matrigel上的潜伏期在统计学上相关(第页(3) = 0.9937,第页<0.005). 此外，在局灶性黏附复合体中的vinculin定位先于MEKK2，这表明MEKK_2定位于形成的黏附复合物，并且不需要形成局灶性粘连。总之，我们的结果强烈表明，MEKK2被征募用于建立局部粘连，以响应乳腺癌细胞对纤维连接蛋白或Matrigel的粘附，并表明连接特定的整合素受体是基质诱导的MEKK_2易位所必需的。
三维局灶性粘连中MEKK2与vinculin共定位的量化。（A） 对接种在Matrigel上的MDA-MB 231细胞在XY平面上的Z堆叠图像进行三维渲染，显示MEKK2（绿色）和vinculin（红色）（A1）的共定位，或旋转以显示焦点粘连体积（A2）。围绕高维蛋白荧光强度（A3）区域构建三维表面（灰色）。从图像中减去细胞体，并在病灶粘连的三维表面过度施加共定位荧光信号。图像代表在四个时间点拍摄的>140张图像。（B） vinculin的Bar-graph表示和MEKK2定量显示了局部黏附中MEKK_2募集与潜伏期的显著线性相关(第页(3) = 0.9937, **第页<0.005).
3.3. MEKK2调节细胞扩散面积和局部粘附稳定性，但不调节附着
细胞扩散依赖于局部粘附形成和分解的动力学，因此我们询问MEKK2是否调节局部粘附的形成和稳定性。为了确定MEKK2是否影响这些参数，我们利用之前用于阻断异种移植转移的shRNA载体稳定地敲低了MEKK_2的表达() [19]. MEKK2与另一种称为MEKK3的MAP3K具有高度的蛋白质序列相似性，因此我们通过使用来自稳定MEKK_2敲除细胞的裂解物进行抗MEKK_3免疫印迹分析，确认了MEKK2-shRNA载体的特异性。尽管MEKK3蛋白与MEKK2有55%的序列同源性，但本研究中使用的任何一种shRNA载体靶向的MEKK1序列在MEKK三中都不保守，正如预测的那样，MEKK2shRNA并不影响MEKK3shRNA的表达(). 这些结果强烈表明，我们的MEKK2 shRNA在沉默MEKK_2表达方面非常有效，并且对于只敲除MEKK-2非常特异。利用免疫荧光显微镜检测内源性维酮作为纤维连接蛋白粘附细胞的局灶性粘附标记()我们发现，MEKK2的表达强烈影响着局部粘连的发生率和大小。MEKK2击倒显著增加了这一数字()和面积()乳腺肿瘤细胞中的局灶性粘连。接下来，我们研究了MEKK2敲除对细胞表面铺展面积和附着的细胞粘附参数的影响。我们比较了MEKK2稳定敲除的细胞与对照细胞在纤维连接蛋白上的粘附和铺展。我们发现MEKK2敲除稳定的细胞中细胞扩散面积增加()通过表达shRNA-resistant MEKK2（add-back），细胞面积恢复到控制水平。相反，敲低MEKK2并没有改变细胞附着在纤连蛋白涂层板上的能力()这表明MEKK2基因敲除后细胞表面积的扩大并不是由于细胞附着增加或加速所致。此外，当我们敲低SKBR3乳腺癌细胞中MEKK2的表达时，我们观察到MEKK1敲低对细胞面积的类似影响（数据未显示），这表明MEK02敲低相关的细胞扩散不仅限于MDA-MB 231细胞，因此不是MEKK2-shRNA的细胞系特异性效应，这些结果表明，MEKK2活性可促进浸润性乳腺癌细胞的局部黏附转换。
MEKK2击倒可稳定病灶粘连。（A） MDA-MB 231裂解物的免疫印迹显示MEKK2（上面板）、MEKK3（中面板）和总ERK2的表达，作为对照细胞、用MEKK2-shRNA#1和#2处理的细胞或用稳定表达的抗shRNA-resistant MEK02（Add-back）处理的细胞的负荷对照（下面板）。（B） 用抗小病毒抗体荧光显微镜检测粘附在纤维连接蛋白上的MDA-MB231细胞的局灶性粘附。16小时贴壁后的典型图像显示，对照细胞（左上面板）或带有MEKK2 shRNA的细胞（右上面板）中存在与vinculin相关的局灶性粘连。将原始图像转换为二值图像（下面板）进行分析。（C） 定量每个细胞的局灶性粘连数量，以及（D）在MDAMB 231细胞中附着纤维连接蛋白5小时和16小时后单个局灶性粘附的平均面积。图表中的数据来自至少三个独立的实验。分析的总细胞数为n=48个对照MDA-MB 231细胞，n=46个具有稳定MEKK2敲除（D）的MDA-MB 2321细胞。图表中的数据来自至少三个独立的实验*第页<0.05, **第页<0.01, ***第页<0.001. 比例尺代表10μm。
MEKK2调节扩散细胞的表面积。（A） 将MDA-MB 231对照细胞、经MEKK2 shRNAs处理的细胞或具有稳定表达YFP-MEKK2（Add-back）的MEKK2-shRNA细胞在纤维结合蛋白涂层细胞培养板上培养2小时。（C） 30分钟后，在纤维连接蛋白附着试验中，MEKK2敲除对MDA-MB231细胞没有影响。将结果归一化为对照，并根据至少三个独立实验进行汇编***第页<0.001。
3.4。MEKK2基因敲除抑制乳腺癌细胞迁移
粘附是细胞迁移的一个不可或缺的组成部分，因此为了确定MEKK2是否影响细胞迁移，我们将稳定MEKK_2敲除的细胞迁移与对照细胞的迁移进行了比较。我们利用了在体外创伤愈合分析评估细胞迁移与细胞融合培养所需时间的关系，以通过吸管尖端“创伤”填充清除的细胞区域（创伤愈合率）。令人惊讶的是，我们观察到，虽然稳定转染空载体（对照）的细胞几乎填满了伤口20小时，但稳定表达两种不同MEKK2 shRNAs中任一种的细胞显示伤口愈合率显著降低(). 我们发现，与对照细胞相比，MEKK2敲除稳定的细胞持续显示出更长的创伤愈合时间，这表明MEKK2-缺陷细胞的定向细胞迁移明显减少(). 由于细胞表面积可以独立于迁移率影响划痕分析结果，我们通过量化细胞沿伤口边缘（细胞前沿）的移动速度来证实我们的发现，并发现沉默MEKK2表达与细胞前沿速度降低有关(). 此外，MEKK2在具有稳定敲除功能的细胞中的再表达（add-back细胞）将细胞迁移挽救到与对照组相似的水平，从而证实迁移减少是由于特定的MEKK_2敲除功能，而不是靶外shRNA效应(). 与这些发现一致，当MEKK2表达恢复时，细胞前沿速度也得到部分缓解(). 总之，这些数据有力地表明MEKK2调节MDA-MB 231细胞中的细胞迁移。
沉默MEKK2表达抑制肿瘤细胞迁移。（A）体外伤口愈合试验显示对稳定MEKK2表达下调的迁移参数的影响。蓝线表示分析开始时的细胞前沿（0小时），红线表示分析结束时的细胞前端（20小时）。ImageJ用于在无涂层细胞培养塑料板上测量伤口愈合率（B）和细胞向伤口迁移的细胞前沿速度（C）。结果被归一化为对照，并由至少三个独立实验汇编而成*第页<0.05, ***第页<0.001。
3.5. 纤维连接蛋白附着激活MEKK2
我们的数据强烈表明，MEKK2活性受纤维连接蛋白的时空调控。我们通过使用从接种在纤维连接蛋白上的细胞中纯化的MEKK2进行半定量激酶分析，询问粘附在纤维连蛋白上是否足以激活MEKK2。我们使用重组非活性MKK4作为底物，通过免疫沉淀的MEKK2和磷特异性MKK四抗体（磷酸化MKK4S257/T261）检测MKK4-激活环残基的磷酸化。我们发现内源性MEKK2通过细胞粘附纤维连接蛋白而被激活，而不是从悬浮细胞中纯化的MEKK1(). 这一结果表明，与纤维连接蛋白的结合及其受体的激活足以激活MEKK2。
粘附纤维连接蛋白激活MDA-MB 231细胞中的MEKK2。（A）体外使用抗磷酸化-MKK4（S257/T261）免疫印迹进行激酶分析，以揭示MDA-MB 231细胞内源性MEKK2免疫沉淀对重组MKK4的磷酸化作用（上图）。在裂解之前，将细胞粘附到纤连蛋白包被的塑料细胞培养板（FN）上20分钟或在悬浮液（Susp）中保持20分钟。仅包括不含免疫沉淀MEKK2（续）的底物进行比较。免疫印迹显示MEKK2被免疫沉淀（中间面板），考马斯染色检测重组MKK4底物负载（底部面板）。（B） Bar-graph显示相对MEKK2激酶活性，通过免疫印迹密度法测定MEKK4从纤维连接蛋白附着细胞或悬浮细胞中诱导的pMKK4。结果代表至少三个独立实验，通过配对T检验分析对这些实验的密度测定进行比较，得出p<0.05。
3.7. MEKK2调节纤维连接蛋白诱导的ERK5和FAK磷酸化
接下来，我们使用磷酸特异性MAPK抗体作为MAPK激活的替代指标，通过免疫印迹分析，研究了纤维连接蛋白附着对MEKK2下游信号蛋白的功能影响。整合素连接清楚地激活导致MEKK2依赖性ERK5磷酸化的信号，但令人惊讶的是，我们没有检测到纤维连接蛋白诱导的JNK活性相关磷酸化(). 同样，我们没有检测到p38磷酸化对纤维连接蛋白附着的反应。活性相关的ERK1/2磷酸化始终可检测到，尽管可变，整合素结合细胞的pERK1/2通常与对照组相似。这种持续的高pERK1/2背景水平可能是由于MDA-MB 231细胞表达突变的活性KRAS。无论如何，未经处理或纤维连接蛋白结合的细胞中的pERK1/1水平与MEKK2表达无关。总的来说，这些数据表明纤维连接蛋白的附着诱导了导致MEKK2和ERK5激活的信号传导，而不是JNK。
MEKK2调节FN诱导的信号传导。（A和B）MDA-MB 231对照细胞和具有稳定MEKK2敲除的细胞接种在无涂层培养板（未处理）或涂有纤维连接蛋白的培养板上。将JNK、ERK5、p38或ERK1/2活化阳性对照细胞暴露于0.2M山梨醇中15分钟。（B） 免疫印迹显示MDA-MB 231对照细胞和MEKK2稳定敲除细胞中纤维连接蛋白诱导的FAK Y397磷酸化水平（上面板）。总FAK免疫印迹（中间图）显示测试泳道的蛋白质含量相等，MEKK2免疫印迹（底部图）证实MEKK2敲低。（C和D）用载体（DMSO）、BIX02189 MEK5抑制剂（10μM）或ERK5抑制剂XMD 8–92（5μM）处理的MDA-MB 231细胞在5小时迁移期内跨孔迁移分析的图示。（D） 将稳定表达活化MEKK2（357–619）的MDA-MB 231细胞与表达内源性MEK02（对照）或表达MEKK_2（357-619）但在抑制剂存在下迁移的MDA-MB231细胞的血清诱导趋化性进行比较。结果由三个独立的实验汇编而成。
为了进一步了解MEKK2表达影响细胞迁移的机制，我们检测了MEKK_2敲低对纤维连接蛋白诱导的FAK自动磷酸化的影响。FAK自身磷酸化酪氨酸残基397（Y397），导致与多种蛋白质结合，可用作FAK活化的替代检测。正如预期的那样，我们的免疫印迹分析显示，与悬浮细胞中的FAK相比，FAK对纤维连接蛋白的自身磷酸化反应。然而，我们观察到，在MEKK2稳定敲除的细胞中，纤维连接蛋白诱导的Y397磷酸化减少，这表明FAK自身磷酸化部分依赖于MEKK2-(). 为了验证这个假设，我们检测了ERK5活性是否是MDA-MB231细胞迁移所必需的。使用改良的Boyden小室试验，我们测试了ERK5抑制对由特定ERK5抑制剂XMD 8-92（x）血清诱导的趋化性的影响。我们观察到，使用XMD 8-92或MEK5抑制剂BIX02189抑制ERK5显著降低细胞迁移能力(,补充图1)，在类似于MEKK2敲除的程度上抑制趋化性(). 由于MEKK2磷酸化并激活MEK5，而MEK5反过来磷酸化并活化ERK5，这些数据表明MEK5调节乳腺癌细胞的趋化性，并表明MEK02至少部分通过控制ERK5活性来调节MDA-MB 231细胞的迁移。为了解决这种可能性，我们表达了组成活性的MEKK2（MEKK2kinase结构域，氨基酸357-619）[26]在MEKK2敲除的细胞中，在抑制剂存在的情况下重复趋化性分析。我们发现，MEKK2激酶结构域的稳定表达与血清诱导的趋化性增加有关，并且用ERK5抑制剂（XMD 8-92）或MEK5抑制剂（BIX02189）治疗可部分阻断这种增加。这些数据表明，MEKK2活性通过部分依赖ERK5活性的机制促进MDA-MB 231细胞的趋化性。综上所述，这些结果表明MEKK2和ERK5活性都是细胞迁移的重要调节器，并表明MEK02信号传导有助于FAK磷酸化的调节。
4.讨论
正常细胞和癌细胞的迁移都需要及时启动和释放粘附。在我们之前的工作中，我们证明了shRNA-介导的侵袭性乳腺癌细胞中MEKK2表达的沉默导致异种移植转移的显著减少。这种转移抑制是MEKK2基因敲除所特有的，因为阻断其他六种MAP3K并没有显示出类似的转移发生率降低[19]. 显然，MEKK2在调节发生转移所需的一个或多个肿瘤细胞功能中起着关键作用，但在该研究中，我们没有定义MEKK1在乳腺癌细胞中的功能作用。事实上，在该报告之前，文献中很少有证据表明MEKK2与转移有关。与其他与癌症相关的MAP3K蛋白不同，如c-RAF和BRAF[9]，MEKK2还没有被广泛研究，MEKK1激活的机制基本未知。因此，我们本研究的目标是确定MEKK2依赖的肿瘤细胞功能，从而深入了解MEKK1消融有效阻断异种移植转移的机制。我们发现，MEKK2表达下调与定向细胞迁移的显著减少有关，而MEKK2-缺陷细胞显示出可见的局部粘连数量和大小增加，细胞扩散显著增强，这与细胞前沿速度和迁移呈负相关(补充图2). 肿瘤细胞迁移对于远处转移的形成是绝对必要的，我们的数据强烈表明，观察到的转移抑制至少部分是由于MEKK2表达沉默的细胞中肿瘤细胞迁移减少。值得注意的是，虽然受调控的细胞扩散是细胞迁移的重要组成部分，但观察到与细胞粘附增强相关的失调、过度的细胞扩散可抑制细胞迁移[23].
通过我们的调查，我们发现了对MEKK2信号调节的新见解。例如，我们发现，主要是细胞质的MEKK2在细胞附着于纤连蛋白或基质胶时，会转移到粘着复合物附近的膜近端区域，这一观察结果强烈表明，整合素连接启动了募集MEKK2的信号复合物的形成。此外，在这些研究过程中，我们开发了一种新的技术，使用从固定细胞捕获的荧光图像来量化两种蛋白质的共同定位。利用Imaris软件包的Surface Builder功能分析免疫荧光图像的Z堆栈集，我们能够准确量化细胞内三维空间中MEKK2和vinculin两种蛋白质的共定位。因此，我们首次进一步报道，MEKK2被征募到局灶性黏附复合体中，与纤维连接蛋白的黏附诱导MEKK_2活化。据我们所知，本报告首次将MEKK2活化与特定基质蛋白联系起来。因此，我们的研究为未来的研究提供了基础，在此期间，我们将确定MEKK2募集和激活所需的膜近端信号复合物的组成。
我们观察到纤维连接蛋白诱导MEKK2活化，这一点从全细胞裂解物分析中可以检测到，这是一个有些令人惊讶的结果，因为只有一部分MEKK 2易位到膜-局灶黏附复合体，而一些MEKK 2仍局限于细胞质。我们假设膜相关的MEKK2是活性的，因此定位于局灶性粘连的MEKK 2可能与细胞质MEKK 2中的调节不同。其他激酶，包括已知的MEKK2调节器Src[8]MEKK2定位于局部粘附，因此当其被招募到局部粘附蛋白复合体时，可能会被Src和其他激酶激活。MEKK2内潜在调节性磷酸化位点的位置在很大程度上仍不明确，除了MEKK2-羧基末端激酶结构域和氨基末端PB1结构域外，其余大多数MEKK_2序列的功能仍不清楚。Matitau及其同事最近的一份报告显示，丝氨酸磷酸化促进MEKK2和14-3-3之间的相互作用，从而负调控MEKK1活性[25]，我们对MEKK2肽序列的分析揭示了额外的潜在磷酸化位点，以及可能作为SH3-结合脯氨酸丰富基序的脯氨酸丰富序列。因此，MEKK2的大部分法规和功能仍有待确定。事实上，由于PB1域是其他PB1域蛋白质的对接端口[18]，MEKK2可能执行脚手架功能[24]在焦点粘附蛋白复合物内。由于MEKK2与MEK5的相互作用是由其各自的PB1结构域介导的，因此MEKK2中既是ERK5信号的激活剂，又是ERK5激活复合物的支架。根据我们的结果，我们假设这种支架功能将促进FAK和其他ERK5底物的ERK5依赖性磷酸化。我们未来的工作将研究MEKK2和焦黏附蛋白之间的相互作用，它们在焦黏附复合物中介导MEKK_2定位、激活和功能。
根据我们的结果，我们得出结论，整合素受体与纤维连接蛋白的连接启动了导致MEKK2活化和募集到局部粘连的信号传导。与这些结论一致，我们报道MEKK2敲除与局部粘附稳定和抑制细胞迁移相关。然而，MEKK2被募集到局灶性粘连中的机制在该项目中尚未探索，目前尚不清楚。我们未来的研究将研究MEKK2相关蛋白复合体在局部黏附处的性质，这是了解MEK02如何整合到局部复合体中以及这些成分中是否有任何成分是MEK02活性的靶点的一个重要步骤体内由于目前还没有特定的MEKK2抑制剂，对这些功能性MEKK 2相互作用进行表征可能会揭示潜在的治疗靶点，用于治疗与不适当细胞迁移相关的疾病，包括但不限于乳腺癌转移。
总之，我们的研究结果表明，细胞对细胞外蛋白的粘附调节MEKK2的活性和分布，并将MEKK_2与控制乳腺癌细胞迁移联系起来。我们的研究首次证明MEKK2调节乳腺癌细胞黏附复合体的稳定性和迁移，并控制纤维连接蛋白诱导的FAK和ERK5活化。
致谢
基金这项工作得到了美国国立卫生研究院【授予CA120881（至不列颠哥伦比亚省）】和美国癌症学会伊利诺伊分会【授予160485（至不列颠哥伦比亚州）】的支持。
脚注
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
作者贡献艾哈迈德·米尔扎（Ahmed Mirza）、迈克尔·卡勒（Michael Kahle）和玛格达琳·阿梅卡（Magdalene Ameka）开发了实验程序，并设计和执行了实验，产生了手稿中描述的结果。Bruce Cuevas和Edward Campbell提供了执行实验程序所需的技术专业知识。Ahmed Mirza、Michael Kahle、Magdalene Ameka和Bruce Cuevas构思并开发了该研究。艾哈迈德·米尔扎和布鲁斯·奎瓦斯编辑并撰写了这份手稿。
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