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生物化学杂志。2013年9月27日;288(39): 28293–28302.
2013年8月20日在线发布。 数字对象标识:10.1074/jbc。M113.511352型
预防性维修识别码:项目经理3784737
PMID:23963453

MEKK2激酶与14-3-3蛋白的结合调节c-Jun N末端激酶的激活*

背景:MEKK2是一种重要的激酶,参与MAPK通路的激活。

结果:MEKK2以磷酸化依赖的方式与14-3-3结合。这减少了它在激活位点的磷酸化。

结论:MEKK2在Thr-283处脱磷之前保持无活性,Thr-283释放14-3-3并允许JNK的自磷酸化和活化。

意义:14-3-3与MEKK2的结合提供了降低活性和指示信号特异性的机制。

关键词:细胞增殖、基因表达、Jun N末端激酶(JNK)、MAP激酶(MAPKs)、信号转导、MEKK2

摘要

MEKK2(MAP/ERK激酶激酶-2)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,属于MAP激酶激酶(MAP(3)Ks)的MEKK/STE11家族。MEKK2将应激和有丝分裂信号整合到NF-κB、JNK1/2、p38和ERK5通路的激活中。我们发现,MEKK2通过与14-3-3(一组调节蛋白质二聚化和关联的适配器)的磷酸化依赖性关联进行调节。我们发现MEKK2在Thr-283被磷酸化,这导致Ser-519的活化环磷酸化降低,从而降低活性。从机械角度来看,我们发现在缺乏14-3-3结合的情况下,MEKK2与非活性MEKK1相关,这导致反式-Ser-519的自动磷酸化。使用14-3-3减少的Ser-519进行强制绑定反式-自动磷酸化。T283A MEKK2在MEKK2中的表达−/−背景增强了应激激活的c-Jun N末端激酶活性,同时提高了IL-6的表达,但也降低了ERK激活,相应的增殖率降低。这些结果表明,Thr-283磷酸化是MEKK2活化的重要调控机制。

关键词:细胞增殖、基因表达、Jun N末端激酶(JNK)、MAP激酶(MAPKs)、信号转导、MEKK2

介绍

在酵母中,压力和营养信号通过Ste11蛋白激酶家族传递,以激活转录。在哺乳动物中,存在利用Ste11-like MAP(3)Ks的类似途径2MEKK2和MEKK3感知生长因子、压力和促炎信号(18). 例如,MEKK3通过NF-κB轴发出信号,从而促进巨噬细胞中NFκB的激活(912). 此外,MEKK2和MEKK3还激活了许多MAPKK,包括MKK6和MKK7,这反过来又激活了MAPK成员,如p38和JNK(2,6,10,1315). 因此,通过MEKK2、MEKK3和其他MAP(3)Ks利用信号的刺激物是多种多样的,其激活的确切机制仍然难以完全理解。

MEKK2和MEKK3与其他受体-最大信号蛋白组装在预激活复合物中,并利用保守的蛋白质相互作用域,包括PB1域(11,1622). 激活信号后,MEKK2/3在激活环Ser-519/Ser-526内发生磷酸化(23),这对激酶活性至关重要。MEKK2/3的二元化是必要的(24,25)表明Ser-519/Ser-526经历了反式-自动磷酸化。此外,MEKK3在促进与14-3-3蛋白结合的位点被磷酸化(9). 这种相互作用似乎可以调节激活,因为突变导致MEKK3通路的结构性激活,导致NF-κB激活增强(9).

在当前的研究中,我们研究了应激和有丝分裂原刺激后MEKK2 14-3-3调节的机制以及MEKK2-介导的c-Jun N末端激酶(JNK)的激活。我们表明,MEKK2的Thr-283磷酸化对14-3-3结合是必要的,破坏这种相互作用会导致JNK的活化增加,c-Jun磷酸化增加,转录活性升高。从机制上讲,14-3-3相互作用通过限制MEKK2二聚化和Ser-519磷酸化来改变MEKK2的活性,从而导致失活。在缺乏MEKK2的小鼠胚胎成纤维细胞中,补充T283A MEKK_2导致生长速度减慢,ERK磷酸化/活化降低,但显示TNF-α诱导的IL-6表达增加。因此,Thr-283的磷酸化和14-3-3的结合似乎允许控制MEKK2对几个MAPK通路的输入。

实验程序

质粒与突变

pCMV5-HA-MEKK2购自Addgene(马萨诸塞州波士顿;质粒12182)。为了产生FLAG-WT MEKK2,设计了引物,通过PCR在HA-MEK2的5′端引入NotI限制位点,在3′端引入NheI位点。将PCR产生的片段克隆到pCMV10-3×FLAG载体中,在N端引入3×FLAG表位标签。使用QuikChange®诱变试剂盒(Stratagene)对pCMV5-HA-MEKK2和pCMV10-3×FLAG-MEKK2进行定点诱变,并对突变进行序列验证。

为了生成R18 DE/KK MEKK2,我们从WT和激酶编码的K385M MEK02中删除了MEK02的Thr-283周围的氨基酸序列。为了切除这些区域,在5′端引入BstBI,通过定点突变在MEKK2的3′端引入ApaI。代表R18 DE肽(PHCVPRDLSWLDLEANMCLP)和KK肽(PH-CVPRDLSWLDENAMCLP)的寡核苷酸,以及合成并退火至ApaI和BstBI消化的WT和激酶头MEKK2的相关悬链。

MEKK2逆转录病毒感染−/−MEF细胞

MEKK2公司−/−MEF细胞是Bing Su博士(耶鲁大学)的一份礼物。将各种形式的MEKK2克隆到病毒表达质粒pQCXIP中,并转染到Ecopack2-293包装细胞系中。24小时后采集上清液,根据制造商的协议,使用Clontech公司的Retro-X浓缩器浓缩病毒。MEKK2公司−/−将MEF细胞在4μg/ml Polybrene中以60%的汇合度电镀4 h,此时将50μl等分病毒直接添加到细胞中,并在37°C下培养24 h。然后在2μg/ml嘌呤霉素中选择细胞5天。

磷抗体的生产

生成的肽与围绕MEKK3的Ser-519和MEKK2的Thr-283的氨基酸相对应。合成了CMSGTGIRpSVTGTPY和CMSGTGIR SVTGTPy(其中pS表示磷酸丝氨酸),以对应于MEKK2的511-524氨基酸。合成YNDGRKpTFPRARR和YNDGRKPRARR(其中pT表示磷酸苏氨酸),以对应MEKK2的277–289氨基酸。抗体的产生是通过开放生物系统进行的。

细胞裂解、免疫沉淀和免疫印迹

细胞在50 m内裂解Tris-HCl,pH 7.4,1%Triton X-100,25 m氟化钠,25米β-甘油磷酸,5 mEDTA,0.05%十二烷基硫酸钠,100 n冈田酸和蛋白酶抑制剂。将与琼脂糖珠(Sigma)结合的抗-FLAG M2抗体或与琼脂酶珠结合的抗-HA抗体(Roche Applied Science)添加到裂解液中,并在4°C下培养过夜。用裂解缓冲液洗涤珠子三次,用200μl 1×十二烷基硫酸锂样品缓冲液洗脱蛋白质,并加热至70°C 10分钟。免疫沉淀前的部分裂解产物也用含有十二烷基硫酸锂盐的样品缓冲液煮沸。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对裂解液和免疫沉淀进行分离。将蛋白质转移到低荧光聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore Immobilon-FL PVDF膜)中,在5%脱脂牛奶中封闭30分钟,并在4°C下用适当的抗体隔夜探测。在室温下用IRDye-680和IRDye-800进行二次修饰1h。使用Odyssey红外激光扫描仪通过直接荧光显示蛋白质,并使用ImageJ软件量化荧光强度。

MEKK2体外激酶检测

用WT、T284A或K385M MEKK2转染HEK293细胞。细胞在含有20 m的溶解缓冲液中溶解Tris(pH 7.6),0.5%Nonide P-40,0.25氯化钠,1米PMSF,2米VO(旁白)4,1μg/ml抑肽酶,250米β-甘油磷酸,250 m氟化钠,100 n冈田酸。用琼脂糖结合的FLAG M2单克隆抗体(Sigma-Aldrich)免疫沉淀MEKK2 3 h。免疫沉淀粒化,在裂解缓冲液中洗涤三次,在含有25 m的激酶缓冲液中清洗两次Tris(7.4),25米氯化镁2,1米EGTA,25米β-甘油磷酸,2 m二硫苏糖醇和1μg/ml微囊藻毒素-LR。将小球重新悬浮在30μl激酶缓冲液中,通过添加10μ冷/未标记ATP和1μCi的[γ-32P] ATP。样品在30°C下培养20分钟,通过添加等体积的2×十二烷基硫酸锂样品缓冲液并在70°C下煮沸10分钟来终止反应。蛋白质通过SDS-PAGE溶解,转移到聚偏二氟乙烯,并用抗FLAG M2抗体(Sigma)进行免疫印迹。γ-32使用个人分子成像仪(Bio-Rad实验室)通过放射自显影术观察P-放射性标记的MEKK2。在一些反应中,添加了与MKK6靶位点相对应的肽(50 n),并注册成立32用液体闪烁计数法测定P。

体外JNK分析

将500 ng HA标记的WT、T283A、K385M MEKK2或空载体与500 ng FLAG-JNK1a共同转染小鼠胚胎成纤维细胞,转染方案如下所述。细胞在含有20mL的增溶缓冲液中裂解Tris(pH 7.6),0.5%Nonide P-40,0.25氯化钠,1米PMSF,2米VO(旁白)4,1μg/ml抑肽酶,250米β-甘油磷酸,250 m氟化钠,100 n冈田酸。分别用25μl HA结合琼脂糖珠(抗HA亲和矩阵,罗氏应用科学公司)或25μl与琼脂糖结合的FLAG M2单克隆抗体(Sigma-Aldrich)从细胞裂解液中免疫沉淀HA标记的MEKK2结构体或FLAG标记的JNK结构体。免疫沉淀物在裂解缓冲液中洗涤三次,在含有25m的激酶缓冲液中清洗两次Tris(7.4),25米氯化镁2,1米EGTA,25米β-甘油磷酸,2 m二硫苏糖醇和1μg/ml微囊藻毒素-LR,最后将珠重悬于30μl含有10μATP和[γ]的1μCi-32P] ATP。GST-c-Jun(0.5μg)用作底物。样品在30°C下培养15分钟,通过添加2×十二烷基硫酸锂样品缓冲液终止反应,并通过SDS-PAGE进行解析。通过放射自显影术观察MEKK2自身磷酸化[32P] c-Jun使用个人分子成像仪(Bio-Read实验室)进行可视化。

荧光素酶报告分析

如图所示,用500ng的WT-MEKK2、T283A MEKK2或空载体与400ng的Gal4-Jun、50ng的Gal4萤光素酶和200ng的pCMV-β-半乳糖苷酶瞬时共转染HELA细胞。24小时后,用50 ng茴香霉素刺激细胞4小时。使用裂解缓冲液(Promega)制备细胞提取物,并在12000×在10分钟内,用5μg蛋白质测量发光,并将所有值归一化为β-半乳糖苷酶活性。

IL-6的定量

MEKK2的稳定耐嘌呤霉素池−/−在24孔培养皿中以30000个细胞/孔的速度将表达各种形式MEKK2的MEF细胞一式三份培养。添加TNF-α(1 ng/ml)18 h。采集上清液,并使用Quantikine免疫分析试剂盒(R&D Systems)定量IL-6。

XTT分析

MEKK2公司−/−在96周的培养皿中,以4000个细胞/孔的速度将表达各种形式MEKK2的MEF池培养三次。在试验的每一天,用PBS清洗微孔两次,并在100μl XTT溶液中培养(1 mg/ml XTT含有0.03 mg/ml PMS(N个-在PBS)中放置2 h,然后在490nm处测量吸光度。

结果

Thr-283是MEKK2磷酸化和14-3-3结合的位点

在MAP(3)Ks家族中,MEKK2与MEKK3同源性最高,在C末端激酶结构域中氨基酸同源性为91%,在N末端调节结构域中为61%。我们之前报道过,磷酸结合蛋白14-3-3在RRT序列中与位于Thr-294的MEKK3相关294FPRI公司(9). 该位点的磷酸化可能通过自磷酸化发生,因为激酶头突变体的Thr-294磷酸化被取消。此外,通过在该位点引入丙氨酸而破坏14-3-3结合,增加了NF-κB的激活,这表明14-3-3通过一种尚不清楚的机制抑制MEKK3-NFκB通路的信号传导。

我们检查了MEKK2,发现激酶的相应区域包含一个高度相似的位点:RKT283FPRA。这种相似性促使我们考虑MEKK2的Thr-283可能被磷酸化,并可能与14-3-3结合以改变MEKK_2的活性。当在细胞中表达时,我们发现MEKK2和MEKK3结合到类似数量的14-3-3(图1A类). MEKK2还捕获了体外表达的14-3-3ϵ(图1A类),这与方格是一致的等。(26)他检测到与MAP3K蛋白的相互作用。

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MEKK2与Thr-283的14-3-3相关联。 A类、FLAG标记的MEKK3、MEKK2或MEKK2+HA-14-3-3ϵ在293细胞中共表达24小时(IP(IP))与琼脂糖偶联的抗FLAG,并通过SDS-PAGE进行分离。通过抗FLAG和泛-14-3-3免疫印迹检测MEKK2或MEKK3以及内源性共免疫沉淀的14-3-3和HA-14-3-3õ。B类、FLAG标记的MEKK2或各种突变体在HEK293细胞中表达,并用抗FLAG偶联琼脂糖进行免疫沉淀。MEKK2和共免疫沉淀内源性14-3-3被检测为A类用奥德赛红外成像仪检测荧光二级抗体;使用ImageJ软件确定每个波段的密度数字在下面下部面板表示14-3-3信号与FLAG-MEKK2信号的比率。T283A型,被丙氨酸取代的苏氨酸283;K282R公路,赖氨酸282被精氨酸取代;3.85亿肯尼亚先令,激酶死亡,赖氨酸385被蛋氨酸取代;P(P),磷酸化。C类在HEK293细胞中表达HA-MEK2、T283A MEK02、K385M MEKK2或空载体24小时。用抗-HA结合琼脂糖免疫沉淀蛋白质,用SDS-PAGE分离蛋白质,并用抗磷酸-Thr-283、抗磷酸-Ser-519、抗-HA和抗14-3-3免疫印迹。奥德赛红外扫描仪的成像过程如下所示B、D类使用单克隆抗MEKK2抗体(BD Biosciences)从RAW264细胞或小鼠胚胎成纤维细胞产生的裂解物中免疫沉淀MEKK_2,经SDS-PAGE分离,并用抗MEK02、抗磷酸-Thr-283或抗14-3-3进行免疫印迹。结果代表了三组独立的实验。

为了测试是否与Thr-283结合,我们用我们为MEKK3产生的磷酸特异性抗体探测MEKK2。该抗体与MEKK2反应很弱;然而,当Thr-283突变为丙氨酸时,微弱信号被消除(图1B类). MEKK2与MEKK3的Lys-282不同,后者是MEKK三(RK(K)TFPRI公司R(右)R(右)TFPRI),因此我们将MEKK2 Lys-282残基突变为精氨酸,并用抗Thr-294抗体再次进行免疫印迹。K282R与抗磷酸-Thr-294呈强免疫反应。此外,激酶结构域Lys-385向甲硫氨酸的复合突变使激酶失去活性,导致抗Thr-294免疫反应性大幅降低(图1B类).

这些结果促使我们产生一种针对MEKK2的Thr-283的磷酸特异性抗体。该试剂表明,野生型MEKK2(而非T283A MEK02)与抗Thr-283抗体反应,这同样依赖于激酶活性(图1C类). 此外,我们注意到,在野生型MEKK2中,MEKK2的激活环在Ser-519处被磷酸化,而不像之前报道的那样在K385M MEKK2中被磷酸化(27). 有趣的是,T283A MEKK2中的Ser-519磷酸化水平较高(图1C类),表明Thr-283磷酸化和14-3-3结合可能在限制Ser-519磷酸化中发挥作用,我们将在下文中进行进一步研究。在所有我们量化免疫印迹信号的情况下,我们使用直接免疫荧光并将磷酸化信号报告为总蛋白的比率。

为了测试内源性MEKK2是否与内源性14-3-3结合,我们从RAW264细胞和小鼠胚胎成纤维细胞中免疫沉淀MEK02(图1D类). 在这两种细胞类型中,MEKK2在Thr-283处被磷酸化,与14-3-3有相应关联。对照抗体未沉淀Thr-283信号或14-3-3,针对MEKK2的第二抗体产生相同的结果(未显示)。

14-3-3与Thr-283的结合限制二聚体的形成和Ser-519反式自动磷酸化

为了了解Thr-283磷酸化如何影响MEKK2功能,我们测量了MEKK1的活性体外细胞表达和免疫沉淀后。MEKK2 Thr-283突变为丙氨酸增加了自身磷酸化(图2A类)及其对肽底物的活性(图2B类). 这表明Thr-283磷酸化可能限制MEKK2的激活,这与我们之前对MEKK3的观察一致(9). 因此,我们开始了解这种活动调节的机制。

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Thr-283降低MEKK2活性体外. A类在HEK293细胞中表达WT MEKK2、T283A MEKK1或K385M MEK2 24 h,并使用抗HA-糖进行免疫沉淀。免疫沉淀物受到体外激酶反应,如“实验程序”中所述32通过个人分子成像仪(Bio-Rad Laboratories)观察P-incorated MEKK2,通过抗HA免疫印迹观察总蛋白。误差条表示三次测量的S.D。B类,类似于A类除MKK6肽用作底物并通过液体闪烁计数进行测量外。结果是来自三个独立实验的重复样本的平均值。误差条表示三次测量的S.D。

首先,图1C类表明含有T283A突变的MEKK2中Ser-519的磷酸化和活性较高,表明反式-14-3-3可以调节Ser-519的自身磷酸化。Cheng的作品等。(24,25)表明MEKK2的激酶结构域在失活时二聚体化,因此我们假设在14-3-3结合后二聚体形成和随后的自磷酸化可能发生改变。我们开始通过进行一系列实验来验证这一假设,在这些实验中,我们共同表达了含有各种突变的FLAG和HA标记的MEKK2蛋白,并监测二聚体化、Thr-283磷酸化和Ser-519磷酸化。首先,我们将激酶头FLAG-K385M MEKK2与HA-MEK2、HA-MEKK2 T283A和HA-MEK K2 K385M共表达,用抗HA抗体免疫沉淀,并探索FLAG-K38 5M MEK K2的共免疫沉淀,该共免疫沉淀用奥德赛红外扫描仪荧光检测定量(图3A类). 与野生型HA-MEKK2相比,FLAG-K385M MEK02与HA-T283A MEKK2共同免疫沉淀的程度更大(几乎为3倍;图3A类). 此外,这种相互作用似乎比激酶形式之间的共同免疫沉淀作用更强(HA-K385M MEKK2沉淀FLAG-K385M MEK2),略大于野生型HA-MEK2。这些结果表明,最佳二聚体形成介于活性但非Thr-283磷酸化的MEKK2和激酶非活性形式之间。

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二聚体增多和反式-MEKK2在Thr-283的自磷酸化。 A类,HA表位标记的MEKK2蛋白在HEK293细胞中单独或与FLAG-K385M-MEK2一起表达。24小时后,HA-MEKK2被免疫沉淀(IP(IP))用免疫印迹法测定共沉淀FLAG-MEKK2。B类野生型HA-MEK2或HA-MEKK2与FLAG-T283A-MEKK2或FLAG-K385M-MEK2共表达。免疫沉淀HA-标记蛋白,并通过免疫印迹和Odyssey红外扫描仪检测测定Thr-283磷酸化和结合14-3-3的程度。结果代表了三个独立的实验。P(P),磷酸化。

我们参加了图1Thr-283磷酸化依赖于激酶活性,这表明存在自磷酸化机制。因此,我们合理地认为,如果MEKK2二聚体处于非活性状态,这可能会导致反式-Thr-283的自磷酸化和14-3-3结合增加。为了验证这一点,我们与HA-MEK2、HA-T283A MEKK2或HA-K385M MEK02共同表达了FLAG-T283A MEK02或激酶头FLAG-K385M-MEK02,并免疫沉淀了HA标记蛋白,以评估其在Thr-283的磷酸化以及与14-3-3的关联(图3B类). FLAG-T283A MEKK2的共表达导致HA-MEKK2较高的Thr-283磷酸化。更重要的是,当与FLAG-T283A MEKK2共同表达时,HA-K385M MEK02表现出可检测到的Thr-283磷酸化和14-3-3结合,而与FLAG-K385M-MEKK2.共同表达时则没有。该结果表明,HA-K385M MEKK2反式-T283A MEKK2的自动磷酸化,然后与14-3-3结合。

这让我们询问Thr-283磷酸化和14-3-3结合如何影响Ser-519磷酸化。对于这些实验,我们使用激酶死亡的MEKK2作为底物,通过Thr-283完整或不完整的活性MEKK2在细胞中磷酸化。此外,我们设计了MEKK2,使其独立于Thr-283与14-3-3结合。为此,我们用R18肽取代了Thr-283周围的18个氨基酸(28). 该肽是从噬菌体显示屏上分离出来的,筛选出的肽具有较强的14-3-3相互作用(28). 相互作用模式取决于肽内的两个酸性残基(DE),因此与磷酸化无关。还使用了一种控制肽,该控制肽在酸残基(称为KK)处具有赖氨酸取代,并且不与14-3-3结合。正如预期的那样,HA-DE-MEK2比野生型HA-MEK2沉淀更多14-3-3,而HA-KK-MEK2不与14-3-3结合(图4A类). 重要的是,激酶头HA-DE-K385M MEKK2与14-3-3以及活性HA-DE-MEK2的结合程度相同,表明14-3-3与该蛋白的结合现在是独立于活性的。

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14-3-3结合降低Ser-519磷酸化。 A类HA-MEKK2在Thr-283(DE-MEK2)或阴性对照R18肽(KK-MEK2)的位置包含14-3-3结合R18肽,无论是在活性背景还是在激酶背景中。蛋白质被免疫沉淀(IP(IP))通过免疫印迹法检测内源性14-3-3,并使用Odyssey红外扫描仪进行定量,面板下方显示14-3-3与总MEKK2的比率。B类带有各种突变的HA-MEKK2或MEKK2,包括DE和KK R18肽插入物,与激酶头FLAG-K385M-MEK2共同表达。24小时后,用抗FLAG-琼脂糖免疫沉淀FLAG-K385M-MEKK2,并用奥德赛红外扫描仪免疫印迹抗Ser-519抗体。这个数字面板下方表示磷酸化-Ser-519与总HA-MEKK2的比率。P(P),磷酸化。

然后,我们使用FLAG-K385M MEKK2作为各种HA-MEKK2形式细胞的底物,并探索Ser-519磷酸化。HA-T283A MEKK2为Ser-519磷酸化提供了最强的输入,与最高水平的二聚化相关(图4B类). 相反,HA-DE MEKK2与14-3-3结合得很好,为Ser-519提供了最弱的输入。另一方面,HA-KK-MEK2确实导致了Ser-519磷酸化,以及HA-T283A MEKK2。这些结果共同提供了Thr-283磷酸化和14-3-3结合影响二聚体和Ser-519的证据反式-自动磷酸化。与DE和KK突变相反,Thr-283转化为单一天冬氨酸或谷氨酸残基并没有促进与14-3-3的结合,因此,这些轻微改变的蛋白质不能用于表征MEKK2的功能。这与我们对MEKK3的观察结果类似(9). 此外,尽管R18 DE和KK取代似乎允许MEKK2自动磷酸化,但下游底物磷酸化受到这些修饰的损害。因此,DE和KK MEKK2在探测MEKK1通路激活方面的效用有限。

14-3-3协会控制JNK的MEKK2激活

据报道,在各种细胞模型中,MEKK2对于JNK的激活是必要的,以应对某些激动剂。我们询问Thr-283磷酸化和与14-3-3的结合是否可以控制MEKK2向JNK的信号传导。为了测试这一点,我们与WT或T283A MEKK2共同表达了JNK1,并测量了JNK1的活性体外(图5). 在缺乏血清的细胞中,与WT MEKK2相比,T283A MEKK2-表达细胞中JNK活性的基础水平更高(图5A类). 用FGF2刺激后,JNK1活性增加到类似水平(图5B类). 当细胞在10%血清中生长时,茴香霉素在表达异位WT MEKK2的细胞中激活JNK1的水平不高于基础水平(图5C类). 然而,在茴香霉素治疗后,T283A MEKK2的共同表达导致JNK1强烈激活,30分钟后恢复到基础水平(图5C类). WT MEKK2和T283A MEK02的表达也导致定位于细胞核的内源性磷酸化c-Jun增加(图5D类). 这些结果表明,茴香霉素可以利用T283A MEKK2激活JNK1,但不能激活WT MEKK2。最后,我们测量了GAL4-Jun融合蛋白在女孩-荧光素酶报告子。WT MEKK2和T283A MEK02均能使c-Jun活性高于GAL4-c-Jun的单独表达;然而,与WT-MEKK2相比,T283A MEKK2导致基础和茴香霉素刺激的转录反应均显著增加(图5E类).

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JNK的MEKK2激活。 A类,FLAG-JNK1α在HEK293细胞中与空载体、野生型MEKK2或T283A-MEK02共表达24小时体外以GST-c-Jun(1-186)为底物进行激酶分析。通过个人分子成像仪(Bio-Rad)检测标记蛋白。用抗MEKK2免疫印迹法检测裂解产物中MEKK_2的总表达。这个数字图像下方表示与单独矢量相比-倍增加。B类将FLAG-JNK1α与空载体或野生型MEKK2或T283A MEK02转染小鼠胚胎成纤维细胞。24小时后,细胞被血清饥饿4小时,然后用FGF2刺激指定时间。免疫沉淀JNK,测定其活性体外使用GST-c-Jun(1–186)作为底物。这个误差线表示三次测量的S.D.,并代表两次实验。星号表明第页< 0.05.C类,类似于B类,除了在含血清培养基(无饥饿期)中培养的MEFs用樟柳霉素处理指定的时间。这个误差线表示三次测量的S.D.,并代表两次实验。数字标志表明第页< 0.05.D类用玻璃盖玻片上的WT MEKK2或T283A MEK02转染HEK293细胞。24h后,用3%多聚甲醛固定细胞,用0.25%Triton X-100溶解膜,用小鼠抗FLAG、兔抗磷酸化c-Jun和DAPI染色细胞。荧光图像在奥林巴斯倒置显微镜上以40倍放大率可视化,并使用Q-Capture软件捕获。E类,HELA细胞转染加仑4-Luc记者和Gal4-c-Jun或Gal4-c-Jun+WT MEKK2或T283A MEKK2。24小时后,用茴香霉素处理细胞4小时,测定荧光素酶活性,以控制aβ-半乳糖苷酶活性。误差条表示三次测量的S.D。

Thr-283磷酸化对IL-6表达的调节

我们通过WT MEKK2和T283A MEK02探索JNK激活和c-Jun磷酸化的结果表明,表达这些形式的细胞中下游信号事件可能发生改变。为了验证这一点,我们建立了稳定的MEKK2逆转录病毒诱导池−/−表达WT或T283A MEKK2的MEFs,并测量IL-6对TNFα的反应。小鼠IL-6启动子包含顺式-调控诱导表达和组成表达的调控位点,包括cAMP反应元件结合蛋白(CREB)、NF-κB、C/EBP-1和AP1。与WT MEKK2相比,在TNFα刺激下,T283A MEKK2中的IL-6表达显著增强,尽管表达水平相似(图6).

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MEKK2对IL-6表达的调节。 A类,MEKK2−/−用含有空载体FLAG-WT MEKK2或FLAG-T283A MEKK2cDNA的逆转录病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞。在嘌呤霉素中选择5天后,分离耐药池并进行免疫印迹以检测MEKK2的表达。B类,MEKK2的稳定耐嘌呤霉素池−/−在24孔培养皿中以30000个细胞/孔的速度将表达各种形式MEKK2的MEF一式三份电镀,然后用TNFα(1 ng/ml)处理18 h。采集上清液,并使用Quantikine免疫分析试剂盒(R&D Systems)定量IL-6。误差条代表S.D。

T283A MEKK2减少了扩散

我们还测量了表达WT、T283A或激酶头K385M MEKK2的MEKK_2敲除MEFs的增殖率。在低血清条件下,仅载体和表达K385M MEKK2的MEFs表现出最高增殖,而WT MEK02增殖较慢,T283A MEKK2MEFs增殖最慢(图7A类). 添加2%的血清可提高表达WT MEKK2的MEF的反应,但不提高表达T283A MEK02的MEFs的反应(图7B类).

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MEKK2表达调节ERK磷酸化和增殖。 A类,MEKK2的稳定耐嘌呤霉素池−/−表达空载体或各种形式MEKK2的MEF在含有0.5%血清的培养基中以4000个细胞/孔的速度在96周的培养皿中培养三次。在试验的每一天,用PBS清洗微孔两次,并在100μl XTT溶液中培养2 h,然后测量450 nm处的吸光度。外径,光密度。B类,类似于A类除血清浓度提高到2%外。C类,MEKK2的稳定耐嘌呤霉素池−/−表达空载体或WT和T283A MEKK2的MEF被血清饥饿4小时,然后用FGF2刺激指定时间。激活环部位内的ERK磷酸化用磷酸特异性抗体进行免疫印迹(细胞信号技术)。D类在含有10%血清的培养基中分离出表达空载体、激酶死亡、WT和T283A MEKK2的MEF,并对ERK磷酸化进行免疫印迹。总磷-ERK的比率(pERK公司)使用奥德赛红外扫描仪通过直接荧光测定总ERK。

为了了解这种影响,我们监测了生长因子饥饿或FGF2刺激后这些细胞内ERK的激活状态。与表达载体alone的MEF相比,表达MEKK2的MEF在其激活位点的血清饥饿ERK磷酸化水平较低(图7C类). FGF2刺激导致ERK强烈激活,表明ERK的基础状态受MEKK2存在的影响,但不受FGF2激活的急性刺激的影响(图7C类). 分析血清中持续生长的细胞;与表达T283A MEKK2的MEF相比,WT、激酶缺失和空载体表达的MEF的ERK磷酸化水平高出约3倍(图7D类). 这些结果共同表明,T283A激活MEKK2导致ERK磷酸化降低,同时增殖率降低。

讨论

我们在这里表明,MEKK2通过自身磷酸化在Thr-283被磷酸化,这导致与14-3-3蛋白的结合。这一观察结果与我们之前的发现类似,与MAP(3)K,MEKK3密切相关,在同源位点Thr-294磷酸化(9). 对于MEKK3,Thr-294的磷酸化降低了NF-κB的激活,NF-κ子B是MEKK3TLR4受体下游信号传导的主要靶点。因此,我们考虑了MEKK2是否会出现类似的负调控模式。

Thr-283突变导致活性水平升高体外细胞中JNK和c-Jun转录活性的激活更强。我们通过解释Thr-283磷酸化依赖性14-3-3调节的机制来扩展这些观察结果。与野生型MEKK2相比,非磷酸化的T283A MEKK2能够与无活性的MEKK2进行更大程度的二聚。它还能够刺激激酶底物的较高水平的Ser-519磷酸化。此外,通过替换Thr-283位点上的R18肽来强制结合14-3-3导致减少反式-Ser-519磷酸化,这种作用可以通过将R18肽中的两个关键14-3-3结合残基替换为赖氨酸来逆转。由此产生的KK-MEK2能够在519号血清中磷酸化激酶头MEKK2,比DE-MEK2好几倍。在每一个实验中,我们都使用了一种模型,在该模型中,一种活性形式的MEKK2磷酸化了细胞中的激酶底物MEKK2。每种激酶都有不同的表位标记,可以从另一种中提纯。这避免了顺式-自磷酸化;我们通常发现,活性MEKK2在细胞中的Thr-283和Ser-519处都高度磷酸化。K385M MEKK2不是,只是在活性MEKK_2的共同表达后才经历磷酸化。

这些结果指出了一种机制,即MEKK2在非活性状态下二聚并进行Thr-283自动磷酸化,从而促进与14-3-3的结合。去磷酸化Thr-283的输入导致Ser-519的自磷酸化增加和活性升高。我们的假设得到了先前研究结果的支持,即非活性MEKK2二聚体(24)并且在激活MEKK2通路的激动剂刺激后,Ser-519磷酸化增加(27). 14-3-3可以在这方面发挥一些潜在作用;它可以将MEKK2维持在限制Ser-519自身磷酸化的状态,也可以促进与Ser-519特异性磷酸酶的相互作用。它也可能限制MEKK2进入膜近端信号激活复合物。

如果Thr-283磷酸化是MEKK2失活的机制,那么磷酸酶的去磷酸化可能是一种相互作用的机制,可以特异性激活MEKK2。候选基因可能是Shen鉴定的JNK刺激性磷酸酶(JSP)-1等。(29)报告JSP-1的表达激活了JNK通路。

Thr-283磷酸化缺失对MEKK2下游的通路有显著影响。我们发现,在表达T283A MEKK2的细胞中,JNK的激活更高,通过血清饥饿或用翻译抑制剂茴香霉素处理可以进一步放大。此外,TNFα靶基因IL-6在T283A MEKK2表达细胞中的表达显著升高。最后,我们发现在血清浓度降低的情况下,表达T283A MEKK2的细胞的增殖率降低。尽管活化的MEKK2如何影响细胞周期进展尚不明确,但这些结果支持先前的生化和遗传学研究,表明JNK通路的慢性激活导致ERK失活(3032)可能通过JNK依赖的双特异性磷酸酶表达(31). 这促使我们探索表达T283A MEKK2的MEF中ERK磷酸化水平;仅在载体WT或激酶编码MEKK2的背景下,激活位点ERK的磷酸化没有显著变化,而T283A导致磷酸化ERK信号减少70%。

我们对MEKK2的观察结果与MEKK3的观察结果非常相似(9). 对于MEKK3,我们还注意到短暂的Thr-294磷酸化(Thr-283的类似位点)以及与14-3-3的关联,这减少了TNFα和LPS刺激后NF-κB的MEKK3-依赖性激活。鉴于MEKK2和MEKK3在其激酶结构域内和14-3-3结合周围区域具有显著的同源性,我们得出结论,14-3-3是两种激酶的常见调节剂,可能起到将特定信号协调到适当的亚细胞靶标的作用。

致谢

我们感谢迈克尔·德马尔科的技术援助。我们还感谢Bing Su博士(耶鲁大学)对MEKK2的厚礼−/−MEF公司。

*这项工作得到了加拿大卫生研究所(CIHR)(给M.P.S.)的运营拨款的支持。

2使用的缩写如下:

地图(3)K
MAP激酶激酶
MEF公司
小鼠胚胎成纤维细胞
XTT公司
3′-1-(苯基氨基羰基)-3,4-四氮唑双(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠。

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会