识别我-苯丙氨酸结合位点增强钙敏感受体对钙的协同反应^*

[Ca的测量²⁺]_我WT或突变CaSRs转染或不转染单个细胞的反应我-苯丙氨酸

细胞内游离钙的测定²⁺按照黄的描述进行评估等。(30). 简言之，将野生型CaSR或其突变体瞬时转染到盖玻片上生长的HEK293细胞中，并培养48小时。随后使用4μ米2 ml生理盐水缓冲液（10 m）中的Fura-2 AM米HEPES，140米米氯化钠，5米米KCl，1.0米米氯化镁₂，1米米氯化钙₂pH值为7.4）。盖玻片安装在徕卡DM6000荧光显微镜台上的浴室中，细胞在无钙生理盐水缓冲液中培养5分钟。然后用340或380纳米的光交替照射细胞，实时记录510nm发射波长的荧光，作为细胞外钙的浓度²⁺在有无5m的情况下逐步增加米 我-苯丙氨酸。两种波长激发产生的发射荧光强度之比被用作[Ca变化的替代物²⁺]_我并进一步绘制和分析了[Ca的函数²⁺]_o个所有实验均在室温下进行。每次测量均记录30–60个单细胞的信号。振荡被定义为[Ca的三个连续波动²⁺]_我在初始峰值之后。

[Ca的测量²⁺]_我荧光法测定细胞群

[加利福尼亚州]²⁺]_我如黄所述，测量野生型CaSR及其突变体的反应等。(25). 简单地说，CaSR转染的HEK293细胞生长在13.5×20-mm的盖玻片上。细胞达到90%汇合后，用4μ米20 m内的Fura-2 AM米HEPES，含125m米氯化钠，5米米KCl，1.25米米氯化钙₂，1米米氯化镁₂，1米米不₂PO4、1%葡萄糖和1%BSA（pH 7.4）在37°C下保持1小时，然后用20 m洗涤一次米HEPES（pH 7.4），含125 m米氯化钠，5米米氯化钾，0.5米米氯化钙₂，0.5米米氯化镁₂1%葡萄糖和1%BSA（浴缓冲液）。将装有转染Fura-2负载的HEK293细胞的盖玻片对角放置在含有浴缓冲液的3-ml石英试管中。在[Ca逐步增加的过程中，测量了510nm处的荧光光谱²⁺]_o个在340或380 nm处交替激发。当在340或380 nm激发时，510 nm处发射光的强度比用于监测[Ca的变化²⁺]_我.欧盟委员会₅₀使用以下希尔方程拟合希尔常数，

式中ΔS公司是方程式中的总信号变化，[M]是自由配体浓度。

使用琥珀色进行MD模拟和相关分析

MD模拟为理解生物分子的结构、动力学和功能提供了一种补充活细胞实验的方法。所有模拟的初始坐标都是根据mGluR1的2.20Å分辨率x射线晶体结构用蛋白质数据库代码建模的1周(31). AMBER 10系列程序(32)用于在显式TIP3P水模型中进行所有模拟(33)使用改良版的全原子康奈尔等。(34)肽ω键的力场和二面体参数的再优化(35). 在平衡期间使用NOE约束进行初始2-ns模拟，以重新定向Ca中的侧链残基²⁺-结合位点，但在实际模拟过程中没有使用约束。共对载脂蛋白和配体形式进行了三次MD模拟，每次50 ns。在模拟过程中，使用0.002 ps的积分时间步长来求解牛顿运动方程。用粒子网格Ewald方法计算了长程静电相互作用(36)非键相互作用的截止值为9.0Å。使用SHAKE算法抑制所有涉及氢原子的键(37). 模拟是在300 K的温度和1 bar的压力下进行的。使用朗之万恒温器以1.0 ps的碰撞频率调节温度⁻¹。轨迹每500步保存一次（1ps）。使用Amber 10中的ptraj模块分析轨迹。

加速分子动力学模拟

使用可旋转加速分子动力学（RaMD）方法在游离CaSR ECD上进行加速MD(38)在AMBER的pmemd模块中实现了可旋转扭转。升压能量，E类在平均二面体能量中加入2000kcal/mol，并使用200kcal/mol的调谐参数α。如前所述，双增压还用于加速扩散和溶剂动力学(39). 模拟条件与上述常规MD模拟相似。使用AMBER中的ptraj模块对轨迹进行主成分分析。使用Interactive Essential Dynamics插件可以可视化最慢模式的特征向量方向(40).

苯丙氨酸、天冬氨酸和谷胱甘肽的对接研究

使用系综对接方法和Autodock vina计算配体的结合能(28). 如上所述，使用分子动力学模拟生成CaSR构象的集合。使用Autodock ADT程序将Gasteiger电荷分配给配体和CaSR。使用以下参数，配体在对接到CaSR的每个构象时是灵活的：网格间距为1.0Å；每个维度的盒子大小为25 \8491»，盒子的中心被选为CaSR活性位点的中心，有足够大的空间来采样盒子内所有可能的配体构象。保存的最大绑定模式数设置为10。使用了结合能最低的构象，并假定其为最佳粘合剂。根据CaSR构象系综中每个配体与每个构象的最低结合能计算每个配体的结合能分布。

主成分分析

使用AMBER 10的ptraj模块，主成分分析（PCA）(41,42)对距离CaSR ECD位点1 5Å的所有残基原子进行了测定。的协方差矩阵x个,年、和z（z）从无配体CaSR ECD的组合轨迹的每个快照中获得的所有原子的坐标，Ca²⁺-加载的表单，只加载了我-Phe和加载了Ca的窗体²⁺和我-计算Phe。将协方差矩阵进一步对角化，以产生正交特征向量及其相应的特征值，并根据其相应的方差进行排序。前三个特征向量是造成大部分原子涨落的主要成分，用于将构象空间投影到它们上面，即。，沿二维。

Ca之间的功能性正同向性协同作用²⁺-绑定站点

鉴于CaSR对配体的亲和力较低，尤其是对Ca²⁺(例如，米米 K（K）_d日)，以及纯化CaSR的困难，我们监测了[Ca²⁺]_我通过使用试管数量分析和监测[Ca²⁺]_我使用单细胞成像确定CaSR功能协同性的振荡。转染WT-CaSR的HEK293细胞对[Ca呈S型浓度反应曲线²⁺]_o个-诱发[Ca²⁺]_我在[Ca逐步增加期间的响应（通过在340或380 nm激发时510 nm处荧光比率的变化进行监测）²⁺]_o个希尔系数为3.0±0.1，EC₅₀2.9±0.2米米.这一结果表明，在五个预测的Ca中，存在较强的正同向协同性²⁺-CaSR的结合位点(图3). 使用[Ca评估激动剂的敏感性²⁺]_o个细胞开始显示[Ca²⁺]_我[Ca各自水平的振荡和振荡频率²⁺]_o个超过50%的细胞开始振荡。

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图3。

细胞内钙²⁺CaSR突变体对不同Ca的反应²⁺-[Ca增加模拟后的结合位点²⁺]_o个. 一，[Ca的频率分布²⁺]_我分别转染WT、E297I或D215I的HEK293细胞的振荡起点。[加利福尼亚州]²⁺]_o个在单个细胞开始振荡时被记录下来。对大约30-60个细胞进行分析，并进一步绘制条形图。b条、WT和Ca的群体分析²⁺-结合位点相关突变。转染CaSR或其突变体的HEK293细胞负载Fura-2 AM²⁺如前所述，通过在510nm处监测发射，在340nm或380nm处交替激发来评估水平(30). [加利福尼亚州]²⁺]_我在逐步增加[Ca的过程中，用荧光法监测转染细胞的变化²⁺]_o个.[加利福尼亚州]²⁺]_我不同[Ca时的响应²⁺]_o个绘制并使用希尔方程进行进一步拟合。

为了寻找观察到的功能正性同向性协同作用的关键决定因素，将突变引入到各种预测的钙²⁺-通过定点突变法确定CaSR的结合位点。突变受体显示钙受损²⁺单细胞研究和更高EC中振荡模式改变的传感能力₅₀在人群研究中与WT CaSR的比较值(表2和​和3三和图3和​和4）。4). 在我们之前的研究中也报道了此类人群研究(25,26). 使用抗CaSR抗体的Western印迹和免疫荧光染色的结果表明WT CaSR及其变体在细胞表面上的表达基本相等(图5). 如所示图3一，[Ca水平²⁺]_o个需要在预测Ca下启动突变E297I的振荡²⁺-结合位点1或位点2的D215I从3.0±0.1 m显著增加米至17.0±0.4和13.9±0.2米米分别（n>30，第页< 0.05). 与这些结果很好地相关，这两个突变体对[Ca²⁺]_o个在EC增加的人群分析中₅₀值(表3). Hill系数表3和图3b条表明各种钙之间的协同作用²⁺-结合位点分别突变而受损。引人注目的是，钙的去除²⁺-结合配体残基，如E297I和Y218Q在1号位点，通过[Ca转化了WT-CaSR功能激活的单一过程²⁺]_o个双相功能过程，表明潜在的合作约束机制已被严重干扰(图3b条和​和66d日).

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图4。

钙结合位点突变体对指示的[Ca增量的个体细胞反应²⁺]_o个在场或不在场我-菲。 一，单个细胞的典型细胞内钙反应。在钙结合位点3、4或5发生突变的表达CaSR的Fura-2负载HEK293细胞被制备用于单细胞实验。每次实验有或没有5m米 我-Phe开始于相同的非含钙林格缓冲液中，随后[Ca逐步增加²⁺]_o个如上所示，使用灌注系统直到[Ca²⁺]_我到达高原（高达30米米[加利福尼亚州²⁺]_o个). 每个突变体至少分析30个细胞。b条，[Ca的频率分布²⁺]_o个CaSR转染的单个HEK293细胞开始振荡。细胞数百分比定义为在给定[Ca时开始振荡的细胞数²⁺]_o个/显示振荡模式的总细胞数×100。空酒吧，如果没有我-苯丙氨酸；黑色条，存在5 m米 我-苯丙氨酸。c如前所述，研究了单个电池的振荡频率的频率分布。对于没有我-Phe，在[Ca水平下记录每分钟峰数²⁺]_o个大多数细胞（>50%）开始振荡；用于5.0 m的实验米 我-Phe，在相同的[Ca下分析频率²⁺]_o个在没有我-苯丙氨酸。具体来说，E224I的频率是在4 m米[加利福尼亚州²⁺]_o个; E353I在5.0 m处进行分析米[加利福尼亚州²⁺]_o个; D398A/E399I在10.0 m处进行了研究米[加利福尼亚州²⁺]_o个.空酒吧，如果没有我-苯丙氨酸；黑色条，存在5 m米 我-苯丙氨酸。

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图5。

WT-CaSR及其突变体在HEK293细胞中的表达。 一，瞬时转染HEK293细胞中CaSR及其突变体的蛋白质印迹分析。将40μg细胞裂解液中的总蛋白进行8.5%的SDS-PAGE。三个特征带显示在上部面板，包括顶部频带代表二聚体受体中间频带显示成熟的糖基化CaSR单体（150 kDa），并且最低频带表示未成熟糖基化CaSR单体（130 kDa）。b条，量化HEK293细胞中WT-CaSR及其突变体的表达。所有的谱带，包括指示二聚体受体的谱带、成熟糖基化单体和显示未成熟CaSR单体的谱带都被考虑在内。使用内部对照GAPDH标准化CaSR表达，并将突变体进一步标准化为WT-CaSR表达。cHEK293细胞表面表达WT-CaSR及其突变体的免疫荧光分析。用抗CaSR单克隆抗体ADD进行免疫染色(70)，并用Alexa Fluor 488-共轭山羊抗鼠二级抗体进行检测。红色细胞核碘化丙啶染色；绿色、CaSR。WT-CaSR及其变异体在细胞表面的等效表达表明²⁺WT和突变受体之间的传感能力是由于细胞表面受体的功能受到干扰，而不是，例如，阻碍了受体蛋白向细胞表面的运输。

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图6。

突变受体的功能研究我-HEK293细胞中的Phe-binding位点。 一，单个电池的代表性振荡模式。每次实验有或没有5m米 我-Phe始于Ca²⁺-释放振铃缓冲区，然后逐步增加[Ca²⁺]_o个直到[Ca²⁺]_我到达高原（高达30米米[加利福尼亚州²⁺]_o个).b条，[Ca的模式²⁺]_我分析每个细胞（至少30个细胞）的反应²⁺]_o个记录单个细胞开始振荡的时间，并绘制条形图。c研究了单个细胞的振荡模式频率。对于没有我-Phe，在[Ca水平下记录每分钟峰数²⁺]_o个大多数细胞（>50%）开始振荡，尽管在5m的实验中米 我-Phe，在相同的[Ca水平下分析频率²⁺]_o个正如在没有我-苯丙氨酸。d日，[Ca的群体测定²⁺]_我HEK293细胞在[Ca逐步增加过程中使用Fura-2 AM瞬时过度表达WT-CaSR或CaSR突变体L51A或Y218Q的反应²⁺]_o个0.5至30米米在用340或380nm激发时在510nm发射的光的强度的比率被归一化为其最大响应。[加利福尼亚州]²⁺]_o个使用Hill方程拟合浓度响应曲线。

被识别者贡献的功能性正异性合作我-Phe-binding站点

图6一显示了5米的效果米 我-[Ca上的Phe²⁺]_我不同水平[Ca的反应²⁺]_o个瞬时转染WT-CaSR或其变体的HEK293细胞中我-Phe-sensing站点。我-Phe降低了[Ca的阈值²⁺]_o个-WT-CaSR中的诱发振荡从3.0±0.1到2.0±0.2 m米，减少了1.5倍(图6一和表2). 同时，我-Phe还将振荡频率从1.5±0.1增加到2.2±0.2峰值/min（n>30，第页<0.05）米[加利福尼亚州²⁺]_o个在单细胞分析中(图6c和表2). 与此同时，我-Phe可促进WT-CaSR对[Ca的反应，从而产生受体的功能性正异性协同作用²⁺]_o个通过显著降低EC₅₀从2.9±0.2到1.9±0.2米米(n个= 3,第页<0.05），并将细胞群分析中的Hill系数从3.0增加到4.0(图6d日和表3).

然后我们进行了详细的分析，以了解残基在模型中的作用我-功能性正异性协同作用中的对映结合位点我-苯丙氨酸(图6和表4). 12个残留物中的5个位于模型的5Å内我-对映结合位点受损我-Phe-sensing能力。突变体L51A和S170T表现出受损我-起始点无任何变化时的Phe传感能力(图6b条)以及恒定振荡频率（~1.7和1.4峰值/min）我-苯丙氨酸(图6c)而它们保持相对不变的钙感应功能。与单细胞分析结果一致，细胞群研究显示EC₅₀无论有无L51A、S170T和Y218Q的值保持不变我-苯丙氨酸(图6d日)（影响我-关于S170T的Phe之前已由Zhang报道等。(51)在细胞群分析中）。增加5米米 我-Phe降低[Ca²⁺]_o个需要在转染S272A或T145A突变的细胞中启动振荡，但未能在2.5 m处增加振荡频率米[加利福尼亚州²⁺]_o个（大多数细胞开始振荡的水平），也没有降低EC₅₀(表4和图7). 提尔²¹⁸预计参与两者的结合我-其装订袋中的Phe和Ca²⁺在站点1中。事实上，突变Y218Q通过转化对[Ca的单一协同反应，在很大程度上破坏了功能性正同向协同性²⁺]_o个将WT-CaSR转化为细胞群分析中的双相过程。Y218Q对[Ca的敏感性也较低²⁺]_o个，因为[Ca²⁺]_我振荡直到[Ca²⁺]_o个增加到10米以上米反映了其在Ca中的作用²⁺-结合位点。但值得注意的是，增加了5 m米 我-Phe未能恢复该突变体的钙敏感性，表现为振荡模式不变。在20 m处观察到约1.5峰值/min的振荡频率米[加利福尼亚州²⁺]_o个有和无我-Phe代表这个突变体。相比之下，K47A、Y63I、W70L、G146A、I162A、S169A、I187A、H413L和R415A等突变并没有消除5 m的正变构效应米 我-苯丙氨酸(表5). 综上所述，这些结果表明，残留物位于预测的我-Phe-binding位点，包括Leu⁵¹、Thr¹⁴⁵，序列号¹⁷⁰，序列号²⁷²和Tyr²¹⁸，在传感中发挥关键作用我-苯丙氨酸。

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图7。

突变体的个体细胞反应我-指示[Ca增量的Phe敏感位点²⁺[rsqb]_o个在…在场或不在场的情况下我-苯丙氨酸。将转染野生型CaSR或突变体的HEK293细胞负载Fura-2 AM 15分钟。每次实验有或没有5 m米 我-Phe开始于相同的非含钙林格缓冲液中，随后[Ca逐步增加²⁺]_o个直到[Ca²⁺]_我到达高原（高达30米米)通过340或380nm激发后510nm处发射的光的比率变化进行监测。对至少30个细胞进行突变体S272A和T145A分析。显示了单个细胞的典型细胞反应。

全球功能正异性协同调谐我-CaSR对[Ca正同向协同反应的Phe²⁺]_o个

感应我-站点1附近枢纽区域的Phe标记为全局(即。广泛延伸至ECD）对五种预测钙的影响²⁺-早期预测的结合位点，分布在CaSR ECD中的几个不同位置。有趣的是，增加了5m米 我-Phe显著挽救了[Ca²⁺]_我两个突变体，E297I和D215I，分别在位点1和2的反应，表现出破坏的协同性。尤其是，我-Phe转换了双相Ca²⁺-E297I的响应曲线回到单相曲线(图8).图8表明他们的[Ca起点²⁺]_o个-起始振荡从17.0±0.4米减少到7.3±0.2米米（E297I）和13.9±0.2至6.7±0.3 m米（D215I），分别在我-苯丙氨酸(表2). 这两个突变体在它们的起始点出现2倍以上的位移我-苯丙氨酸。在这两种情况下，它们的振荡频率都增加到超过2个峰值/分钟，而没有我-苯丙氨酸(图8c和表2). 同样，添加我-Phe降低了其EC₅₀细胞群分析中的数值(表3).

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图8。

[加利福尼亚州²⁺[rsqb]_我CaSRs对Ca突变的反应²⁺-增加[Ca刺激的结合位点²⁺]_o个有无5m米我-苯丙氨酸。 一，[钙²⁺]_我在没有或存在我-苯丙氨酸。[加利福尼亚州²⁺]_o个逐步增加到30米米或直到[Ca²⁺]_我到达了一个高原。b条，[Ca的频率分布²⁺]_o个CaSR转染的单个HEK293细胞开始振荡。c在单细胞实验中，对30多个细胞的振荡模式频率进行了研究。对于没有我-Phe，在[Ca水平下记录每分钟峰数²⁺]_o个大多数细胞（>50%）开始振荡，而对于5m的实验米 我-Phe，在相应的[Ca水平上分析频率²⁺]_o个在没有我-苯丙氨酸。空条形图，如果没有我-菲；黑色条，在5米的情况下米 我-苯丙氨酸。d日，用于测量[Ca的群体分析²⁺]_我钙瞬时转染HEK293细胞的反应²⁺-在[Ca逐步增加期间使用Fura-2 AM结合位点相关的CaSR突变体²⁺]_o个0.5至30米米.[钙²⁺]_我使用希尔方程进一步拟合响应。插入在里面顶部面板属于d日，放大了绑定第一阶段的视图。

位点3的突变体E224I的[Ca²⁺]_o个需要启动[Ca²⁺]_我振荡，但变化较小（从3.0±0.1到5.0±0.2 m米[加利福尼亚州²⁺]_o个(n个> 30,第页<0.05），与前两个突变体相比。此外，其EC升高₅₀人口研究中获得的数值与单细胞研究的结果密切相关(表2和​和3），三)表明该突变体感知[Ca的能力受损²⁺]_o个但是，添加了我-Phe不仅显著降低[Ca水平²⁺]_o个启动振荡所需，但也增加了在相同水平[Ca下测得的振荡频率²⁺]_o个此外，群体分析表明，EC₅₀减小，最大响应为5m米 我-苯丙氨酸。

谷氨酸³⁵³是Ca的一部分²⁺-肺叶2的结合位点4，而天冬氨酸³⁹⁸和Glu³⁹⁹参与站点5(26).表3和图4表明清除4号和5号位置的这些带负电荷的残留物会增加[Ca的水平²⁺]_o个需要启动[Ca²⁺]_我振荡和受体的EC₅₀突变受体的值。我-5 m处的Phe米能够增强这些突变体对[Ca的敏感性²⁺]_o个并降低其EC₅₀值。因此，如所示表2，不仅仅是Ca²⁺-与预测的相邻的结合残基我-Phe-binding站点(例如，位点1和2），但也显示出离铰链区域更远的位点我-Phe引起的EC降低₅₀和起始点，以及振荡频率和希尔系数的增加。这一结果表明，这两种物质之间的功能性正异性合作相互作用具有全球性我-Phe和细胞外Ca²⁺.