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生物化学杂志。2014年2月21日；289(8): 4778–4786.
2013年12月17日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M113.486290型
预防性维修识别码：项目经理3931039
PMID：24347171

死亡诱因毁灭者1(滴滴1)基因调节胚胎干细胞自我更新*保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg

刘银音（音）,‡ Hyeung Kim先生,‡ 梁建聪,‡ 魏思路,§ 欧阳彬,§ 刘丹（Dan Liu）,‡,1和周松阳‡§¶,2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

背景： 滴滴1在发展中发挥着重要作用。

结果： 滴滴1抑制导致ES细胞分化，其表达促进ES细胞自我更新。

结论：Dido1参与ES细胞维护，并与Nanog和Oct4等典型ES细胞因子形成反馈和前馈回路。

意义：Dido1代表了ES细胞调节电路中的一个新因子，用于维持ES细胞的自我更新。

关键词：胚胎干细胞，信号转导，干细胞，转录因子，转录调控，多能性，自我更新

摘要

以主转录因子（如Oct4、Nanog和Sox2）为中心的因子调控网络有助于维持胚胎干细胞（ES）并确保其多能性。这些主要转录因子的靶基因决定了ES细胞的转录格局。在这项研究中，我们报告了我们的发现滴滴1是Oct4、Sox2和Nanog等典型转录因子的靶点，在调节ES细胞维持中起着重要作用。我们发现小鼠ES细胞中Dido1的耗竭导致分化，而Dido1异位表达抑制了白血病抑制因子撤除诱导的分化。我们进一步证明，虽然Nanog和Oct4可以占据滴滴1并促进其转录，Dido1也可以靶向多能性因子的位点，如纳克和10月4日积极调节他们的表达。通过这个反馈和前馈回路，Dido1能够调节小鼠ES细胞的自我更新

关键词：胚胎干细胞，信号转导，干细胞，转录因子，转录调控，多能性，自我更新

介绍

胚胎干细胞具有无限分裂和分化为多个谱系的能力(1,2). 在过去十年中，我们对调节ES细胞自我更新和多能性的因子和途径的理解取得了巨大进展，特别是围绕主转录因子（如Oct4、Nanog和Sox2）的调控网络(三,–14). 通过复杂的前馈和反馈调节环，这些因子维持ES细胞转录环境(6,7,11,15). Oct4、Nanog和Sox2也直接或间接参与招募染色质重塑蛋白来调节基因表达(16,–20). 对于小鼠ES细胞，Oct4是多能性和自我更新维持所必需的(5,9)是体细胞重编程的关键因素(21,–26). 尽管Nanog不是ES细胞多能性所必需的(27)，在缺乏白血病抑制因子（LIF）的情况下对小鼠ES细胞至关重要三(4). 研究表明，LIF通过激活主转录因子促进ES细胞的自我更新和多能性(10,28,–30). 当Nanog体外表达时，小鼠ES细胞能够补偿LIF的缺乏(4,28).

包含Nanog、Oct4、Sox2和其他干细胞转录因子的靶基因的转录网络确保了干细胞的多功能状态并决定了细胞命运。基因组范围的转录组和占有率研究对帮助调节细胞命运决定的主转录因子的许多靶点提供了深入的见解，但对大量潜在靶点的功能仍知之甚少。在本报告中，我们描述了以下发现：滴滴1，死亡诱导物消灭子的最短剪接变体(迪多)基因，作为一种新型的小鼠ES细胞维持调节剂。这个迪多基因编码三种剪接变体(滴滴1,2、和三)并且与细胞凋亡和发育有关(31,–35). 最长和最广泛表达的亚型滴滴3被证明对ES细胞的自我更新和多能性是不可或缺的(34)；然而，亚型的作用滴滴1尚未探索ES细胞的维护。我们在这里展示了滴滴1小鼠ES细胞中的亚型抑制LIF退出诱导的分化，而敲除Dido1促进分化。此外，滴滴1可以针对关键多能性因子的位点，如纳克和10月4日积极调节他们的表达。我们的数据表明，Dido1通过与典型ES细胞因子形成前馈和反馈调节环来帮助维持ES细胞，并且它们突出了探索非经典多能性调节因子与主转录因子之间的串扰的重要性。

实验程序

细胞系和表达式构造

小鼠AB2.2 ES细胞由贝勒医学院达尔文核心实验室提供，并在添加15%胎牛血清和0.01%LIF的培养基中培养。编码GFP、小鼠Nanog和人类的cDNADIDO1型在EF1a启动子控制下克隆到小鼠干细胞病毒逆转录病毒载体中，并用HA和FLAG标记。小鼠干细胞病毒载体还包含一个用于选择的嘌呤霉素抗性标记。逆转录病毒转导将构建物导入ES细胞，然后进行嘌呤霉素筛选。

抗体

如前所述进行免疫沉淀和免疫印迹实验(16)，使用以下抗体：抗HA（ab9110；Abcam）、抗管蛋白（ab52901；Abcam）、抗GAPDH（sc-25778；Santa Cruz Biotechnology）、抗Nanog（BL1662用于Western blotting，BL-2663用于ChIP；Bethyl Laboratories）、抗Oct4（sc-8628用于Western-blotting，sc-9081用于ChIP）、抗Sox2（ab59776；Abcan），抗FLAG（F7425；Sigma）、抗磷酸-STAT3（9131；细胞信号）、抗STAT3（610189；BD Biosciences）。

RNAi敲除和RT定量PCR（RT-qPCR）

隐形siRNA滴滴1如前所述，将（Invitrogen）转染到6孔板中的ES细胞中(36). 转染后2天，将ES细胞传代并再次转染相同的寡核苷酸。第二轮转染后2天，用RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取总RNA。使用iScript Select cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）对每个反转录反应使用等量的RNA。使用ABI PRISM 7300序列检测系统和SYBR Green Master Mix进行实时PCR。18S用作qPCR的内部对照。RT-qPCR引物集可在补充表一.

隐形siRNA序列为：siDIDO1_1，5′-GCACAGAGACUAGEGUCAGUAGAAA；siDIDO1_2，5′-CAAAGGCUAUCAACCACCAGUAA；siDIDO1_3，5′-GCCUUACGUGGAAGACUUCAGAA；对照siRNA序列，5′-UUCUCUCCCACGCAGUACAUUUA。

染色质免疫沉淀（ChIP）

如前所述进行ChIP实验(16)，可在中找到底漆套件补充表二.

LIF提取和维甲酸（RA）治疗对自我更新和分化的检测

为了确定自我更新活性，在不含LIF的ES培养基中培养体外表达不同基因的小鼠ES细胞，并每隔4天传代一次，持续～21天（～6代）。对于分化测定，ES细胞在6孔板中以克隆密度接种，然后在没有LIF的情况下培养。在LIF退出后的不同时间点，用碱性磷酸酶染色检测试剂盒（Millipore）进行碱性磷酸酶着色，提取RNA进行RT-qPCR分析。RA的最终浓度为1μ米.

结果

滴滴涕对维持ES细胞至关重要

人类和小鼠DIDO1共有76%的同源性，并且都包含高度保守的序列同源性（PH）结构域，这表明了DIDO1的功能重要性(图1A类) (31,32). 不同于亚型二恶英和三，最短的亚型滴滴1缺少C末端转录延伸因子S-II亚单位M（TFSIIM）结构域和spen-paralog和ortholog（SPOC）结构区。我们找到了滴滴1与小鼠胚胎成纤维细胞相比，亚型在小鼠ES细胞中的表达更高；相反滴滴3与小鼠胚胎成纤维细胞相比，小鼠ES细胞中的亚型表达水平较低(图1B类)这表明这两种亚型在小鼠ES细胞中具有不同的作用。此外，当我们检查滴滴1mRNA在分化过程中的表达，我们发现滴滴1RA治疗或LIF停药诱导分化过程中水平下降>2倍(图1C类)，表明滴滴1可能在小鼠ES细胞中有重要作用。然后我们体外表达HA-taggedDIDO1型在小鼠ES细胞中，并在退出LIF后使用碱性磷酸酶染色作为自我更新标记物检查这些细胞。HA-tagged Nanog和GFP分别用作阳性和阴性对照(图1,D类和E类). 正如预期的那样，与表达GFP的细胞相比，Nanog的过度表达能够抑制LIF提取诱导的分化。重要的是，ES细胞稳定表达迪多1也有更多的未分化集落和更少的完全分化集落，这表明DIDO1的过度表达能够抑制LIF退出诱导的分化(图1F类). 接下来，我们进行了RT-qPCR以检测这些细胞中的谱系标记。与以前的报告一致，LIF的退出导致滋养层的再表达降低(Cdx2和脱中胚蛋白)，内胚层(Afp公司和古塞科动物)，中胚层(腕表和混合物1)和外胚层(内斯汀和Fgf5型)对照细胞中的标记(图1,克和1H（H）). 这种减压（除Fgf5型)可以通过Nanog过度表达而被抑制。同样，在表达外源性DIDO1的细胞中，所检测的大多数谱系标记的激活显著降低，表明其在维持小鼠ES细胞的多能状态中的作用。

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DIDO1的异位表达抑制LIF提取诱导的小鼠ES细胞分化。 A类，示意图表示鼠标Dido1。荷兰统计局，核定位信号。博士，PH域锌指图案。B类在小鼠ES细胞和小鼠胚胎成纤维细胞中进行RT-qPCR(最大有效载荷)使用两组针对滴滴1和滴滴3亚型。PCR产物经测序验证。误差线注明S.D(n个= 3).C类，小鼠ES细胞系AB2.2(左边)和E14(正确的)用RA处理或无LIF培养，然后在指定的时间点用针对滴滴1基因。D类用抗HA抗体对稳定表达HA标记GFP（阴性对照）、Nanog（阳性对照）和DIDO1的小鼠ES细胞进行Western blotting分析。采用Tubulin作为负荷控制。E类，单元格来自D类在进行AP染色检查之前，用或不用LIF培养4天。F类，结果来自E类是量化的。对于每个细胞系，进行了三个独立的实验（每个实验50个菌落）。克和H（H），单元格来自E类还通过RT-qPCR检测了指示的谱系标记。误差线表示S.D(n个= 3). **,第页全部<0.01面板.

Nanog和Oct4占领Dido1启动子及其表达的正调控

我们注意到上调了滴滴1Nanog过表达细胞中的基因表达(图2A类)，这支持了以下观点滴滴1可能被Nanog和其他主转录因子靶向和调节。为了测试这种可能性，我们使用特异于启动子区域的引物对内源性Nanog和Oct4进行了ChIP分析滴滴1基因(图2B类). 我们发现Nanog和Oct4在滴滴1启动子与控制位点的比较。富集度最高的区域位于迪多1转录起始位点。概念是滴滴1我们对瞬时转染靶向Oct4或Nanog的siRNAs的细胞的RT-PCR分析进一步证实了Nanog/Oct4可能具有靶向性。这两个基因的敲除效率均>80%(图2,C类和D类). 重要的是，Oct4和Nanog的消耗导致下调滴滴1mRNA表达。综合起来，这些数据表明Nanog和Oct4积极调节滴滴1基因表达和Dido1可能是ES细胞维持中Nanog/Oct4多能性电路的一部分。

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Nanog和Oct4积极调节滴滴1基因表达。 A类，通过RT-qPCR检测稳定过表达GFP或Nanog的小鼠ES细胞滴滴1mRNA表达。误差线注明S.D(n个= 3).B类，ChIP实验是使用针对内源性Nanog和Oct4的抗体以及针对启动子区域的引物进行的滴滴1轨迹。指示了引物的位置。兔IgG作为阴性对照。误差线注明S.D(n个= 3).C类用siRNA寡核苷酸瞬时转染小鼠ES细胞10月4日使用引物进行RT-qPCR分析前2天10月4日和滴滴1.干扰siRNA寡核苷酸(数控)作为阴性对照。误差线注明S.D(n个= 3).D类，对瞬时转染siRNA寡核苷酸的小鼠ES细胞进行RT-qPCR分析纳克.干扰siRNA寡核苷酸(数控)作为阴性对照。误差线注明S.D(n个= 3). *,第页< 0.05; **,第页全部<0.01面板.

小鼠ES细胞Dido1耗竭诱导分化

测试是否滴滴1为了维持小鼠ES细胞的多能性和自我更新，我们产生了暂时被敲除的细胞滴滴1使用三种不同的siRNA并在LIF存在下培养这些细胞。与对照敲除细胞相比，Dido1缺失导致AP染色较弱，分化集落数量增加(图3,A类和B类). 为了进一步排除siRNA的非靶向效应，我们随后进行了基因拯救实验。为了实现这一点，我们引入了滴滴1siRNA寡核苷酸进入小鼠ES细胞，稳定表达对siRNA寡核苷酸具有耐药性的HA标记的人类DIDO1。表达HA标记GFP的细胞作为阴性对照。通过Western blotting证实HA标记的外源蛋白的表达，并通过RT-qPCR测定敲除效率（～70%）(图3,C类和D类). 与用对照载体挽救的Dido1敲除细胞相比，同样表达人类Dido1的Dido敲除细胞表现出与GFP表达细胞相似的形态学和AP染色模式(图3E类). 与它们的形态学变化一致，通过RT-PCR评估，Dido1敲低细胞中谱系标记物的去抑制是明显的(例如Cdx2和腕表) (图3F类). 在DIDO1救援细胞中，滋养层、外胚层和中胚层标记被部分抑制。这些观察结果进一步证明Dido1在ES细胞多能性回路中代表了一个额外的参与者，并参与了ES细胞的维护。

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ES细胞中Dido1的耗竭诱导分化。（A） 用3个siRNA寡核苷酸瞬时转染小鼠ES细胞迪多1碱性磷酸酶染色。干扰siRNA寡核苷酸(数控)作为阴性对照。量化显示在正确的。B类，siRNA寡核苷酸的敲除效率A类用两组Dido1引物进行RT-qPCR检测。C类稳定表达HA标记GFP和DIDO1的小鼠ES细胞瞬时转染siRNA寡核苷酸滴滴1从A类（siDido1_3），并在两轮siRNA转染后用所示抗体进行Western blotting检测。GAPDH起到了装载控制的作用。干扰siRNA寡核苷酸(中心)作为RNAi的阴性对照。D–G型，用RT-qPCR检测这些细胞(D类)使用针对Dido1的两组引物进行碱性磷酸酶染色(E类和F类)，以及通过RT-PCT用于分化标志物的表达(克).误差线注明S.D(n个= 3). **,第页< 0.01.

Dido1直接调节多潜能因子的表达

我们推测Dido1可能通过调节多能性标记的表达而发挥主转录因子网络的作用。为了验证这一想法，我们培养了在LIF存在下稳定表达DIDO1或GFP的小鼠ES细胞，并通过RT-PCR比较了多能性标记物Nanog、Oct4和Sox2的表达水平。我们发现DIDO1过度表达细胞中所有三个因子的表达都增加(图4A类). 此外，信息表达的增加伴随着Nanog、Oct4和Sox2蛋白水平的轻微但可重复的增加(图4B类). 这个滴滴1-蛋白质数量的依赖性增加可能是由转录增加所驱动的。事实上，在没有LIF的DIDO1过表达细胞中也获得了类似的模式，尽管与LIF中维持的细胞相比，多能性标记物的诱导程度较低(图4C类). 值得注意的是，当我们通过Western blotting检测Dido1 RNAi细胞和那些同样被Dido1表达拯救的细胞时，我们发现Dido1 KD细胞的Oct4、Nanog和Sox2水平降低(图4D类).

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Dido1反馈调节多能性因子的表达。 A类和B类，在LIF存在下培养稳定表达DIDO1的小鼠ES细胞，并检测10月4日,Sox2系统、和纳克通过RT-qPCR(A类)和蛋白质印迹(B类). 过表达GFP的细胞作为对照。误差线注明S.D(n个= 3). GAPDH被用作负荷控制。C类在没有LIF的情况下培养稳定表达GFP（阴性对照）、Nanog（阳性对照）和DIDO1的小鼠ES细胞。mRNA表达10月4日,纳克、和Sox2系统RT-qPCR分析。误差线表示S.D(n个= 3).D类，控制，滴滴1击倒，以及滴滴1用人DIDO1表达拯救的敲除细胞在LIF存在下培养，并用所示抗体进行Western blotting检测。GAPDH被用作负荷控制。E类，单元格来自A类在有或无LIF的情况下培养，并用所示抗体进行Western blotting检测。抗tubin抗体用作负荷对照。F类使用抗FLAG抗体通过ChIP分析表达FLAG标记DIDO1的小鼠ES细胞。用兔IgG作为对照。特定于所示启动子区域的引物10月4日,纳克,销售4、和Sox2系统用于qPCR。误差线注明S.D(n个= 3). **,第页< 0.01.IP（IP），免疫沉淀。

为了排除DIDO1介导的LIF戒断诱导的分化和多能性因子上调的抑制仅仅是LIF自分泌回路激活的结果的可能性，我们检测了DIDO1表达是否导致STAT3磷酸化和激活，因为STAT3的激活是LIF依赖性小鼠ES细胞维持的中心途径(28,37,38). 如所示图4E类尽管LIF的添加导致磷酸化STAT3的明显积累，而不管DIDO1状态如何，DIDO1的过度表达单独对STAT3激活没有影响。这些观察结果表明DIDO1可能直接调节多能性因子。事实上，当我们对DIDO1过表达细胞进行ChIP实验时，我们发现外源性和内源性DIDO1在纳克,10月4日,销售4、和Sox2系统(图4F类). 总之，我们的数据支持Dido1和多能性因子之间的反馈和前馈循环，其中Dido1可以占据关键多能性标记的位点并积极调节其表达。

讨论

研究迪多基因及其变体支持其在许多细胞过程中的重要功能，例如凋亡和染色体分离，特别是在造血系统中(31,–33,39,–41). 纯合子突变小鼠破坏了迪多该基因是可行的，但表现出造血缺陷和生育能力下降(33). 此外，删除迪多该基因导致胚胎死亡，可能是分化延迟的结果(34). 这些观察结果表明了Dido蛋白在发育过程中的重要作用，并提示了Dido1在ES细胞生物学中的可能作用。

在这项研究中，我们提供了证据证明Dido1是小鼠ES细胞中的一种非经典多潜能因子。我们的siRNA和拯救实验表明，Dido1的表达拯救了ES细胞的自我更新，表明Dido1负责击倒表型。LIF退出诱导小鼠ES细胞发生重大变化，如染色质修饰和基因表达，最终导致分化(28,42). 上调主调节器（如Nanog）有助于在缺乏LIF的情况下维持ES细胞的自我更新和多潜能(4,28).滴滴1受Nanog、Oct4和Sox2的转录调控，也可以靶向主转录因子的基因座以增强其表达。Dido1含有一个高度保守的PH域指。PH结构域能够结合翻译后修饰的组蛋白(43,–46). 据报道，Dido1 PH结构域与组蛋白H3结合(47)，对三甲基赖氨酸4（H3K4me3）具有较高的亲和力(47,48)也许Dido1可以作为转录共激活物，体外表达的Dido1能够通过与活性组蛋白标记的结合促进多能性标记的表达。据报道，Dido3对ES细胞的自我更新和多能性是不必要的(34). 通过特异性删除Dido3特有的C末端结构域（Dido3ΔC）导致Dido3表达缺失，导致Oct4持续表达，并损害胚胎干细胞的分化。有趣的是，表达显性阴性形式的Dido1可降低Dido3ΔC ES细胞中Oct4的表达并缓解分化阻滞。结合我们的研究结果，这些结果表明，滴滴1（而非滴滴3）调节ES细胞自我更新，并增加了滴滴1可能对滴滴3活性产生负面调节的可能性。

有趣的是，酵母和其他生物体中Dido1的同源物（基于序列同源性）似乎参与DNA调节和染色质稳定性，并组装成与活性染色质相连的更高级复合物(39). 这些观察结果也与Dido1在调节多能性标记表达中的积极作用一致。先前的全基因组ChIP-seq分析确定了滴滴1作为Nanog、Oct4和其他转录因子可能靶点的位点(8). 此外，人类ES细胞的RNA测序研究确定滴滴1作为在未分化的人ES细胞中上调的转录物之一(42). 结合我们的数据，这些观察支持Dido1和主转录因子之间的反馈和前馈循环。

蛋白质组学和基因组学研究有助于阐明与Nanog和Oct4-介导的信号通路相互作用的蛋白质网络，并有助于我们了解其功能(7,8,11,12,16,49,–52). 我们对Dido1的研究为与Nanog/Oct4/Sox2相交的复杂因素网络增加了一个额外的参与者。很有意思的是，能否通过与滴滴1的互动，将更多的玩家引入电路。进一步的研究将使我们能够更全面地了解ES细胞中的转录回路。

补充材料

补充数据：

*这项工作得到了国家基础研究计划（973计划资助2010CB945401和2012CB911201）、国家自然科学基金资助科学基金91019020和91213302、国家卫生研究院/NIGMS资助GM081627、NIH/NCI资助CA133249和GM095599以及韦尔奇基金资助Q-1673的支持。这项工作还得到了Dan L.Duncan癌症中心拨款（P30CA125123）的全基因组RNAi筛选和分析共享资源以及管理和全基因组RNAi筛选核心IDDRC P30HD024064的支持。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg本文包含补充表I和II.

三使用的缩写如下：

寿命
白血病抑制因子
迪多
死亡诱导器闭塞器
定量PCR
定量PCR
无线电高度表
维甲酸。

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来自的文章生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会