癌细胞表现出与正常组织细胞不同的代谢改变，1,2可用于抗癌治疗。三癌症和正常细胞都依赖线粒体中的糖酵解和氧化磷酸化来产生能量。氧化磷酸化（OxPhos）具有较大的能量产生，是正常细胞在正常氧张力下的主要途径。然而，正如Otto Warburg首先指出的那样，与正常细胞相比，在正常氧气条件下生长的癌细胞糖酵解速率增加（Warburge效应）。4
癌细胞葡萄糖摄取增加的命运是一个备受关注的研究课题。正如Warburg所指出的，摄入的葡萄糖中有很大一部分转化为乳酸，然后乳酸被排泄到细胞外介质中。4糖酵解通量也可以从糖酵化中间产物3-磷酸甘油酯转向丝氨酸合成，这在淋巴瘤中首次得到证实。5最近有报道称，乳腺癌中丝氨酸合成的流量上调6,7和黑色素瘤。8对黑色素瘤的研究还表明，产生的丝氨酸有很大一部分转化为甘氨酸。8然后，甘氨酸可以进入甘氨酸裂解（GC）系统，在该系统中，甘氨酸被转化为铵和亚甲基四氢叶酸（THF），即合成胸腺嘧啶的辅酶。5最近，在非小细胞肺癌中，甘氨酸代谢也被证明上调9,10以及高增殖的肿瘤衍生细胞系。11
在这些实验发现的同时，我们最近开发了一个大规模的人类细胞代谢模型，为癌症细胞代谢改变的优势提供了新的见解。12,13,14我们已经证明，糖酵解比氧化磷具有更高的每质量途径酶的ATP生成率。12,13因此，在高增殖率下，当细胞质中充满核糖体和代谢酶时，糖酵解比氧化磷更有效地生成ATP，这为Warburg效应的进化起源提供了潜在的解释。我们的模型还预测，癌细胞可以将其葡萄糖摄取导向第三条ATP生成途径，包括丝氨酸合成、单碳代谢和GC系统（SOG途径，).14SOG途径预计在丙酮酸激酶活性降低的肿瘤细胞中特别活跃。大多数癌细胞（PKM2）中表达的丙酮酸激酶亚型可以以活性四聚体形式和非活性二聚体形式存在，这一观察结果强调了这一预测的相关性。15,16
丝氨酸、单碳循环、甘氨酸合成（SOG）途径。SOG途径中涉及的反应示意图，包括丝氨酸合成（绿色）、单碳循环（红色）和GC（蓝色）以及与其他途径的串扰。反应方向是根据NCI60肿瘤衍生细胞系面板中推断的通量推断出来的（详见正文）
在这里，我们为人类癌症子集中SOG途径的活性提供了额外的证据。为此，我们对NCI60癌细胞系的不同癌症类型和代谢通量的基因表达谱进行了研究。我们还研究了反叶酸甲氨蝶呤对SOG途径的抑制作用，重点是使用靶向示踪剂命运关联研究（TTFAS）研究能量应激和代谢通量变化的特征。17,18
结果
预测的SOG途径
预测的路径14如所示它包括从3-磷酸甘油酯合成丝氨酸，同时将谷氨酸转化为α-酮戊二酸(，丝氨酸合成）。然后丝氨酸通过胞浆丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT1）转化为甘氨酸，同时THF转化为5,10-亚甲基-THF（CH2-THF）。或者，丝氨酸可以被转运到线粒体，在那里它可以被线粒体丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT2）转化为甘氨酸。甘氨酸可以被排泄或进入裂解系统，在那里它被转化为铵，同时另一个THF分子也随之转化为CH2-四氢呋喃(，气相色谱）。中国2-THF可以在胞浆或线粒体中转化回THF，同时产生两个ATP(，一个碳循环）。在胞浆中，这是由三功能酶MTHFD1和CH进行的2-THF脱氢酶（NADP依赖性），5,10-甲基-THF（CH+-THF）环水解酶和10-甲酰-THF（CHO-THF）合成酶活性。19在线粒体中，这些活性在MTHFD2和CH之间分配2-THF脱氢酶（NAD依赖性）和CH+-THF环水解酶活性；20MTHFD2L，带CH2-THF脱氢酶（NADP依赖性）；21和MTHFD1L，具有CHO-THF合成酶活性。22
不包括辅因子（NAD+，谷氨酸，NADP+和ADP）和产品（NADH，α-酮戊二酸、NADPH、CO2，新罕布什尔州4+，甲酸盐和ATP），该途径是化学计量平衡的，每个3-磷酸甘油分子产生两个ATP，每个葡萄糖分子产生四个ATP。ATP生成步骤由MTHFD1或MTHFD1L的反向CHO-THF合成酶活性催化。单碳循环的动力学建模表明，在ATP方向上运行该循环在热力学上是可行的。14我们还注意到，进口丝氨酸也可用于运行单碳循环，每个丝氨酸分子的产量为两个ATP或一个ATP，具体取决于甘氨酸是否被裂解。同样，从环境中输入的甘氨酸也可用于运行单碳循环，每分子甘氨酸的产量为一个ATP。
SOG途径的中间代谢物也与其他途径串扰(，青色线条）。丝氨酸和甘氨酸用于蛋白质合成，甘氨酸也用于嘌呤合成。中国2-合成胸苷酸（dTMP）和蛋氨酸（Met）需要四氢呋喃从头开始嘌呤合成（IMP）。最后，NADP+-从属CH2-MTHFD1和MTHFD2L的THF脱氢酶活性可能分别促进细胞液和线粒体中NADPH的产生。23
SOG途径基因在人类肿瘤中的表达
为了研究SOG通路是否在人类癌症中表达，我们对几种癌症进行了基因特征分析。与该途径相关的基因有PHGDH、PSAT1和PSPH公司编码参与丝氨酸合成的各自酶，SHMT1、SHMT2,MTHFD1型,MTHFD2型,百万分之二升和MTHFD1L公司编码参与单碳循环的各自酶，以及GCSH公司,DLD公司,GLDC公司和AMT公司分别编码GC系统的H、L、P和T蛋白(). 这些基因被编译成一个基因签名，然后我们用它来检测它们在癌症中的表达。为了量化这种特征在人类癌症中的流行程度，我们进行了基因集富集分析（GSEA）。24对于分析的每个样本，GSEA报告分数和统计显著性(第页)基因特征的上调和下调。
如所示，基因特征分数捕获分析样本中通路基因的一致过表达或欠表达。很明显，有一部分乳房——()和前列腺癌()其中SOG途径中的大多数基因高度表达，导致SOG基因特征的显著表达。将这一分析扩展到其他癌症类型，我们观察到约28%的肺癌、19%的乳腺癌、9%的前列腺癌、30%的结直肠癌、23%的脑癌和21%的卵巢癌表现出显著的上调(P（P）SOG途径基因特征（数据未显示）。
人类癌症、分化细胞和胚胎干细胞中SOG途径酶编码基因的表达。编码SOG途径中酶的基因的表达（行）(一)乳房和(b条)前列腺癌患者（专栏），基于50和，51分别是。顶行显示GSEA量化的SOG途径、Myc靶点激活和增殖基因特征上调分数，以及Myc基因表达。蓝色表示表达不足，红色表示过度表达。上横线表示肿瘤的子集，其中SOG通路信号显著下调(P（P）<0.05，下降），中度或显著上调(P（P）<0.05，向上）。(c（c）)根据中报告的数据，人类胚胎和分化的正常细胞中SOG途径酶编码基因的表达。30(d日)根据中报告的数据，在小鼠R1胚胎干细胞分化期间SOG途径中编码酶的基因的表达。32样品按起始日期和使用条件进行标记：胚胎体（EB）在非粘附塑料皿、明胶涂层板（GEL）和基质凝胶涂层板（MAT）中形成。白色方块代表缺失的表达式数据
接下来，我们研究了SOG途径基因特征与预后不良标记物的相关性。在乳腺癌中，SOG通路特征与增殖显著相关（皮尔逊相关系数，PCC公司=0.62，具有统计学意义P（P）=1 × 10−6)，Myc基因表达(PCC公司=0.64,P（P）=1 × 10−6)，Myc靶点表达的基因特征(PCC公司=0.58,P（P）=1 × 10–6) ()雌激素受体阴性（ER−）状态(PCC公司=0.46,P（P）=1 × 10–6)已知乳腺癌预后不良的标志物。25,26在前列腺癌中，通路特征也与恶性肿瘤标志物（包括增殖）呈正相关(PCC公司=0.38,P（P）=1 × 10–6)，少量表达Myc基因(PCC公司=0.16,P（P）=1.3 × 10–3)，Myc靶点表达(PCC公司=0.44,P（P）=3 × 10–6) ()，TMPRSS2-ERG融合(个人电脑=0.34,P（P）=1 × 10–5)和格里森得分(PCC公司=0.18,P（P）=1 × 10–3). 最后，在对多种癌症类型的3947个样本进行的汇总分析中，我们证实了通路特征与增殖增加的相关性(PCC公司=0.50,P（P）=2 × 10–6)和Myc靶点表达的基因特征(PCC公司=0.49,P（P）=2 × 10–6).
综合这些数据表明，SOG途径基因的表达与人类癌症中细胞增殖和Myc活化的基因特征相关。该观察结果与之前的工作分析一致在体外肿瘤衍生细胞系的数据11以及Myc驱动肝脏肿瘤形成的小鼠模型。14,27此外，我们回顾，Myc扩增和/或过度表达是人类癌症中常见的事件，28这将解释Myc基因表达、Myc靶基因表达（包括SOG途径基因）和增殖之间的相关性。
胚胎干细胞中SOG途径基因的表达
癌细胞的代谢变化特征在胚胎发育期间也经常被观察到。29因此，我们假设SOG途径可能在胚胎干细胞中活跃。为了验证这一假设，我们分析了胚胎和分化细胞的基因表达谱。30我们观察到，相对于分化细胞，SOG途径中的大多数基因在胚胎干细胞和胚胎体中高度表达(). 我们还观察到基因方面的一些差异MTHFD1型和MTHFD2型分别编码细胞溶质和线粒体单碳代谢酶。表达谱表明线粒体同工酶在胚胎细胞中过度表达，而细胞溶质异构体在白细胞和基质细胞中过度表现(). 最后，在PSPH公司胚胎细胞和分化细胞之间没有显著差异()表明该酶在基因表达水平上不负责调节SOG通路的活性。我们还观察到SOG途径基因的上调与Myc靶点激活和增殖增加的基因表达特征的上调一致。前者与许多SOG途径基因是Myc靶点这一事实一致(PHGDH公司,PSPH公司,上海地铁1号线,MTHFD1型,第2个月和GCSH公司14,31)而后者的事实是胚胎干细胞表现出高增殖率。第二个数据集报告了小鼠胚胎干细胞分化过程中的基因表达谱，分析结果证实了这些观察结果。32随着分化的时间进程，我们观察到SOG途径基因在胚胎发育的初始阶段上调(，第0-3天）。相反，SOG途径基因在分化后下调(，第5天和第7天）。与之前的案例一样，我们确认SOG途径基因的上调与Myc靶点激活和增殖增加的信号上调一致。
我们注意到二氢脯氨酸脱氢酶的基因编码(DLD公司人类和小鼠的Dld）与其他基因相比表现出相反的模式，即在胚胎细胞中下调，在分化细胞中上调。该基因编码GC系统的L蛋白。L蛋白也是丙酮酸脱氢酶的组成部分33以及α-酮戊二酸脱氢酶34复合物，TCA循环的两种关键酶。基因表达数据表明，与GC系统相比，二氢脯氨酸脱氢酶的表达与其作为TCA循环组成部分的功能更相关。我们还注意到DLD公司是未注释为Myc靶点的SOG途径基因的例外之一。
尽管Myc活化特征在胚胎干细胞中上调，在分化细胞中下调，但Myc本身的基因表达与胚胎发育过程中的分化状态无关(). Myc基因表达和Myc靶点表达之间缺乏一致的相关性，这表明Myc的调控是翻译后模式。在分化的肌肉细胞中，已经观察到Myc的翻译后调节，这是通过细胞溶质中钙依赖性钙蛋白酶对Myc蛋白的蛋白水解裂解实现的。35因此，在胚胎干细胞中，Myc可能在翻译后水平被激活，导致Myc靶基因（包括SOG途径基因）的表达增加，增殖增加。
SOG途径在肿瘤衍生细胞系中的代谢通量
为了在代谢通量水平上研究SOG途径活性与增殖之间的相关性，我们接下来研究了之前报道的NCI60肿瘤衍生细胞系的交换通量。11我们开发了“个性化”代谢模型来推断与报告的交换通量一致的内部代谢通量(补充方法). 每个细胞系的个性化包括加倍时间、细胞体积和DNA含量。该模型在两个不同的层次上进行了验证。在总蛋白质含量水平上，该模型预测每个细胞系的蛋白质含量与测量值吻合良好(补充方法,补充图S1). 在每个反应的水平上，我们将模型预测的流量与催化反应的酶复合物中蛋白质的表达进行了比较。蛋白质表达值是从NCI60细胞系的最新蛋白质组分析中获得的。36根据BiGG数据库注释，共有1578个蛋白质与代谢模型中的反应相关37(补充表1). 在41%的病例中，表达的蛋白质与在一个或多个细胞系中发现的相关反应之间存在一致性。该组富含与中央代谢相关的代谢途径，包括糖酵解、氧磷、丝氨酸、甘氨酸和叶酸代谢(补充表2，类型1）。在7%的病例中，未表达的蛋白质与在任何细胞系中未发现活性的相关反应之间也存在一致性(补充表2，类型4）。相反，在51%的情况下，在一个或多个细胞系中检测到蛋白质，但该模型预测所有细胞系中相关反应的通量为零(补充表2，类型3）。这一组富含与脂肪酸和一些氨基酸代谢相关的途径，以及溶酶体和过氧化物酶体中发生的反应(补充表2，类型3）。这些是模型需要进一步改进的领域。最后，在仅有2%的情况下，该蛋白在任何细胞系中都没有检测到，但该模型预测了至少一个细胞系中相关反应的非零通量(补充表2，类型2）。
在检测到蛋白质并发现反应活性的情况下，在一个或多个细胞系中检测到蛋白质，但该模型预测所有细胞系中相关反应的通量为零(补充表2，类型1），在9%的案例中存在显著相关性(P（P）<0.05）。这是一个合理的值，因为每个蛋白质都可以是酶复合物的一部分，其最终表达是其成分表达的非平凡功能。例如，ATP合成酶和NADH脱氢酶分别只有一个（11,9%）和两个（30,7%）亚单位的表达与其预测的反应速率相关(补充表1). 此外，反应速率可由翻译后调节、代谢物浓度和相关代谢途径的速率控制。38例如，代谢控制分析表明，在高度增殖的细胞中，3-磷酸甘油酯的丝氨酸合成受丝氨酸需求控制，而不是受途径上每种酶的特定表达水平控制。39
使用这些个性化的代谢模型，我们估算了SOG途径中的反应通量。为了避免NCI60面板上因单元尺寸变化而产生的偏差，我们按单元体积对通量进行了归一化。SOG途径中估计的反应通量与增殖率高度相关(). 具体来说，3-磷酸甘油酯合成丝氨酸的流量与增殖率呈正相关(PCC公司=0.24,P（P）=0.034,). 由葡萄糖合成的丝氨酸与从培养基中进口的丝氨酸()部分通过SHMT活性转化为甘氨酸，其数量随着增殖率的增加而增加(PCC公司=0.77,P（P）<10–6,). 这种流量分布在细胞溶质（SHMT1，PCC公司=0.77,P（P）<10–6,)线粒体（SHMT2，PCC公司=0.64,P（P）<10–6,)SHMT。在缓慢增殖的细胞中，产生的甘氨酸超过了细胞的生物合成需求，并被排出体外()如前所述。11在几个高增殖细胞系中，从丝氨酸产生的甘氨酸和从培养基输入的甘氨酸通过GC系统部分分解，总体上导致GC通量和增殖率之间的正相关(PCC公司=0.41,P（P）=0.00056,). 丝氨酸转化为甘氨酸和GC中消耗的THF是通过一个碳循环产生的，伴随着ATP的产生，MTHFD（MTHFD1+MTHFD1L）净中值通量随着增殖率的增加而增加(PCC公司=0.70,P（P）<10–6,). 然而，我们观察到细胞溶质周期和线粒体周期之间存在显著差异。在细胞溶质中，MTHFD1预计朝着THF和ATP生成的方向工作(PCC公司=0.74,P（P）<10–6,)而预计MTHFD1L在线粒体中的作用方向相反(PCC公司=0.73,P（P）<10–6,). 我们还注意到，MTHFD2环水解酶活性有助于线粒体中CHO-THF的生成，其数量随着增殖率的增加而增加(PCC公司=0.64,P（P）<10–6,). 如果是GC()以及MTHFD净流量()预测的90%置信区间扩大了很大范围。因此，我们不能排除以下可能性：对于一些不典型的动力学参数选择，甘氨酸没有分解，或者单碳循环中没有ATP生成。
代谢通量与增殖率的关系。(一–我)SOG途径中反应的估计代谢通量显示为细胞系增殖率的函数。每个点/错误条代表NCI60面板中的一条单元格线。该点表示所探索模型动力学参数范围内的中位数，误差条表示90%的置信区间。虚线是线性拟合。面板(b条和e（电子）)报告中测量的交换通量。11这些通量在个性化模型中是固定的，因此，由于模型动力学参数的变化，它们不会显示误差线
肿瘤衍生细胞系中与其他代谢途径的串扰
蛋白质合成
一些SOG途径中间代谢物是生物合成过程的前体。蛋白质合成需要丝氨酸、甘氨酸和蛋氨酸。进口丝氨酸和甘氨酸的总量与蛋白质合成所需的量相同（数据未显示），表明从葡萄糖合成的额外丝氨酸满足不同的要求。从葡萄糖合成丝氨酸的速率实际上高于丝氨酸的进口速率(). 额外的丝氨酸被转化为甘氨酸（如上所述，)，为SOG途径提供燃料。
与其他路径的串扰。(一–我)作为细胞系增殖率的函数，与SOG途径部分或相互干扰的选定反应的估计速率。每个点/错误条代表NCI60面板中的一条单元格线。该点表示所探索的动力学参数范围内的中值，误差条表示90%的置信区间
谷氨酸→α-酮葡酸
在3-磷酸甘油酯合成丝氨酸的中间步骤中，胞浆转氨酶PSAT将谷氨酸转化为α-酮戊二酸，其转化率约为谷氨酸总净转化率的一半α-酮戊二酸(). 这一结果与之前的标记碳示踪实验一致，该实验显示谷氨酸转化为α-酮戊二酸与丝氨酸合成有关。6
ATP平衡
细胞溶质MTHFD1产生ATP的速率与丙酮酸激酶的推测速率相当()表明SOG途径对胞浆中ATP的生成有重要贡献。相反，线粒体MTHFD1L消耗ATP。这种消耗由ATP合成酶的ATP生成平衡().
NADPH平衡
在线粒体中，NADP+-从属CH2-MTHFD2L的THF脱氢酶活性对NADPH生成的贡献相当于谷氨酸脱氢酶（GLUD，). MTHFD2L和GLUD的联合活性产生的总NADPH由NADPH氧化方向的烟酰胺核苷酸转氢酶（NNT）活性平衡()伴随着质子从线粒体转移到胞浆（H+,). 这些质子通过ATP合成酶的活性从细胞质转运回线粒体，伴随着ATP的产生(). 在胞质溶胶中，NADP+-从属CH2-MTHFD1的THF脱氢酶活性对NADPH生成的贡献与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD，)以及脂肪酸合成酶（FAS）的NADPH需求().
嘌呤、蛋氨酸和胸腺嘧啶
在从头开始ATIC和GART的嘌呤合成途径将CHO-THF转化为THF。ATIC+GART的添加速率达到接近0.02 pmol/pl/h的最大值(). 这些值与NADPH生产率相当，NADPH的生产率也达到0.02 pmol/pl/h左右的最大值(). 然而，ATIC+GART的最大速率比MTHFD1的最大ATP生成速率低10倍，其平均值约为0.2 pmol/pl/h(). 尽管胸苷酸合酶（TYMS）和蛋氨酸合酶（MS）的比率为非零，但它们的值相对小于上述反应速率().
甲氨蝶呤治疗会导致能量紧张并抑制嘌呤和脂肪酸合成
SOG途径包含代谢叶酸衍生物的反应，因此可能受到甲氨蝶呤等抗叶酸类药物的抑制(). 叶酸衍生物的浓度降低到单碳循环中酶的半饱和常数以下会导致其速率降低。甲氨蝶呤抑制二氢叶酸还原酶（DHFR，)导致THF池减少。根据这些观察结果，我们假设甲氨蝶呤治疗应抑制SOG途径的预测活性。为了验证这一假设，我们研究了PC-3细胞对甲氨蝶呤治疗的反应。
甲氨蝶呤治疗以剂量依赖的方式抑制PC-3细胞的增殖(). 100 nM时，浓度高于IC50对于这种细胞系（30 nM），我们观察到在最初的24小时内，细胞生长受到抑制，随后出现细胞毒性，其特征是细胞数量显著减少(). 我们假设抑制SOG途径ATP生成可能是治疗后24小时内生长抑制的机制。为了验证这个假设，我们测量了腺嘌呤核苷酸AMP、ADP和ATP水平的变化。治疗后4小时，与治疗后2小时相比，ATP水平显著下降(，4小时，P（P）=0.0061). 相反，此时ADP水平下降较小(，4小时，P（P）=0.031），AMP水平无明显变化(，4小时，P（P）=0.29). 4h时ATP水平下降，而AMP水平无明显变化，导致AMP/ATP比率升高(). 由于AMPK磷酸化增加和AMP自身的变构活化，AMP/ATP比率的增加预计会激活AMP激酶（AMPK）。40为了研究AMPK的激活，我们测量了AMPK磷酸化水平以及乙酰辅酶a羧化酶（ACC）磷酸化水平，ACC是已知的AMPK靶点。40治疗后2小时磷酸化AMPK（pAMPK）水平增加三倍(). 类似地，随着时间的推移，我们观察到磷酸化ACC（pACC）增加了三倍(). 总而言之，ATP水平的下降和pAMPK和pACC的增加表明能量应激是甲氨蝶呤治疗初始反应（0-4小时）的一部分。
甲氨蝶呤治疗对代谢参数的影响。(一)未经治疗和使用10和100 nM甲氨蝶呤治疗的细胞培养中PC-3细胞计数随时间的变化。(b条–（f）)中的更改(b条)ATP、(c（c）)ADP和(d日)AMP水平和英寸(e（电子）)ADP/ATP和(（f）)用100nM甲氨蝶呤处理后的AMP/ATP比率。(克)100 nM甲氨蝶呤治疗后AMPK、pAMPK，ACC和pACC的蛋白印迹。(小时)pAMPK/AMPK和pACC/ACC比值相对于对照的量化（时间零点数据）。(我)EZ公司Topolome（heatmap）总结了在未经处理（对照）和用100 nM甲氨蝶呤（MTX）处理的细胞培养物中三次测量的标记代谢物的变化。红色/蓝色表示高于/低于样本平均值的表达式。顶行指示表达式级别更改的颜色代码
随后，在8小时的时间点，除了ATP水平(8小时后，P（P）<10–6)，ADP水平显著下降(，8小时，P（P）=0.0087），而AMP水平尚未发生显著变化(，8小时，P（P）=0.37). 最后，在24小时时，所有核苷酸的水平都显著下降(，8小时；ATP、，P（P）=0.00096; ADP、，P（P）=0.0011; 放大器，P（P）=0.031). 该观察结果表明，腺嘌呤核苷酸合成受到抑制，这是甲氨蝶呤在中间时间（8-24小时）的反应的一部分。
接下来，我们执行了目标[1,2-13C类2]-研究代谢通量变化的D-葡萄糖命运关联实验。PC-3细胞生长在含有这种精确葡萄糖示踪剂的培养基中，41未经治疗或用甲氨蝶呤治疗，并在治疗24小时后测量不同标记代谢物的浓度(). 葡萄糖消耗量（处理/未处理=0.93）和培养基没有实质性差异13C-乳酸分数（处理/未处理=0.96），表明糖酵解率没有重大变化。发布的没有实质性差异13一氧化碳2分数（处理/未处理=0.99），介质中仅略有减少13培养基中的C-谷氨酸部分（处理/未处理=0.80，P（P）=0.050），表明OxPhos的速率没有显著变化。我们观察到细胞内13C-RNA-核糖部分(P（P）=0.050），这与甲氨蝶呤对嘌呤合成的抑制相一致。42,43我们还观察到细胞内13C-棕榈酸酯部分(P（P）=0.050). 棕榈酸酯合成减少可以通过抑制CH产生NADPH来解释2-MTHFD1的THF脱氢酶活性。棕榈酸合成减少也与甲氨蝶呤治疗后ACC磷酸化增加的报道一致。ACC是脂肪酸合成的关键酶，磷酸化抑制其酶活性。
回到最初的ATP消耗，我们进一步注意到ATP水平下降了约10μ2至4小时的mol/g蛋白质，表明ATP的产生和消耗之间的不平衡约为5μmol/g蛋白质/h。靶向微量实验表明，处理后的糖酵解和OxPhos的速率没有显著变化与未经处理的PC-3细胞，排除了这两条通路的抑制是ATP耗竭的原因。ATP水平的最初下降也不太可能仅仅由于嘌呤合成的减少而发生。根据GART或ATIC的速率估计，未经处理的PC-3细胞系中嘌呤的合成速率为1.4μmol/g蛋白质/h，即低五倍。此外，其他嘌呤ADP和AMP的水平在最初4小时内没有表现出像ATP的水平那样明显的下降。另一方面，未经处理的PC-3细胞中MTHFD1的ATP生成率估计为34μmol/g蛋白质/h，尽管如此具有相同大小的误差线。综上所述，这些数据表明，由于叶酸池中的相对变化，MTHFD1对ATP生成的抑制是ATP水平最初下降的最可能原因。相反，随后ATP水平的下降具有较慢的动力学，下降约5μ4至24小时的mol/g蛋白质，即以0.25的速率μmol/g蛋白质/h。这种衰减更可能是由嘌呤合成的抑制引起的，因为在此时间范围内，ATP和ADP浓度都表现出类似的下降。
讨论
对人类癌症基因表达数据的分析表明，SOG途径中酶编码基因的表达与细胞增殖和Myc靶点激活的基因特征相关，如前所示在体外.11SOG通路中的几个基因是Myc靶点，在小鼠肝癌诱导型Myc模型中，当Myc激活时，它们的表达增加。14SOG途径活性与细胞增殖之间的联系在生长的癌细胞株的代谢通量水平上得到了进一步支持在体外估算的葡萄糖丝氨酸合成通量、丝氨酸输入、丝氨酸转化为甘氨酸和GC均与NCI60细胞系的增殖率相关。我们之前已经证明，对反叶酸甲氨蝶呤的敏感性与SOG途径线粒体酶的表达有关，在体外用于治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）。44该观察结果与SOG通路的活性与增殖之间的相关性以及甲氨蝶呤对高增殖细胞的已知特异性相一致。
对NCI60肿瘤衍生细胞系面板的推断通量的分析表明，SOG途径的大部分通量直接用于生物合成的ATP、NADPH和嘌呤需求。叶酸代谢对嘌呤合成的贡献已被广泛研究。43,45对ATP生成的贡献支持了我们之前关于SOG途径在能量生成中的理论预测。14在这里，我们还揭示了该途径对细胞增殖的NADPH需求的贡献，例如对脂肪酸合成的贡献。我们还观察到，抗叶酸药物甲氨蝶呤治疗抑制了SOG途径的这三个主要功能。ATP水平的快速初始衰减证明了对ATP产生的抑制作用。NADPH生成的抑制是由葡萄糖合成脂肪酸的减少引起的。甲氨蝶呤治疗后，腺嘌呤核苷酸水平和葡萄糖中核糖核苷酸合成的减少证明了嘌呤合成受到抑制。
肿瘤衍生细胞系中估计的SOG途径流量与叶酸循环的标准观点不同：45（i） 细胞质和线粒体之间的碳单位交换是通过丝氨酸、甘氨酸和甲酸盐通过线粒体膜的运输进行的。（ii）线粒体MTHFD1L将CHO-THF转化为THF，同时产生甲酸盐。（iii）细胞溶质MTHFD1将THF转化为CHO-THF，消耗线粒体中产生的甲酸盐。据我们所知，在人类细胞中没有确凿证据支持这一观点。最佳可用数据为L-[3-13C] -丝氨酸和[13C] -使用乳腺癌细胞系MCF-7进行甲酸盐示踪实验。46当MCF-7细胞生长在（L-[3-13C] -丝氨酸）([13C] -甲酸盐），（L-[3-12C] -丝氨酸[13C] -甲酸盐）和（L-[3-13C] -丝氨酸[12C] -甲酸盐），约为95%、80%、70%和32%13嘌呤的C-标记。这些数据被解释为甲酸盐是胞浆中嘌呤合成的单碳单位的主要供体，而甲酸盐是由线粒体中的丝氨酸合成的。然而，这些数据也与本文报道的叶酸循环一致()丝氨酸和甲酸盐被运输到线粒体，并向CHO-THF提供一个碳，然后被运输到胞浆中，用于嘌呤合成。我们注意到线粒体叶酸转运体（MFT）的活性是后者假说的关键组成部分。研究表明，还原叶酸（例如THF和CHO-THF）可以通过线粒体膜转运，这种活性部分由MFT介导。47,48然而，在叶酸盐循环的标准观点中，这一观察结果并未被考虑在内。因此，需要进一步定量胞质溶胶和线粒体中叶酸衍生物的标记部分，以区分叶酸循环的标准观点和本文提出的替代观点().
材料和方法
微阵列数据和分析
乳腺癌数据集包括之前van’t Veer报告的295个样本等。49和van de Vijver等。50前列腺癌数据集来自Sboner之前报道的281名患有局限性前列腺癌的男性等。51使用DASL的人类6 k转录信息基因面板测量基因表达。51使用上面列出的两个数据集和来自基因表达综合（GEO）存储库的以下数据集对癌症数据集进行汇总分析（2011年12月访问）；结肠癌GSE17536、GSE14333和GSE20916；脑癌GSE4271、GSE4290和NCI伦勃朗数据库；肺癌GSE31210、GSE11969和GSE19188；卵巢癌GSE9899和GSE6008。数据收集和规范化如所述补充方法。SOG途径特征在结果部分中报告。其余基因特征来自：增殖、，52胚胎干细胞53和Myc活化。31如前所述计算特征得分和统计显著性。24
个性化代谢模型
为NCI60小组中的每个细胞系开发个性化代谢模型，如补充方法个性化包括之前报告的外汇流量，11根据先前报告的核型和细胞体积估算DNA含量。使用Cellometer Auto T4（美国马萨诸塞州劳伦斯市Nexcelom Bioscience LLC）获得的细胞尺寸测量值估算每个NCI60板细胞系的细胞体积。54图像细胞仪利用光场显微镜光学装置进行图像细胞分析。将每个细胞系用移液管移到一次性计数室中，并采集明亮的图像进行图像分析，系统在图像分析中测量细胞的像素面积，并将结果转换为相应的细胞直径。图像细胞仪的操作和功能已在前面介绍过。55,56
腺嘌呤核苷酸测量
甲氨蝶呤处理：1.5×106每个时间点将PC-3细胞一式三份接种在100 mm培养皿中，在添加10%透析FBS的RPMI培养基中过夜，并放置在含有5%CO的37°C培养箱中2。播种后24小时，取出培养基，用含有100 nM甲氨蝶呤或无甲氨蝶啶培养基的培养基替换，并放回37°C的培养箱中。为了在每个时间点收集，去除培养基，并用冷Ca洗涤平板三次++，镁++和无酚红HBSS（美国纽约州格兰德岛Gibco）。将平板放在冰上，加入0.5 ml 0.6 N高氯酸，快速刮平平板并收集到微型离心管中。再次用0.5 ml的0.6 N高氯酸刮平平板，并将两部分合并。使用Polytron PT 1300均质机在7000r.p.m.的冰上均质每个样品30秒。样品在13000×克将上清液转移到干净的微型离心管中，并在−80°C下储存，直至分析。用1.0 ml 0.2N NaOH溶解细胞颗粒，以使用Bradford方法进行蛋白质分析。
如前所述，使用荧光法对细胞内腺嘌呤核苷酸进行定量。57用0.8 ml冰镇氟利昂/三辛胺（体积比4:1）中和细胞提取物和标准品（在0.6N高氯酸中制备的ATP、ADP和AMP）。将中和的核苷酸提取物涡旋30秒，然后以13000×克在4°C下保持5 m。收集上层水层，将核苷酸衍生为荧光1，N6-乙烯衍生物。A 50分μ1份核苷酸提取物与150混合μl新制备的氯乙醛混合物（50%），置于1.5 ml微型离心管中的醋酸盐缓冲液（1M，pH4.5）（11.2:138.8，v/v）中，混合，然后在60°C下加热1小时。反应完成后，将试管置于冰上以停止反应。将样品稀释5倍μ衍生样品的l用于腺嘌呤核苷酸分析，结果表示为μmol/g蛋白。
使用配备L-7200自动取样器托盘（保持在约8°C）、L-7100泵和L-7480荧光检测器（激发和发射波长分别设置为280 nm和410 nm）的高效液相色谱系统（日本东京日立）对腺嘌呤核苷酸进行定量。使用Waters Sunfire ODS柱（5μm、 250×4.6 mm，Milford，MA，USA），30°C，流动相A:30 mm KH2人事军官4+0.8 mM TBAP（磷酸四丁基铵），pH 5.45；和B:乙腈/30 mM KH2人事军官4（1:1，按体积计）+0.8 mM TBAP，pH 7.0。使用1ml/min的梯度洗脱分离分析物。57通过将保留时间与已知核苷酸标准进行比较，确定乙烯-腺嘌呤核苷酸的特性。腺嘌呤核苷酸衍生物AMP、ADP和ATP的保留时间分别为11 min、19 min和21 min。通过线性回归分析从标准曲线计算细胞中腺嘌呤核苷酸的浓度。
AMPK激活
甲氨蝶呤治疗前24小时，7.5×105PC-3细胞接种在添加10%透析FBS的RPMI培养基中的六孔板中，并在含有5%CO的培养箱中37°C培养过夜2在治疗时，取出培养基，用含有100 nM甲氨蝶呤或无甲氨喋呤培养基的新鲜培养基替换，并放入含有5%CO的37°C培养箱中2在适当的时间点，移除培养基；用PBS（Gibco）冲洗细胞并刮入微型离心管。短暂离心后，在含有商业蛋白酶抑制剂混合物（美国新泽西州罗氏、纳特利）和磷酸酶抑制剂（50 mM氟化钠10 mM原钒酸钠）的RIPA缓冲液中溶解细胞颗粒。通过Bradford蛋白质分析（美国加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室）对蛋白质进行定量后，通过10%的SDS-PAGE对蛋白质进行解析，并将其转移到硝化纤维素膜上（Bio-Rad实验室）。用在三缓冲盐水+0.1%吐温-20中制备的5%脱脂干乳封闭膜后，根据制造商的指示，在4°C下用所需的一级抗体培养膜过夜。将膜在三缓冲盐水+0.1%Tween-20中洗涤，并在室温下与适当的过氧化物酶缀合的第二抗体孵育2小时。使用增强化学发光试剂盒（皮尔斯，赛默飞世尔科技公司，伊利诺伊州罗克福德，美国）对色带进行可视化。抗AMP活化蛋白激酶（AMPK）、抗Thr172 pAMPK、抗乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、抗Ser79 ACC和抗兔次级药物购自Cell Signaling Technology（Danvers，MA，USA）。抗甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）购自Millipore（马萨诸塞州Billerica，美国），抗鼠次级购自Santa Cruz Biotechnologies（美国德克萨斯州达拉斯）。
靶向示踪剂命运关联研究
PC-3细胞（2×106)在添加了10%FBS的RPMI培养基中保持，将其分三次播种到100 mm培养皿中，在添加了含有3 mm[1,2-13C类2]-D-葡萄糖示踪剂和3 mM葡萄糖（美国密苏里州圣路易斯Sigma），存在或不存在100 mM甲氨蝶呤。将细胞置于含有5%CO的37°C培养箱中2。24小时后收集细胞颗粒进行分析。简单地说，去除培养基，用37°C PBS冲洗细胞，然后加入2ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA 3分钟或直到细胞分离。将细胞在1200转/分下旋转5分钟。将细胞颗粒和上清液（每个细胞系取10 ml）在−80°C下冷冻在15 ml试管中。
使用SiDMAP的基于示踪剂-底物的GC-MS靶向示踪剂归宿关联确定通量率EZ公司Topolome平台。58这些分析包括通过位置相关性确定相关性及其对MTX治疗的反应13糖酵解、糖原合成、三羧酸循环、柠檬酸穿梭、脂肪酸等多种中间代谢产物中的C示踪剂富集模式从头开始合成、链延伸和去饱和、糖异生、戊糖循环中的碳交换、葡萄糖-6P-脱氢酶通量以及葡萄糖完全氧化成13一氧化碳2使用质量同位素分布分析（MIDA）测定细胞和培养基代谢物中选定离子的保留时间和质量电荷比（m/z）离子簇59通过可逆代谢步骤从正向示踪剂掺入模式中减去反向通量，表示为净通量。结果表示为峰面积。每项实验均使用三份细胞培养物（共12份样品）进行。质谱分析通过三个独立的自动进样1进行μ使用自动取样器采集l个样品，仅当标准样品偏差小于标准化峰值强度的1%时才接受。对于可逆碳交换反应，测定了正向和反向通量，并用于计算产品合成的净通量。
