白藜芦醇治疗可挽救老龄小鼠的神经血管偶联：脑微血管内皮功能改善和NADPH氧化酶下调的作用

测量脑血流对触须刺激的反应和药理学研究。

在治疗期结束时，每组小鼠均用α-氯醛糖（50 mg/kg ip）和氨基甲酸乙酯（750 mg/kg ip）麻醉，气管插管，并进行通气（MousVent G500；Kent Scientific，Torrington，CT）。使用恒温加热垫将直肠温度保持在37°C（Kent Scientific）。

期末CO₂（包括死腔）保持在3.2%到3.7%之间，以使血气值保持在生理范围内（Pa_二氧化碳：37.3±1.9毫米汞柱；帕_氧气：108±3毫米汞柱）。将小鼠固定并放置在立体定向架上（莱卡微系统公司，白水牛林，伊利诺伊州），将头皮和骨膜拉到一边，将颅骨从桶状皮质上取下，轻轻取出硬脑膜。人脑窗上充满了人工脑脊液（成分：119 mM NaCl，26.2 mM NaHCO_三，2.5 mM KCl，1 mM NaH₂人事军官₄，1.3 mM氯化镁₂，10 mM葡萄糖和2.5 mM氯化钙₂pH值7.3，37°C）。对右股动脉进行插管，以测量动脉血压（弗吉尼亚州伯灵顿市生活系统仪器公司）。在整个实验过程中，血压都在生理范围内（mmHg；年轻人：100±2；老年人：103±2.3；老年人+白藜芦醇：108±1.5）。将激光多普勒探头（纽约州伊萨卡市跨声速系统公司）放置在桶皮层上方（脑角后方1-1.5毫米，外侧3-3.5毫米），为了获得最高的CBF响应，以10赫兹的频率从一侧到另一侧刺激右侧胡须1分钟。CBF的变化(n个每组=7）在三个试验中在左桶皮层上方进行评估，间隔5-10分钟。在NADPH氧化酶抑制剂apocynin（3×10⁻⁴mol/l）局部注射于脑表面30分钟(8,57). 在单独的一系列实验中(n个=每组8人），CBF对触须刺激和局部注射乙酰胆碱的反应（ACh；10⁻⁵mol/l）和腺苷（5×10⁻⁵mol/l）在存在和不存在NO合成酶抑制剂的情况下获得N个^ω-硝基-我-精氨酸甲酯(我-名称；10⁻⁴mol/l，20分钟），然后在毒蕈碱ACh受体拮抗剂阿托品（10⁻⁵摩尔/升）。CBF的变化表示为与基线值相比增加的百分比（%）(16). 实验者对动物的治疗一无所知。实验结束时，对动物进行经心灌注并斩首。大脑立即被移除，体感皮层和运动皮层的碎片被分离并冷冻以供后续分析。

评估体内白藜芦醇治疗对氧化应激标记物的影响。

为了表征白藜芦醇治疗对衰老过程中细胞氧化还原稳态的影响，如前所述，使用OxiSelect蛋白硝基酪氨酸ELISA试剂盒（Cell Biolabs）在皮层样品匀浆中评估3-硝基酪氨酸（过亚硝酸根作用的标志物），根据制造商的指南(44).

如前所述，作为氧化应激的另一个标志，根据制造商指南，使用8-异前列腺素EIA试剂盒（Cayman Chemicals）测量大脑皮层样品中的总组织8-异戊烷含量(32). 简言之，使用Precellys 24组织匀浆器和CK28陶瓷珠，以5500 rpm的速度，在含有1 mmol/l EDTA和0.005%BHT的100 mmol/l磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中对样品进行匀浆，共两个20 s的循环。对样品进行离心，并收集上清液。每个样品保留50微升用于蛋白质测定。将等量的15%氢氧化钾添加到每个试管中的剩余样品中，并在40°C下培养样品1小时，以水解酯化为磷脂的8-异前列腺素。通过添加1 mol/l HCl中和样品。然后根据制造商指南，使用8-异前列腺素亲和柱纯化样品，在氮气下干燥，并在分析前用EIA缓冲液重新悬浮。使用EIA缓冲液作为基质，通过8-异前列腺素在0.8到500 pg/ml之间的连续稀释建立标准曲线。通过标准浓度与百分比结合/最大结合（%B/B）的逻辑四参数拟合计算每个样品的浓度₀). 使用Bradford分析测定蛋白质浓度。

定量实时RT-PCR。

使用定量实时RT-PCR技术分析每个实验组小鼠皮层样品中以下基因的mRNA表达：1号,否2,第4个、和Ncf1号机组（p47phox）使用Strategen MX3000平台，如前所述(4) (表1). 简言之，总RNA是用迷你RNA分离试剂盒（加利福尼亚州奥兰治市的Zymo Research）分离出来的，并用上标III RT（Invitrogen）逆转录，如前所述(4). 使用标准血管样品的稀释系列测定扩增效率。使用效率修正的ΔΔCq方法进行定量。参考基因的相对数量Hprt（小时）,伊瓦兹,200万、和Actb公司并基于几何平均值计算归一化因子，用于内部归一化。PCR反应的保真度通过熔融温度分析和2%琼脂糖凝胶上产物的可视化来确定。

体外白藜芦醇处理对培养的脑血管内皮细胞和星形胶质细胞中ROS产生的影响的评估。

为了证实白藜芦醇在参与神经血管偶联的细胞中的体外直接抗氧化作用，我们评估了白藜芦》对培养的原代脑微血管内皮细胞（CMVEC）和星形胶质细胞中细胞ROS生成的影响。最近报道了所用细胞株的建立和表征(45,49).

简而言之，为了建立CMVEC的原代培养，将3个月龄和24个月龄F344xBN雄性大鼠（从国家老龄研究所获得）的大脑无菌取出，在冰冷的PBS中冲洗，并切成≈1 mm的方形。组织在1×PBS冰凉溶液中通过低速离心（50 g，2–3 min）洗涤两次。在37°C的旋转潮湿培养箱中，将切好的组织在胶原酶（800 U/g组织）、透明质酸酶（2.5 U/g组）和弹性蛋白酶（3 U/g组织品）在1ml PBS/100 mg组织中的溶液中消化45分钟。将消化的组织通过100μm的细胞过滤器。单细胞裂解液在70℃离心2分钟克.去除上清液后，将颗粒在添加2.5%胎牛血清（FCS）的冷PBS中洗涤两次，并在300℃下离心悬浮液克在4C温度下保持5分钟。为了制造富含内皮细胞的部分，使用OptiPrep梯度溶液（Axi-Shield，PoC）离心细胞悬浮液。简单地说，将细胞颗粒重新悬浮在HBSS中，并与40%碘克沙醇彻底混合[最终浓度：17%（wt/vol）碘克沙诺溶液；ρ=1.096 g/ml]。在顶部分层两毫升HBSS，并在400℃下离心克在20°C下保持15分钟。收集了HBSS和17%碘xanol层之间界面上的内皮细胞。将富含内皮细胞的部分与抗CD31/PE（BD Biosciences，San Jose，CA）和抗MCAM/FITC（BD Biosciences）在4°C的黑暗中孵育30分钟。用MACS缓冲液（Milltenyi Biotech，Cambridge，MA）清洗细胞两次后，在室温下使用标记有抗PE磁珠的二级抗体的抗FITC磁珠15分钟。根据制造商指南（Milltenyi Biotech），使用MACS LD磁性分离柱通过磁性分离收集内皮细胞。内皮部分在内皮生长培养基（Cell Application，加州圣地亚哥）中的纤连蛋白涂层板上培养10天。内皮细胞通过流式细胞术进行表型特征分析（GUAVA 8HT；Merck Millipore，Billerica，MA）。简言之，使用了五种不同内皮特异性标记物的抗体（抗CD31-PE、抗红细胞生成素受体-APC、抗血管内皮生长因子R2-PerCP、抗ICAM-荧光素和抗CD146-PE），并将同种特异性抗体标记的组分作为阴性对照。流式细胞术分析表明，在第三个免疫磁选周期后，所得细胞群中几乎没有CD31、CD146、EpoR和VEGFR2细胞。所有抗体均购自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州）。为了评估白藜芦醇对内皮ROS生成的直接影响，在体外用白藜芦醇（10μmol/l，持续24 h）处理来自年轻和老年大鼠的初级CMVEC。

星形胶质细胞的原代培养来自出生后第2-5天遵循上述方法的F344幼鼠(2). 简单地说，皮层组织经酶解和机械消化，再悬浮在生长介质中[DMEM含有2%NuSerum、10%胎牛血清、青霉素（10 U/ml）、链霉素（10μg/ml）和我-谷氨酰胺（29.2μg/ml）]，密度为250万个细胞/ml，接种在50μg/ml多聚物上-天-赖氨酸涂层T75骨架。每3-4天补充一次新鲜生长培养基。通过免疫平移去除少突胶质细胞和小胶质细胞第10天然后将星形胶质细胞胰蛋白酶化，传代到96周的平板中，并在新鲜的生长介质中生长。培养结果为～93%的GFAP阳性星形胶质细胞(2). 为了评估白藜芦醇对星形胶质细胞产生ROS的直接影响，将培养中的原代星形胶质细胞与白藜芦醇（10μmol/l）孵育24 h，然后用10 ng/ml TNF-α、10 ng/mlIL-1β和10 ng/ml IL-6处理激活（4 h）。

实验期结束后，使用细胞渗透性氧化荧光指示剂染料CM-H评估培养的CMVEC和星形胶质细胞中的过氧化物生成₂DCFDA[5（和6）-氯甲基-2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸乙酰酯；生命科技，加利福尼亚州卡尔斯巴德]，如前所述(7,48). 简言之，在处理期之后，将细胞与CM-H一起孵育₂DCFDA（10μM，37°C，30分钟）。CM-H公司₂如前所述，DCFDA荧光通过流式细胞术进行评估(7,48)使用Guava easyCyte 8HT流量计（Millipore）。

白藜芦醇治疗可逆转衰老诱导的ACh诱导的NO介导的内皮反应损伤。

局部应用内皮依赖性血管扩张剂ACh（10⁻⁵mol/l）导致幼鼠大脑皮层CBF显著增加(图3A类). 在老龄小鼠中，ACh诱导的CBF增加显著减弱（～50%）(图3A类). 用白藜芦醇治疗老年小鼠可显著改善ACh诱导的CBF反应，将反应恢复到年轻小鼠的水平(图3A类). 据报道，ACh的给药通过刺激内皮NO生成和激活神经元毒蕈碱型ACh受体来影响CBF(14,18,55). 为了评估ACh诱导的反应的内皮依赖性成分，我-已应用名称。我-NAME在幼年动物和经白藜芦醇治疗的老年小鼠中均显著抑制ACh诱导的CBF反应，而在未经治疗的老年鼠中没有显著作用(图3,​,A类A类和​和B类).B类). 给药后我-NAME、ACh诱导的CBF反应在年轻、老年和白藜芦醇治疗的老年小鼠中没有差异(图3,​,A类A类和​和B类).B类). 联合管理我-NAME和毒蕈碱ACh受体拮抗剂阿托品（5×10⁻⁵mol/l）消除了各实验组剩余的ACh诱导的CBF反应（数据未显示）。腺苷（主要作用于血管平滑肌细胞）给药引起的CBF反应在实验组之间没有显著差异，也没有受到给药的显著影响我-姓名或我-NAME加阿托品(图3,A–C).

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图3。

白藜芦醇治疗可挽救老年小鼠中乙酰胆碱诱导的内皮细胞一氧化氮介导的CBF反应。CBF的变化是对内皮依赖性扩张剂乙酰胆碱的反应(A类)和非内皮依赖性扩张剂腺苷(C类)在NO合成酶抑制剂缺失和存在的情况下我-NAME位于对照组和白藜芦醇治疗的年轻（3月龄）和老年（24月龄）小鼠的大脑皮层上方。B类:我-乙酰胆碱诱导CBF反应的NAME敏感成分。数据为平均值±SE(n个=每组7–8）*P（P）与年轻人相比<0.05；^#P（P）与老年人相比<0.05；^&P（P）<0.05 vs.老龄+白藜芦醇。

NADPH氧化酶抑制剂apocynin逆转衰老小鼠的神经血管功能障碍。

用NADPH氧化酶抑制剂apocynin治疗老年动物后，CBF反应显著增加(图4A类)支持NADPH氧化酶增加ROS生成在阿金诱导的脑微血管功能障碍中发挥中心作用的概念。

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图4。

白藜芦醇治疗可减轻老龄小鼠的氧化应激。A类：给药NADPH氧化酶抑制剂apocynin可改善老年（24个月龄）小鼠触须刺激引起的CBF反应。显示年轻（3月龄）小鼠的CBF反应进行比较。数据为平均值±SE(n个=每组6人）*P（P）与年轻人相比<0.05；^#P（P）与老年对照组相比，<0.05。B类：皮质3-硝基酪氨酸含量和8-异丙肾上腺素水平(C类)在年轻小鼠、白藜芦醇治疗的年轻小鼠、老年小鼠和白藜芦素治疗的老年小鼠中(n个=每组6人）。数据为平均值±SE*P（P）与年轻对照组相比<0.05；^#P（P）与老年对照组相比，<0.05。

白藜芦醇治疗可减轻衰老引起的氧化应激。

老龄小鼠大脑皮层3-硝基酪氨酸含量显著升高(图4B类)与老龄大脑中氧化/亚硝化应激增加相一致(6,23). 白藜芦醇治疗显著降低衰老小鼠皮层中3-硝基酪氨酸的含量(图4B类)以及8-异前列腺素的水平。这些结果支持了以下观点：白藜芦醇的抗氧化作用在其衰老过程中的微血管保护作用中起着核心作用。

白藜芦醇体外治疗可减轻衰老微血管内皮细胞和活化星形胶质细胞的氧化应激。

为了证实白藜芦醇的体外抗氧化作用，我们使用DCF荧光法评估了白藜芦》对来自老龄动物的培养CMVEC细胞ROS生成的影响。我们发现，与来自幼畜的CMVEC相比，来自老龄动物的CMVECs的ROS生成量显著增加(图5,​,A类A类和​和B类).B类). 白藜芦醇治疗显著降低了老年CMVECs中ROS的产生，消除了两个年龄组之间的差异(图5B类). 衰老也与星形胶质细胞的激活有关(36)和活性星形胶质细胞ROS生成增加(37)也可能影响神经血管耦合的效率。为了确定白藜芦醇是否也能影响星形胶质细胞ROS的产生，用白藜芦醇处理活化培养的星形胶质细胞。我们发现，白藜芦醇治疗显著降低了细胞因子刺激的星形胶质细胞中ROS的生成(图5C类).

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图5。

白藜芦醇降低培养的脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞的氧化应激。A类：具有代表性的数字显示了来自年轻和老年F344xBN大鼠的初级脑微血管内皮细胞（CMVEC）中DCF荧光的流式细胞术分析[指示活性氧（ROS）生成]。所示为白藜芦醇处理（10μmol/l，持续24小时）对老化CMVEC产生ROS的影响。还显示了适当的控制（未染色的单元格）。B类：白藜芦醇（10μmol/l，24小时）可减弱老化CMVEC中增加的ROS生成。数据为平均值±SE(n个=每组8人）*P（P）与年轻对照组相比<0.05；^#P（P）与老年对照组相比，<0.05。C类：白藜芦醇（10μmol/l，24小时）可减弱活化星形胶质细胞中增加的ROS生成。用10 ng/ml TNF-α、10 ng/ml IL-1β和10 ng/mlIL-6处理培养的原代星形胶质细胞（4 h），并进行和不进行白藜芦醇预处理（10μmol/l，24 h）。用流式细胞术的DCF荧光法测定细胞活性氧的产生。数据为平均值±SE(n个=每组8人）*P（P）与对照组相比<0.05；^#P（P）与刺激细胞（无白藜芦醇）相比，<0.05。

白藜芦醇治疗可减弱衰老小鼠脑中NADPH氧化酶的表达。

NADPH氧化酶是脑血管系统中ROS的重要来源，其表达和活性的增加有助于神经-血管耦合受损(图4A类) (28). 我们发现，在老年小鼠皮层中，NADPH氧化酶亚基的mRNA表达1号,否2、和第4个与幼鼠相比上调(图6,A–C)，扩展了最近的发现(28). 用白藜芦醇治疗老年小鼠导致这些NADPH氧化酶亚基的显著下调，使其表达正常化至对照水平(图6,A–C). 的表达式Ncf1老年人的大脑也有增加的趋势，白藜芦醇治疗也有降低调节的趋势，尽管这些变化没有达到统计学意义(图6D类).

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图6。

白藜芦醇治疗导致衰老小鼠脑中NADPH氧化酶表达下调。白藜芦醇治疗（200 mg/kg po，持续10天）对NADPH氧化酶亚基mRNA表达的影响1号(A类),否2(B类),第4个(C类)、和Ncf1号机组（第47页^{凤凰（phox）};D类)在年轻和老年小鼠的大脑皮层中。数据为平均值±SE(n个=每组6人）*P（P）与年轻对照组相比<0.05；^#P（P）与老年对照组相比，<0.05。