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致癌物。作者手稿；PMC 2014年11月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
致癌物。2014年5月1日；33(18): 2307–2316.
2013年5月20日在线发布。 数字对象标识：2018年10月10日/2017年1月1日
预防性维修识别码：1997年3月17日
NIHMSID公司：NIHMS550125标准
PMID：23686305

乳腺癌细胞上皮-间质转化（EMT）的诱导是钙信号依赖性的

费利西蒂·M·戴维斯，1,一 伊曼·阿齐米，1 理查德·法维尔，2 阿米莉亚·A·彼得斯，1 基斯·贾林，三 詹姆斯·普特尼，4 杰弗里·古德希尔，2,5 埃里克·汤普森，6,7 莎拉·罗伯特·汤姆森，1和格雷戈里·蒙特斯1,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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摘要

来自肿瘤微环境的信号通过上皮-间充质转化（EMT）触发癌细胞采用侵袭性表型。对于作为细胞表面受体和核转录因子之间的细胞溶质桥梁以诱导EMT的关键信号转导途径，人们知之甚少。更好地了解这些早期EMT事件可以确定控制转移的潜在靶点。在EMT诱导过程中尚未探索的一种快速细胞内信号通路是钙。在这里，我们表明，用于诱导EMT的刺激会导致人类乳腺癌细胞胞浆钙水平的短暂增加。细胞内钙螯合物对钙信号的衰减显著降低了表皮生长因子（EGF）和低氧诱导的EMT。细胞内钙螯合还抑制EGF诱导的信号转导子和转录激活子3（STAT3）的激活，同时保留其他信号转导途径，如Akt和细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）磷酸化。为了确定可能调节乳腺癌细胞EMT诱导的钙通透性通道，我们进行了基于siRNA的靶向筛选。我们发现瞬时受体电位-美拉司他丁样7（TRPM7）通道表达调节EGF诱导的STAT3磷酸化和EMT标记波形蛋白的表达。虽然细胞内钙螯合作用几乎完全阻断了许多EMT标记物的诱导，包括波形蛋白、Twist和N-cadherin，但TRPM7沉默的效果对波形蛋白蛋白表达和STAT3磷酸化具有特异性。这些结果表明，TRPM7是乳腺癌细胞EMT的部分调节因子，其他钙离子通道也参与钙依赖性EMT的诱导。总之，这项工作确立了细胞内钙信号在人类乳腺癌细胞EMT诱导中的重要作用。因此，调控钙信号通路控制癌细胞EMT诱导可能是预防转移的重要治疗策略。

关键词：上皮-间充质转化（EMT）、钙、波形蛋白、STAT3、信号转导、乳腺癌

简介

上皮-间充质转化（EMT）将上皮细胞转化为间充质样表型，并与细胞接触的丧失、III型中间丝蛋白波形蛋白的产生以及细胞迁移和侵袭的增加有关(1). 这种表型转换在胚胎发育和包括实体瘤从原发部位转移到次级器官在内的病理过程中非常重要(2，三). 除了经典EMT标记物（包括蜗牛、Twist、波形蛋白和N-钙粘蛋白）的表达增加外，乳腺癌细胞中的EMT还与逃避凋亡和衰老以及抗失巢凋亡有关(三，4). EMT标记物的表达是临床预后较差的基底型和克劳丁低乳腺癌亚型的特征(5——8)与乳腺癌干细胞活性有关(9). EMT标记物也在激素或细胞毒治疗后存活的癌细胞中富集(10).

许多研究调查了EMT导致的分子和细胞变化，以及这些变化如何促进癌细胞的传播和转移(9，11). 相对而言，对控制细胞凋亡的关键信号转导途径知之甚少归纳EMT的(12). 在本研究中，我们使用EGF和缺氧诱导MDA-MB-468人乳腺癌细胞EMT。表皮生长因子介导的表皮生长因子受体激活可快速瞬时磷酸化多个下游信号蛋白，STAT3-Twist信号通路与表皮生长因子诱导的这些细胞的EMT有关(13). 调节上皮-间充质可塑性的特异性信号通路的治疗靶向可以通过抑制原发和/或继发位点的细胞转化来为预防癌症转移提供一种新的方法。识别对EMT诱导重要的早期信号事件可能有助于开发临床有用的抗转移治疗，因为靶向已被确定为EMT调节因子的转录因子存在固有困难(14).

钙信号是一种非常适合将肿瘤微环境中的信号快速转换为细胞反应的机制(15——17). 然而，大多数关于钙信号在癌症中作用的研究都集中在对原发性肿瘤生长重要的过程（即细胞增殖和凋亡）。例如，对临床上皮性卵巢癌样本中升高的钙渗透性TRPC3通道的抑制可减少SKOV3卵巢癌细胞的增殖(18). 钙信号在癌细胞迁移和侵袭的背景下也很重要（参考文献19). 前列腺癌细胞中钙依赖性迁移过程的例子很明显，非选择性阳离子通道TRPV2的沉默抑制了细胞迁移，这种效应可能归因于基础细胞溶质钙浓度的降低(20). 在侵袭性MDA-MB-231乳腺癌细胞中，抑制储存操作的钙进入或沉默钙内流途径的成分（ORAI1和STIM1）可抑制细胞迁移，部分通过调节局部粘附周转(21). 我们之前已经描述了非刺激性和储存性钙进入的变化，这些变化发生在结果EGF诱导的EMT(22)和其他研究表明，乳腺癌细胞中与转化生长因子-β（TGFβ）诱导的EMT相关的存储操作钙进入增强(23). 在这些研究中，我们试图确定钙信号在归纳EMT在乳腺癌细胞中的表达，并确定所涉及的机制。

结果

刮伤引发乳腺癌细胞内钙波

机械损伤促进迁移细胞表型并诱导乳腺上皮细胞中的间充质标记物波形蛋白(24). 为了评估受伤后钙信号可能发生的快速变化，我们刮取了一层融合的MDA-MB-468人乳腺癌细胞单层。细胞内游离钙（[Ca2+]中青旅)在抓痕附近的细胞中观察到从伤口部位发出的细胞内钙波的传播(图1A和电影S1).

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已知可诱导EMT的刺激物会导致细胞内钙的瞬时增加

一个)假彩色（强度）表示钙波通过装有Fluo-4 AM钙指示剂的MDA-MB-468细胞汇合单层的传播。白色箭头表示伤口边缘。比例尺，75µm。来自三个独立实验的电影代表。B类)显示细胞激活时间（T）的所有电影所有帧的散点图（f）)划痕诱导钙波传播过程中与伤口边缘的距离（D）；A表示标度系数，n表示幂律指数，用于估计激活模式。1的n（红色）表示钙波传播更类似于细胞间通讯，而2的n（蓝色）表示可扩散细胞外因子的释放激活钙波传播。绿线表示最适合划痕诱导钙波传播的线。另请参见图S1和电影S1.C类)MDA-MB-468细胞在用EGF刺激前（24小时）用条件培养基（受伤单层的上清液）培养30分钟，并用免疫荧光法评估波形蛋白的表达。采用双向方差分析（ANOVA）和Bonferroni的多重比较后测试来评估条件培养基在每个EGF浓度下的重要性。D类)平均相对[Ca2+]中青旅瞬变，E类)相对峰值[Ca2+]细胞色素氧化酶响应和如果)ATP（100µM）、胰蛋白酶（30 nM）或EGF（50 ng/mL）刺激的细胞波形蛋白阳性。条形图显示了来自三个独立实验的九口单井的平均值±S.D。使用单因素方差分析和Bonferroni的多重比较对检验后的显著性进行评估*P（P）< 0.05.

通过拟合细胞激活时间（T（f）)距缠绕边缘（D）的距离T（f）=A*Dn个，其中A和n是常数(图1B和图S1). n=1表示以恒定速度1/a传播，而n=2表示扩散常数为1/a的纯扩散过程。n的最佳拟合值为1.50（R2=0.82），提示机械损伤后钙信号的混合模型，可能涉及通过缝隙连接和IP的细胞间通信三受体介导的波传播，过渡到钙波传播机制，可能涉及扩散性细胞外钙动员剂的释放。条件培养基（从受伤后立即收集的划痕单层）促进EGF介导的波形蛋白诱导的能力支持了钙波传播模型，该模型涉及细胞外因子的释放(图1C).

EGF刺激在MDA-MB-468乳腺癌细胞中产生细胞内钙信号并诱导EMT

EGF是MDA-MB-468细胞中一种特性良好的EMT诱导剂(12，13，25)以及已知在肿瘤微环境中释放的因子(26). EGF增加[Ca的能力2+]中青旅因此，对MDA-MB-468乳腺癌细胞进行了评估。EGF诱导[Ca瞬时增加2+]中青旅(图1D和E). 用胰蛋白酶激活蛋白酶激活受体2（PAR2），用ATP激活嘌呤能受体也增加[Ca2+]中青旅(图1D和E). 然后我们比较了这些药物增加[Ca的能力2+]中青旅通过波形蛋白蛋白表达的增加来评估其诱导EMT的能力。PAR2和嘌呤能受体激活，尽管[Ca显著升高2+]中青旅，未能在MDA-MB-468细胞中诱导EMT(图1F). 这些发现与两种情况中的一种是一致的，即EGF诱导的EMT独立于钙信号或其性质（例如，空间和时间方面(27))EGF诱导的钙信号在EMT诱导的调节中至关重要。

细胞内钙螯合抑制EGF诱导的EMT

为了直接探讨钙信号在EMT诱导中的作用，用细胞内钙螯合剂BAPTA-AM对MDA-MB-468细胞进行预处理，并在细胞内[Ca2+]中青旅被评估。细胞内钙螯合作用观察到EGF诱导的波形蛋白表达显著降低(图2A). EGF对波形蛋白的诱导也被另一种细胞内钙螯合剂EGTA-AM抑制(图2B).

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钙调节EGF诱导的波形蛋白表达

EGF诱导的乳腺癌细胞波形蛋白表达的代表性免疫印迹和密度分析（归一化为β-肌动蛋白）一个)BAPTA-AM或B类)EGTA-AM可以阻止细胞内钙水平的增加。条形图显示了三个独立实验的平均值±S.D。使用双向方差分析和Bonferroni的多重比较后测试评估钙螯合对波形蛋白表达的影响*P（P）< 0.05.

细胞内钙螯合（BAPTA-AM）也阻止EGF诱导的许多EMT相关基因mRNA水平的增加，包括波形蛋白(图3A和B)，扭转(图3C和D)和N-钙粘蛋白(图3E和F). BAPTA-AM增加了基础和EGF诱导的蜗牛mRNA水平(图3G和H)表明钙信号可能对乳腺癌细胞中的EMT相关转录因子进行差异调节。细胞内钙螯合也阻止了EGF介导的CD44/CD24比率的增加(图3I和J). 用EGF治疗6或24小时后，这些效果明显。

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钙调节EGF诱导EMT相关基因的诱导

利用细胞内钙螯合（BAPTA-AM）分析MDA-MB-468乳腺癌细胞中EMT相关基因（vimentin、Twist、N-cadherin、Snail和CD44/CD24）的mRNA水平。用EGF处理细胞6小时(A、 C、E、G和I)或24小时(B、 D、F、H和J型)诱发EMT。条形图显示了来自三个独立实验的九口单井的平均值±S.D。使用双向方差分析和Bonferroni多重比较后测试评估BAPTA-AM对基因表达的影响*P（P）< 0.05.

此外，BAPTA-AM预处理通过EGF诱导的EMT强烈抑制了葡萄样细胞向纺锤状细胞的转化(图S2). 然而，BAPTA-AM似乎无法阻止EGF治疗相关的细胞-细胞粘附的初始丧失(图S2). 总的来说，这些结果证明了钙的关键作用2+EGF诱导的EMT中的信号传导。

细胞内钙螯合抑制低氧介导的EMT

为了评估钙信号是否在其他EMT诱导模型中起关键作用，我们评估了细胞内钙螯合对乳腺癌细胞低氧介导的EMT的影响。在该模型中，细胞内钙螯合也抑制了低氧介导的波形蛋白和N-钙粘蛋白mRNA水平以及CD44/CD24比率的增加(图4A-C). 与EGF模型一致，BAPTA-AM显著增加了这些细胞中蜗牛mRNA的水平(图4D). 与EGF诱导的EMT不同，Twist mRNA水平不受细胞内钙螯合作用的影响(图4E). 这些发现表明低氧诱导的EMT中的一些元素也被细胞内钙螯合物阻断。

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钙调节低氧介导的EMT相关基因的诱导

mRNA水平评估一个)波形蛋白，B类)N-钙粘蛋白，C类)CD44/CD24，D类)蜗牛和E类)常氧或缺氧扭转（1%O2)在MDA-MB-468乳腺癌细胞中使用细胞内钙螯合物（BAPTA-AM）。条形图显示了来自三个独立实验的九个单独井的平均值±S.D。使用双向方差分析和Bonferroni多重比较后测试评估BAPTA-AM对基因表达的影响*P（P）< 0.05.

STAT3激活依赖于钙信号

为了确定钙依赖性调节EMT诱导的分子途径，我们评估了几种EGF介导的信号事件(13)在有无[Ca的情况下2+]中青旅螯合作用。在用BAPTA-AM预处理的细胞中，未观察到EGF诱导的EGFR（Tyr1173）磷酸化的显著变化(图5A-C). 由于这种早期EGF信号事件在细胞内钙螯合的细胞中是完整的，因此BAPTA-AM的抑制作用必须来自EGFR下游的钙依赖过程。

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细胞内钙螯合对EGFR磷酸化和下游信号转导通路激活的影响

EGFR（Tyr1173）的磷酸化(A–C)，ERK1/2（Thr202/Tyr204）(D–F型)，Akt（Ser473）(G–I型)和STAT3（Tyr705）(J–L型)通过与50 ng/mL EGF孵育20或60 min，在细胞内钙螯合（BAPTA-AM）的细胞中进行评估。条形图显示了三个独立实验的平均值±S.D。使用双向方差分析和Bonferroni的多重比较后测试评估钙螯合对蛋白质磷酸化的影响*P（P）< 0.05.

细胞内钙螯合明显增加了EGF诱导的ERK1/2磷酸化（Thr202/Tyr204）(图5D–F). 先前研究表明，细胞内基础游离钙水平可以调节EGF诱导的ERK1/2磷酸化的程度和持续时间(28)，一种可能由钙依赖性调节有丝分裂原活化蛋白激酶磷酸酶来解释的效应(29). 然后，我们评估了Akt和STAT3的钙依赖性，这两个关键的信号转导子也在EGFR下游被激活。由于EGF刺激，钙螯合未能改变Akt的磷酸化程度（Ser473）(图5G–I). 然而，EGF的STAT3磷酸化（Tyr705）被细胞内钙螯合物显著抑制(图5J–L). 这种影响在早期（20分钟）最为显著，此时90%以上的STAT3磷酸化被抑制。这些发现表明，虽然EGF信号的许多元素保持完整，但细胞内钙的螯合作用通过STAT3巧妙地抑制了癌细胞对EGF进行EMT反应的能力，STAT3是这一过程中EMT的驱动因素(13)和其他型号(30).

siRNA介导的TRPM7沉默抑制EGF诱导的波形蛋白表达

为了探索与EMT诱导相关的假定钙通道的特性，我们筛选了一组钙内流通道，以了解其调节EGF诱导的波形蛋白表达的能力。在这一靶向免疫荧光筛选中评估的通道此前已被证明调节上皮细胞的迁移或生长因子介导的过程(21，31——34)包括钙释放激活电流（CRAC）通道孔亚单位ORAI1、瞬时受体电位（TRP）香草醛样3型（TRPV3）、典型型（TRPC）4、5、6和类美拉司他丁（TRPM）6和7通道。在我们的免疫荧光筛选中，用TRPM7 siRNA检测到EGF诱导的波形蛋白诱导显著降低(图6A). 使用两种不同类型的siRNA（Dharmacon ON-TARGET加和siGENOME，每一个由四个合理设计的siRNA组成的不同池；图6B-F)，并使用TRPM7通道抑制剂NS8593(35) (图6G–H). 然而，TRPM7沉默并不影响波形蛋白mRNA水平(图S3)表明其主要作用于蛋白质水平。

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siRNA沉默和药物抑制TRPM7抑制EGF诱导的波形蛋白蛋白表达

一个)使用Dharmacon ON-TARGET沉默TRPV3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPM6、TRPM 7和ORAI1钙通透性通道加用EGF刺激siRNA和细胞（10 ng/mL，24 h）。用定量免疫荧光检测波形蛋白蛋白表达（积分强度）。散点图显示了两个独立实验中六口井相对于非靶控（NT）控制的折叠变化。转染后TRPM7 mRNA残留百分比分析B类)Dharmacon目标加（OTP）TRPM7 siRNA或C类)Dharmacon siGENOME TRPM7 siRNA。条形图显示了两个独立实验中六个孔的平均值±S.D。使用学生的t检验评估统计显著性。D类)TRPM7对EGF诱导的波形蛋白表达的代表性免疫印迹确认调节，以及对转染细胞中波形蛋白（归一化为β-肌动蛋白）表达的密度分析E类)OTP TRPM7 siRNA或如果)siGENOME TRPM7 siRNA。图表显示了三个独立实验的平均值±S.D。使用双向方差分析和Bonferroni的多重比较后测试评估TRPM7基因沉默对波形蛋白表达的影响。G公司)代表性免疫印迹显示增加TRPM7抑制剂NS8593浓度对EGF诱导的波形蛋白表达和H（H）)三个独立实验的密度分析（归一化为β-actin）。在EGF治疗之前用NS8593处理细胞24小时，并且在EGF治疗期间维持NS8593。使用单因素方差分析和Bonferroni的多重比较后测试评估统计显著性*P（P）< 0.05.

鉴于抑制TRPM7表达（siRNA）或功能（NS8593）对EGF诱导的波形蛋白蛋白表达的影响，我们研究了TRPM7通道的表达是否影响对EGF的整体胞浆钙反应。在含有TRPM7 siRNA的MDA-MB-468细胞中，与非靶向siRNA对照组相比，细胞溶质钙对EGF刺激的反应没有显著差异(图S4A–C)，表明TRPM7对波形蛋白诱导的调节独立于EGF介导的整体细胞溶质钙水平的增加。此外，我们使用稳定表达质膜TRPM7通道但不表达EGFR的N1E-115细胞评估EGF是否直接激活TRPM7通路（独立于EGFR）(36). EGF刺激并没有增加这些细胞的胞浆钙(图S4D)，证明EGF不直接结合并激活TRPM7通道，与其他配体门控TRP通道（例如TRPV1）可能发生的情况一样(37)).

TRPM7沉默减弱EGF诱导的STAT3磷酸化

为了进一步阐明TRPM7在EGF诱导的EMT中的作用，我们评估了TRPM7沉默细胞中下游信号转导通路的激活。与钙螯合实验一致，EGFR的磷酸化(图7A)和Akt(图7B)未被TRPM7沉默所改变。然而，与钙螯合诱导相比，转染TRPM7 siRNA的乳腺癌细胞ERK1/2磷酸化显著降低(图7C). ERK1/2活化的这种明显减少可能归因于随着TRPM7持续沉默ERK1/2总丰度的增加(图7C).

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TRPM7沉默改变特定EGF信号通路

磷酸化一个)EGFR（Tyr1173），B类)Akt（Ser473），C类)ERK1/2（Thr202/Tyr204），以及D类)用非靶向（NT）siRNA或TRPM7 OTP siRNA转染的MDA-MB-468乳腺癌细胞经EGF刺激（50 ng/mL，20 min）后的STAT3（Tyr705）。图中显示了三个独立实验的平均值±S.D。使用双向方差分析和Bonferroni的多重比较后测试评估TRPM7基因沉默对蛋白质磷酸化的影响*P（P）< 0.05.

由于细胞内钙螯合作用显著抑制STAT3磷酸化(图5J–L)接下来，我们评估了TRPM7沉默对EGF诱导的STAT3激活的影响。与钙螯合实验一致，EGF诱导的STAT3磷酸化显著降低是TRPM7沉默MDA-MB-468乳腺癌细胞的结果(图7D). 因此，虽然TRPM7调节EGF诱导的EMT的某些元素（即波形蛋白诱导和STAT3磷酸化），但EGF诱导其他EMT标记物（即Twist和N-cadherin）的mRNA水平增加(图S3)和EGF诱导的细胞形态变化(图S5)，不受TRPM7调节的影响，表明钙的其他转运蛋白可能参与钙螯合所证明的钙依赖性EMT诱导的其他方面。

讨论

钙对许多生理和病理过程都很重要，从神经传递、心脏收缩到癌症进展。现在人们普遍认识到钙信号的复杂性及其对时间和空间特征的依赖性，以此来定义细胞反应(27). 这项工作首次描述了通过细胞内钙螯合作用消除人类乳腺癌细胞中EMT诱导的机制。

[Ca的瞬时增加2+]中青旅创伤后正常人尿路上皮细胞的特征是，伤口边缘的细胞表现出持续升高的[Ca2+]中青旅(38). 我们的研究表明2+]中青旅在乳腺癌细胞损伤后也可以观察到。机械损伤在MDA-MB-468乳腺癌细胞中产生细胞内钙波，通过释放可扩散的细胞外钙动员剂和细胞间通讯传播。刮伤单层的条件培养基增加了EGF诱导的MDA-MB-468细胞中波形蛋白的表达。创伤样效应和EGF（或EGFR的相关配体）的局部升高，两者都可能发生在原发性肿瘤的边缘体内(26，39)，可提高EMT的效率和肿瘤转移。在肠上皮细胞中，TGFβ和EGF协同作用诱导EMT样表型，局部和协调信号事件的重要性显而易见(40).

EGF诱导的EMT是钙信号依赖性的，钙信号的性质至关重要。在MDA-MB-468细胞中，EGF产生[Ca2+]中青旅24小时后，波形蛋白蛋白表达增加。用其他钙动员剂（包括ATP和胰蛋白酶）刺激未能诱导波形蛋白，尽管产生了大量细胞内游离钙水平的增加。胰蛋白酶和ATP处理后EMT样表型的缺失表明，钙依赖性EMT可能以依赖于信号的空间和时间方面的方式进行调节，与全球[Ca]水平依赖性增加不同2+]中青旅.

钙信号在EGF诱导的EMT中的直接作用通过细胞内钙螯合阻止波形蛋白蛋白表达增加和几个EMT相关基因（包括波形蛋白、Twist和N-cadherin）mRNA水平的增加来证明。与其他EMT标记物相比，通过细胞内钙螯合观察到蜗牛mRNA显著增加。这些发现表明钙信号对EMT相关转录因子有不同的调节作用。然而，BAPTA-AM对EGF诱导的EMT的总体抑制作用表明，蜗牛不是参与EGF诱导MDA-MB-468乳腺癌细胞EMT的关键转录因子，如前所述(13). EMT标记物波形蛋白和N-钙粘蛋白的诱导，以及CD44/24比率的变化，在低氧诱导的EMT中也是钙依赖性的，这表明钙信号可能在导致EMT的多种途径中被利用。

钙渗透性离子通道TRPM7作为EMT诱导的部分调节器的鉴定表明，除了参与控制细胞定向迁移的重要过程外(31)，TRPM7还参与通过EMT诱导更多迁移和侵袭表型。最近支持这一发现的工作描述了TRPM7水平与人类乳腺癌转移形成之间的关系(34). 鉴于TRPM7沉默并没有改变对EGF的整体细胞溶质钙反应，需要进一步研究以确定TRPM7对EGF诱导的波形蛋白表达和STAT3磷酸化的影响是否与其钙转运能力有关（即局部钙信号），或者这种表型是否可归因于细胞内镁稳态或TRPM7激酶活性的失调(41). 虽然我们的结果表明EGF并不直接结合并激活TRPM7通道，但EGF可以通过EGFR-磷脂酶C（PLC）信号通路，通过TRPM7间接激活MDA-MB-468乳腺癌细胞中的钙内流，如之前所示的其他PLC-偶联受体激动剂，包括缓激肽和凝血酶(36). TRPM7沉默不能抑制Ca抑制的EMT的所有方面2+螯合作用（BAPTA-AM）强烈表明钙的其他转运蛋白参与钙依赖性EMT诱导的特定方面。

通过缓冲[Ca增加减少EGF诱导的STAT3磷酸化2+]中青旅或（部分）通过沉默TRPM7，进一步证明STAT3在MDA-MB-468乳腺癌细胞EMT诱导中的重要性(13). 生长因子介导的大鼠心肌细胞中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）对STAT3的酪氨酸磷酸化是钙依赖性的(42). 此外，细胞粘附介导的NIH3T3细胞中STAT3活性通过细胞外钙的螯合作用降低（破坏细胞粘附）(43). 据我们所知，这项工作首次报道了EGF介导的乳腺癌细胞中STAT3活性受细胞内游离钙水平的高度调节，并将STAT3添加到已知钙依赖性转录因子列表中，其中包括活化T细胞的核因子（NFAT）和核因子κB，这两者在癌症进展的关键方面都很重要(44，45).

总之，我们已经确定了钙信号在多种刺激诱导人类乳腺癌细胞EMT中的核心作用，并表明这种钙信号的性质至关重要。因此，除了调节转移的重要过程外，如细胞迁移、侵袭和凋亡抵抗(19)钙信号也调节一些刺激诱导更具侵袭性表型的能力。我们还表明，EGF诱导的STAT3磷酸化高度依赖钙，部分受钙渗透离子通道TRPM7调节。因此，靶向调节EMT诱导的钙依赖性途径可能为对抗癌症转移提供新的治疗方法。

材料和方法

细胞培养

如前所述，MDA-MB-468细胞保存在Dulbecco改良Eagle’s培养基中的加湿培养箱（37°C）中，培养基中补充有10%的胎牛血清（FCS）、4 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素(46). MDA-MB-468细胞通常被检测为支原体感染阴性（MycoAlert；瑞士巴塞尔Lonza），昆士兰医学研究所使用StemElite ID分析试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊Promega）对MDA-MB-4 68细胞系进行STR分析。如前所述培养N1E-115/TRPM7细胞(47). 为了用EGF诱导EMT，MDA-MB-468细胞被血清饥饿（0.5%FCS，24小时）并用50 ng/mL EGF处理（E9644；Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA）(13)，除非另有规定。对于低氧诱导的EMT，细胞暴露于低氧损伤（1%O2)六个小时。然后将细胞恢复到正常培养条件下6小时，并如下所述分离RNA(48，49).

为了评估条件培养基增强EGF诱导的EMT的能力，将MDA-MB-468细胞在血清中饥饿24小时。用移液管尖端刮除细胞单层(50)媒体被吸引了。在用EGF诱导EMT之前，用条件培养基或对照培养基（来自未刮伤孔的培养基）培养细胞30分钟。为了评估钙动员药物诱导波形蛋白的能力，在免疫荧光之前，对细胞进行血清饥饿处理，并用EGF（50 ng/mL）、胰蛋白酶（30 nM）或ATP（100µM）处理24小时。对于涉及细胞内钙螯合的实验，在用EGF刺激之前，细胞在37°C下加载100µM BAPTA-AM（B6769；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）或EGTA-AM（E1219）1小时(51).

细胞内钙的测量

使用荧光成像板阅读器（FLIPR）测量MDA-MB-468细胞对EGF的反应中的细胞内钙TETRA公司; Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA）使用BD PBX无灰CA2+检测试剂盒（BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖）(52). 在37°C下，在含有5%（v/v）PBX信号增强剂和500µM丙磺舒（Sigma-Aldrich）生理盐水（PSS；10 mM HEPES，5.9 mM KCl，1.4 mM MgCl）的溶液中用2µM Fluo-4 AM（Invitrogen）将细胞负载60分钟2，1.2 mM NaH2人事军官4，5 mM NaHCO三，140 mM氯化钠，11.5 mM葡萄糖，1.8 mM氯化钙2) (22). 在470–495 nm的激发强度和515–575 nm的发射滤波器下进行细胞内钙测量。荧光值归一化为起始荧光，并表示为“相对[Ca2+]中青旅’. N1E-115/TRPM7细胞中的假比例钙记录(36)在HEPES缓冲盐水（HBS；10 mM HEPES，5 mM KCl，1 mM MgCl2，140 mM氯化钠，10 mM葡萄糖，1.8 mM氯化钙2). 在BioRad MRC600共焦显微镜上进行测量，在488 nm激发，同时读取俄勒冈州绿（500–560 nm）和呋喃红（580–650 nm）。数据以“OG/FR比率”表示。

为了对机械损伤引起的钙反应进行成像，将MDA-MB-468细胞接种在96个成像板中，并生长到汇合处。如前所述，在HEPES缓冲DMEM中用Fluo-4 AM、PBX信号增强剂和丙磺舒加载细胞。用移液管尖端刮伤汇合的细胞单层(50). 使用尼康Eclipse TE 300倒置荧光显微镜（488 nm激发和550 nm发射）以20倍物镜获取图像。使用33 ms的曝光时间。使用16色LUT在ImageJ（v1.45b，美国国立卫生研究院（NIH））中生成假彩色图像；亮度和对比度调节被均匀地应用于所有图像。

划痕诱发钙波的定量分析

对于细胞图像分割，生成一个候选图像，表示刮擦事件之后所有电影帧的平均值(图S1A). 通过对候选图像应用分水岭变换来确定单个细胞的轮廓(图S1B)使用MATLAB图像处理工具箱（v7.11.0.584（R2010b），The MathWorks，马萨诸塞州纳蒂克，美国）。平均归一化像素强度<0.2的细胞组和面积比<0.1的细胞组被排除在随后的分析之外。

每个细胞的钙瞬变被计算为给定细胞区域内所有像素的平均像素强度(图S1C). 由此产生的钙瞬变I（T）通过具有以下函数形式的Boltzmann sigmoid方程进行拟合：

我(T型)=我0+我一个1+e（电子）−k个(T型−T型小时)
（1）

哪里我0是瞬态基线，我一个是瞬态振幅，k个是斜率系数，T型是时间和T型小时是半激活时间（另请参见图S1D). 参数来自等式。（1）使用解非线性最小二乘问题函数MATLAB优化工具箱.

细胞组被激活的时间，表示为T型（f），可以通过重新排列来确定等式。（1）如下：

T型=T型小时−1k个日志e（电子）(1α−1)
(2)

式中，α是高于基线的钙瞬变比例（即α=(我−我0)/我一个). 当α=0.5时，细胞组被认为是活跃的，此时T（f）被赋予方程式2.

细胞组相对于划痕位置的距离计算为细胞组质心到划痕事件定义线的垂直距离。要确定T型（f）和D类，以下方程适用于每个细胞组的激发时间/距离元组：

T型（f）=一个 × D类n个
(3)

哪里一个是缩放系数n个是幂律指数。参数一个和n个从等式。(3)使用解非线性最小二乘问题函数MATLAB优化工具包.

相位对比显微镜

将MDA-MB-468细胞以高密度接种在24孔培养皿中，并用EGF（50 ng/mL）处理72 h，如前所述。用BAPTA-AM（100µM，1 h）或NS8593（1µM或10µM）预处理细胞24 h。使用蔡司Axio Observer落射荧光显微镜，使用20倍物镜获取图像。根据Hoechst核染色选择区域。

免疫荧光

如前所述，对波形蛋白进行免疫荧光(46). 使用ImageXpress®微型自动外荧光显微镜（分子器件）上的10倍物镜，基于以下激发和发射波长采集图像：DAPI的377–450和447-60 nm，Cy3-vimentin的531-40和593–640 nm。使用MetaXpress®（v3.1.0.83，分子器件）测定波形蛋白的积分强度和阳性百分比。为了分析积分强度，将数据集导入AcuityXpress（2.0版，分子器件），并按照制造商的说明使用线性（最小最大）缩放对图像数据进行标准化。

免疫印迹法

细胞提取物是使用添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解缓冲液生成的（德国彭茨堡罗氏应用科学公司）。使用NuPAGE 4–12%梯度双三凝胶和MOPS流动缓冲液（Invitrogen）进行凝胶电泳，并转移到PVDF膜上。使用含0.1%吐温-20的PBS中5%的非脂肪奶粉封闭膜1小时。从Cell Signaling Technology（Danvers，MA，USA）购买以下抗体：抗磷酸-EGFR（4407）、抗EGFR（2232）、抗磷酸-ERK1/2（9106）、抗ERK1/2（9202）、抗磷-Akt（4051）、抗Akt（9272）、抗磷酸盐-STAT3（9138）、，抗STAT3（9139）。抗波形蛋白抗体（V6389）购自Sigma Aldrich。除抗磷酸-ERK1/2（1:2000）和抗波形蛋白（1:750）外，初级抗体按1:1000稀释，并在4°C下培养过夜。使用了以下二级抗体：抗鼠HRP结合二级抗体（170–6516）和抗兔HRP结合二级抗体（170-6515，BioRad，Hercules，CA，USA），稀释度为1:10000。使用VersaDoc数字成像系统（BioRad）采集图像，并根据ImageJ文件中概述的凝胶分析方法使用ImageJ（NIH）进行分析。蛋白质密度标准化为β-肌动蛋白负荷控制（1:10000），ERK1/2除外，ERK1/2的分子量与β-肌动蛋白相似，因此不能使用。磷酸化蛋白相对于各自的总蛋白进行定量。

小干扰RNA

我们使用了Dharmacon ON-TARGET加SMARTpool siRNA和Dharmacon siGENOME SMARTpool siRNA（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆热电科学公司）。DharmaFECT4转染试剂的浓度分别为0.1微升/孔或0.2微升/井，用于低密度和高密度播种方案。细胞在转染后48小时血清饥饿，并用EGF刺激。以下法师目标加本研究中使用了SMARTpool™siRNAs：非靶向性（D-001810-10-05）、TRPV3（L-005263-00-0003）、TRPC4（L-006510-01-0003）、TRPC 5（L-006511-00-0003。使用了以下Dharmacon siGENOME siRNAs：非靶向（D-001206-14-05）和TRPM7（M-005393-03-0005）。

实时RT-PCR

使用Qiagen RNeasy Plus迷你试剂盒（74134）分离和纯化总RNA。Omniscript RT试剂盒（205111，Qiagen，Hilden，Germany）用于RNA的逆转录，并使用TaqMan快速通用PCR Master Mix（4352042）和TaqMan基因表达分析扩增得到的cDNA。本研究中使用的基因表达分析包括：波形蛋白（Hs00185584_m1）、扭曲（Hs00361186_m1。使用StepOnePlus Real-Time RT-PCR仪器（Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA）在通用循环条件下循环反应。参考18S核糖体RNA确定相对定量，并使用比较CT型方法(53).

统计分析

使用GraphPad Prism（Windows版本5.04；GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA）进行统计分析。图图例中提供了所使用的统计测试。

补充材料

1

图S1。细胞域分割和细胞激发时间计算：

一个)分水岭变换的候选图像，它被视为抓取事件之后所有电影帧的平均值。黄色虚线表示划痕的位置。B类)用彩色区域表示细胞域的候选图像的分水岭变换。白色区域表示细胞外空间或错误的细胞群特征，黑色虚线表示划痕位置。C类)通过分水岭变换确定的细胞组区域。D类)平均像素强度的轨迹，其中轨迹颜色对应于C中高亮显示的组的颜色。垂直黑线表示划痕事件的计时，红色轨迹表示等式。（1）平均像素强度轨迹。

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2

图S2。EGF和BAPTA-AM对MDA-MB-468细胞形态的影响：

相位对比图像显示了使用EMT（72小时EGF）的MDA-MB-468乳腺癌细胞的形态以及细胞内钙螯合作用（BAPTA-AM）的影响。根据Hoechst染色选择区域，代表三个独立实验中的12个区域。比例尺显示100µm。箭头显示细胞具有纺锤状形态。

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三

图S3。TRPM7沉默和EMT相关基因表达：

Dharmacon目标加（OTP）siRNA(A–C)或Dharmacon siGENOME siRNA(D–F型)用于沉默MDA-MB-468细胞中的TRPM7，并评估EGF对波形蛋白、Twist和N-cadherin mRNA水平的影响。条形图显示了来自三个独立实验的九口单井的平均值±S.D。使用双向方差分析和Bonferroni的多重比较后测试评估TRPM7沉默对EGF诱导的基因表达的影响*P（P）< 0.05.

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4

图S4。细胞液钙对EGF的反应：

在具有TRPM7沉默（Dharmacon OTP siRNA）的MDA-MB-468乳腺癌细胞和稳定表达低水平TRPM7的N1E-115/TRPM7细胞中评估细胞溶质钙对EGF的反应。一个)平均相对值[Ca2+]中青旅瞬态，B类)相对峰值[Ca2+]中青旅响应和C类)在具有EGF（50ng/mL）的MDA-MB-468细胞中的曲线下面积（AUC）。显著性通过学生的t检验进行评估。D类)根据EGF（100 ng/mL）和缓激肽（1µM），在N1E-115/TRPM7细胞中进行伪相对钙记录，然后添加过量（约5 mM）细胞外钙的BAPTA（3 mM；游离钙估计约30 nM）和离子霉素（5μM）。钙示踪显示俄勒冈州绿488 BAPTA-1 AM（OG）和呋喃红AM（FR）荧光的比率，是连续两天进行的至少五次实验的代表。

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5

图S5。NS8593对EGF诱导的细胞形态变化的影响：

相位对比图像显示了使用EMT（72小时EGF）的MDA-MB-468乳腺癌细胞的形态以及TRPM7抑制剂NS8593的作用。根据Hoechst染色选择区域，代表三个独立实验中的12个区域。比例尺显示为100µm。箭头显示细胞具有纺锤状形态。

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致谢

该研究得到了国家卫生与医学研究委员会（NHMRC；项目拨款569645和1022263）以及美国国立卫生研究院、国家环境健康科学研究院（NIEHS）的校内研究计划的部分支持。FD由NHMRC生物医学研究生奖学金（511262）资助，RF由UQ博士后奖学金资助，EWT由国家乳腺癌基金会部分资助。

资助：这项研究得到了国家卫生和医学研究委员会（NHMRC；项目拨款569645和1022263）以及美国国立卫生研究院、国家环境健康科学研究所（NIEHS）的校内研究计划的部分支持。FD由NHMRC生物医学研究生奖学金（511262）资助，RF由UQ博士后奖学金资助，EWT由国家乳腺癌基金会部分资助。

脚注

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

补充信息

电影S1。

显示细胞内钙的代表性电影2+MDA-MB-468细胞机械损伤后的波传播。比例尺，75µm；电影以3倍的速度放映。

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