GLS2受p73转录调节，有助于神经元分化

GLS2的表达对神经母细胞瘤细胞系终末神经元分化的影响

由于我们已经表明RA通过TAp73依赖性机制诱导GLS2的表达，我们询问GLS2本身是否可以在NB细胞的末端神经元分化中发挥作用。为了评估这一点，我们在SH-SY5Y细胞中过度表达GLS2和GFP(图2A)24h后，评估神经突起的生长。图2B结果表明，GLS2（pGLS2）的过度表达显著增加了神经突起的生长，但程度与RA不同。转染GFP（C+GFP）或GFP+空载体（pCTR+GFP。此外，如所示图2C过度表达GLS2的细胞显示出两倍于胞体长度的高频率神经突起，在较小程度上是胞体长度3倍。GFP+空载体转染细胞仍处于未分化状态（und）。

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图2。GLS2的异位表达增加了轴突的生长。(A类)SHSY-5Y细胞系中神经突起生长的典型图像。用所示质粒转染细胞，然后不治疗或用RA治疗。图中显示了具有代表性的显微照片。放大40倍(B)48小时后，按照“材料和方法”中的描述固定细胞并分析其轴突延伸情况。(C类)过度表达GLS2（紫柱）的SH-SY5Y细胞的轴突比细胞体长2-3倍。数据表示3个不同实验的平均值±标准差。

内源性GLS2在神经元分化中的作用

为了评估内源性GLS2是否也有助于神经元分化，我们敲除了RA治疗的SH-SY5Y细胞中GLS2的表达(图3A;图S1C).图3B显示GLS2表达的抑制导致了适度但显著的(P（P）=0.02）24小时RA诱导的轴突延伸减少。这种小影响可能是由于上述SH-SY5Y细胞中GLS1亚型伴随表达的代偿作用。为了更好地理解GLS亚型在神经元分化中的作用，在皮层神经元体外分化过程中，我们通过撤回Gln来抑制GLS活性。将初级皮层神经元进行培养，24小时后用不含Gln的培养基替换完整培养基。6天后，对含有或不含Gln的皮层神经元进行免疫细胞化学处理。如所示图3C和Dβ-III-Tubulin染色显示，剥夺Gln导致神经突起数量减少。通过对皮层神经元进行特异性突触蛋白VGAT、VGLUT和突触蛋白1/2的染色，证实了这种减少。正常培养基和无Gln培养基中的皮层神经元凋亡无显著差异(图S2).³⁶

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图3。内源性GLS2水平的抑制可减少RA诱导的轴突生长。(A类)SHSY-5Y细胞系中神经突起生长的典型图像。细胞转染Scramb+GFP或siGLS2+GFP，未经处理或用维甲酸（RA）处理。(B)48小时后，按照方法中的描述固定细胞并分析其轴突延伸情况。数据代表3个不同实验的平均值±标准差。谷氨酰胺戒断损伤皮层神经元的体外终末分化。(C类)在有或无谷氨酰胺的情况下培养皮层神经元，7天后固定并染色显示的蛋白质。放大40倍。(天)使用Zeiss LSM 510软件分析对神经元标记物β-III-Tubulin和所示突触蛋白的荧光强度进行量化。

综上所述，这些观察结果表明GLS2参与调节RA处理的NB细胞和皮层神经元的神经元分化。

GLS2在NB细胞中的代谢功能

众所周知，GLS2在能量代谢和抗氧化防御中起着关键作用。事实上，它调节细胞中的ATP水平和GSH/GSSG比率。^9,10,37因此，我们询问GLS2是否也能在SH-SY5Y细胞中发挥同样的功能。首先，我们过度表达了GLS2(图4A)并测量细胞内ATP的水平。如所示图4C（左手杆），GLS2的异位表达导致ATP细胞内水平显著增加（约+40%）。相反，当我们通过siRNA敲低GLS2表达时(图4B)，我们观察到ATP水平显著降低（约-20%）。当我们用谷氨酰胺拮抗剂DON抑制GLS2的活性时，也得到了相同的结果(图4C). 然而图4D表明GLS2的过度表达和敲除均未显著影响GSH/GSSG比率。

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图4。GLS2调节细胞内ATP水平。(A类)用空载体（EV）或FLAG-GLS2转染SHSY-5Y细胞后，显示GLS2表达的典型western blot。(B)实时PCR显示用短干扰RNA转染SHSY-5Y细胞后GLS2表达受到抑制（siGLS2）。加扰（SCR）。实时PCR数据归一化为相对于打乱（SCR）的看家基因GAPDH。数据表示3个不同实验的平均值±标准差。(C类)按照“材料和方法”中的描述，测量转染或按指示处理的SHSY-5Y中的细胞内ATP水平。在200μM下使用谷氨酰胺酶DON抑制剂（6-重氮-5-氧-L-亮氨酸）。(天)GLS2对SHSY-5Y细胞内GSH和GSSG水平无影响。按照“材料和方法”中的描述测量GSH/GSSG的比率。数据表示3个不同实验的平均值±标准差。

细胞培养和转染

TAp73α-SAOS-2-Tet-On细胞在RPMI、250μM L-谷氨酰胺（Gibco）、青霉素/链霉素1 U/ml（Gibco-）和10%无Tet-free FCS（Clontech）中生长；HEK 293E细胞在DMEM高糖、10%FBS、青霉素（100U）、链霉素（100μg）（Invitrogen）中培养；SH-SY5Y细胞在DMEM 10%FCS、青霉素/链霉素1 U/ml（Gibco）中保存，H1299细胞在RPMI、250μM L-谷氨酰胺（Gibco）、青霉素-链霉素1 U/ml（Gibco）、10%FCS（Invitrogen）中生长。为了分化，SH-SY5Y细胞在添加1%FCS和10μM RA的DMEM中培养。

根据制造商的方案（Invitrogen），用Lipofectamine 2000转染细胞。人类GLS2-表达载体由新泽西州癌症研究所冯兆辉博士善意提供。如前所述，从E17.5胚胎小鼠制备初级皮层神经元培养物。⁴²

RNA提取和实时PCR

根据制造商的说明，使用Trizol（Invitrogen）从细胞或组织中分离出总RNA。使用RevertAid H Minus逆转录酶和寡核苷酸（dT）（Thermo Scientific）逆转录总RNA（3μg）。qRT-PCR在ABI PRISM 7000序列检测系统（Applied Biosystem）中使用SYBR绿色预混料（AppliedBiosystim）和特异性引物进行。根据阈值周期（Ct）确定每个基因的表达，并使用2^-ΔΔCt方法参照家政基因GAPDH的表达进行归一化。使用以下引物：小鼠GAPDH Fwd 5′-CAATGAATAC GGCTACAGCA AC-3′和小鼠GAPDH-Rev 5′-AGGAGATGC TCAGTGTTGG-3′；小鼠GLS2 Fwd 5′-AGCGTATCCC TATCACAG TTCA-3′和小鼠GLS2-Rev 5′-GCAGTCCAGA G-3′；人TAp73 Fwd 5′-CTCTGGAGCT CTCTGGAACC A-3′和人TAp73Rev 5′-CGCCCACAC CTCATTATTC-3′；人GLS2 Fwd 5′-TGCCTATAGTT GGCGATCT CA-3′和人GLS2Rev 5′-GTCCATATC CATGGCTGAC AA-3′；人类GAPDH Fwd 5′-AGCCACATCG CTCAGACC-3′和人类GAPDH-Rev 5′-GCCAATACG ACCAAATC-3′；人GLS1 Fwd 5′-GCTTGCTCC ATTGAAGTGA CT-3′；和人类GLS1 Rev 5′-TTGGGCAGAA ACCACCATTA G-3′。

染色质免疫沉淀

将TAp73α-SaOS-2诱导细胞在含有1%甲醛的溶液中交联10分钟，并按照制造商的说明使用MAGnify ChIP系统（Invitrogen）进行ChIP分析。对细胞裂解液进行超声处理，以获得约700 bp的染色质片段。使用抗HA特异性抗体（16B12，Covance）和非特异性IgG作为对照，免疫沉淀免疫复合物。收集的DNA片段通过PCR进行检测。以下寡核苷酸用于扩增GLS2启动子中发现的p53推定应答元件（RE）：Fwd 5′-GGCCTCCAA GTCACCAGTT CA-3′Rev 5′-TGTTTTTTGCT TGTTCGCC TTCT-3′。用一组引物Fwd 5′-GGTTGACTCA GCTTCCTC TTG-3′和Rev 5′-GGAAATGCA TGGTTTAAAT AGCC-3′（119 bp）扩增位于hMDM2上的p53 RE作为阳性对照。

荧光素酶检测

HEK 293E细胞被镀在12孔板（1×10⁵和1.5×10⁵每口井）。24小时后，将pGL3控制载体（200 ng）与TAp73α、β和ΔNp73α或空载体共转染雷尼利亚荧光素酶pRL-CMV载体（10 ng），使用Lipofectamine 2000。转染24小时后使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）测量荧光素瘤酶活性；使用OPTOCOMP I光度计测量10秒以上的光发射。转染效率使用标准化雷尼利亚萤光素酶活性。

蛋白质印迹

用含有抑制剂鸡尾酒（Roche）的RIPA缓冲液提取蛋白质，并使用Bradford染色法（Biorad）测定蛋白质浓度。对总蛋白（30μg）进行SDS-PAGE，然后用推荐稀释度的适当抗体进行免疫印迹。然后将印迹与过氧化物酶连接的二级抗体孵育，然后使用超级信号化学发光试剂盒（Thermo-scientific）增强化学发光检测。抗体：HA-HRP（1:5000；西格玛）、p21（1:1000，圣克鲁斯）、FLAG M2克隆（1:5000；西格玛-奥尔德里奇）和GAPDH（1:10000；西格玛-奥尔德里奇）。

神经母细胞生长试验

使用Lipofcamine 2000转染SHSY-5Y细胞，然后用RA（10μM）处理，24小时或48小时后进行分析。使用NeuronJ插件用NIH ImageJ半自动追踪投影图像。分析每个GFP阳性细胞的轴突长度。

ATP和GSH/GSSG测量

使用ELITEN ATP分析系统生物发光检测试剂盒（Promega）测量细胞内ATP水平。使用GSH/GSSG-Glo测定法（Promega）测量GSH和GSSG水平。简单地说，用FLAG-GLS2或siGLS2转染细胞，分别在24小时或48小时后，按照制造商的说明进行采集和处理。

免疫荧光

用人FLAG-GLS2转染SH-SY5Y细胞，24小时后用MitoTracker在37°C下培养30分钟^®红色CMXRos（Invitrogen）。然后用温培养基洗涤细胞两次，固定，并进行免疫荧光处理。SHSY-5Y细胞用抗FLAG（1:1000，Sigma-Aldrich）抗体染色。用3%多聚甲醛在PBS中固定含或不含谷氨酰胺培养的皮层神经元，然后用0.1%Triton X-100处理5分钟，用10%正常山羊血清在PBS在RT中处理1小时。然后在4°C下过夜，用以下主要抗体对细胞进行染色：神经特异性抗β-Ⅲ-管蛋白（1:2000；Promega），抗VGAT（1:500；Synaptic系统）、抗VGLUT1（1:500，SynapticSystem）和抗Synaps1-2（1:500：Synaptec系统）。在3次洗涤（PBS中10分钟）后，用Alexa Fluor共轭二级抗体（1:1000；Jackson ImmunoResearch Laboratories）培养细胞。3次洗涤（10分钟，PBS）后，细胞核用DAPI（1:10）染色 000）10分钟；此步骤之后，再进行进一步清洗（PBS中10分钟）。然后用Aquapolymount防褪色溶液（Polysciences）将盖玻片安装到玻片上，并在共焦显微镜下观察（蔡司LSM 510）。使用Volocity 3D图像分析软件6.3版（Perkin Elmer）进行结肠镜检分析。

皮层神经元的代谢组学分析

采集DIV7皮层神经元，并立即将其储存在−80°C的温度下，并按照前述方法处理样品。^54,55简单地说，样品制备过程是使用自动化MicroLab STAR进行的^®汉密尔顿公司的系统。为了进行质量控制，在提取过程的第一步之前添加回收标准。样品制备是使用一系列专有的有机和水萃取液进行的，以去除蛋白质部分，同时最大限度地回收小分子。所得提取物分为两个部分：一个用于LC分析，另一个用于GC分析。样品被短暂放置在TurboVap上^®（Zymark）去除有机溶剂。然后将每个样品冷冻并在真空下干燥。然后为适当的仪器（LC/MS或GC/MS）制备样品。通过与纯化标准品或反复出现的未知实体的文库条目进行比较来识别化合物。已知化学实体的识别基于与纯化标准品代谢组学库条目的比较。

我们感谢David J Read的技术支持。这项工作得到了英国医学研究委员会的支持；由“Allenza contro il Cancro”（ACC12）、MIUR/PRIN（20078P7T3K_001）/FIRB（RBIP06LCA9_0023，RBIP06LCA9_0C）、AIRC（2011-IG11955）、AIRC5xmille（#9979）、Telethon Grant GGPO9133、Min.Salute（Ricerca nologica 26/07）和IDI-IRCCS（RF06 c.73，RF07 c.57，RF08 c.15，RF07 c.57）授予GM。