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自然。作者手稿；PMC 2014年5月7日提供。
以最终编辑形式发布为：
自然。2013年11月7日；503(7474): 85–90.
2013年9月15日在线发布。 数字对象标识：10.1038/自然12533
预防性维修识别码：项目经理3904663
美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院539512
PMID：24037379

三环抗抑郁药复合物中多巴胺转运体的X射线结构

Aravind Penmatsa公司,1,* Kevin H.Wang（凯文·H·王）,1,*和埃里克·古奥1,2,#
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

针对钠的抗抑郁药+/氯−-耦合神经递质摄取是治疗临床抑郁症和神经病理性疼痛的主要治疗策略。然而，确定这些转运抑制剂药理活性的分子相互作用，以及抑制剂导致突触神经递质水平增加的机制，已被证明是难以捉摸的。这里我们展示了黑腹果蝇多巴胺转运体（dDAT）在3.0°分辨率下与三环抗抑郁药去甲替林结合。转运体被锁定在向外开放的构象中，去甲替林被楔入TMs1/6和3/8之间，阻止转运体与底物结合并从异构化到内向构象。虽然dDAT的整体结构与其相对的原核LeuT相似，但有多种区别，包括TM12中跨膜双层的扭结，盖住细胞质门的闩锁状C末端螺旋，以及楔入由TMs 1a、5和7形成的凹槽中的胆固醇分子。综上所述，dDAT结构揭示了钠偶联神经递质同向转运体抗抑郁作用的分子基础，阐明了真核细胞转运体结构和脂质调节的关键元素，从而扩大了我们对化学突触神经递质摄取机制和调控的理解。

介绍

化学神经传递涉及钙离子释放神经递质2+-诱导突触前神经细胞去极化1释放到突触间隙后，谷氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺、甘氨酸和GABA（γ-氨基丁酸）等神经递质激活GPCR和配体门控离子通道，导致兴奋性或抑制性突触后信号级联和电流1–三神经递质在中枢和外周神经系统中发挥着广泛而关键的作用，因此需要严格控制神经突触中神经递质的时空水平。突触间隙清除神经递质的主要方式是通过位于突触前和胶质细胞中的次级活性转运蛋白，利用离子梯度穿过细胞膜，驱动神经递质向上运输4。此交配过程需要Na+和Cl−离子5因此，形成了溶质载体6（SLC6）二级转运蛋白家族三，被称为神经递质钠转运体（NSS）2.

NSS功能失调与包括抑郁症在内的几种衰弱性疾病相关2、注意缺陷多动障碍（ADHD）6、直立不耐受7，癫痫8，帕金森氏症2和婴儿帕金森综合征肌张力障碍9NSS也是抗抑郁药、治疗神经病理性疼痛的药物、ADHD、焦虑和滥用成瘾物质（如可卡因和安非他明）的主要靶点三抗抑郁药的开发始于20世纪50年代10随后发现三环抗抑郁药（TCA）丙咪嗪可抑制组织中去甲肾上腺素的再摄取11丙咪嗪的多种变体，以及随后发现的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，彻底改变了抗抑郁治疗12,13迄今为止，抑制神经递质摄取仍是抗抑郁治疗中最广泛使用的策略12尽管有许多副作用14.

我们对钠偶联转运的分子机制的理解的进展得益于LeuT的多重构象结构15,16,17，一种细菌钠偶联氨基酸转运蛋白，与真核生物NSS具有约20%的序列同源性。基于LeuT的真核NSS模型对NSS成员的底物和离子特异性、药理学和转运机制提供了有价值的见解18,19然而，细菌NSS模型未能回答有关NSS结构和功能的元素的问题，这些元素包括NSS在氨基酸序列中与LeuT无关的区域中的局部结构，底物选择性的决定因素和抗抑郁药和成瘾化合物转运抑制的原子级细节。此外，在三维结构水平上，还没有人了解脂类和翻译后修饰在NSS结构和机制中的作用。

这里我们展示了一个3.0°x射线晶体结构黑腹果蝇多巴胺转运蛋白20与TCA去甲替林复合。dDAT与哺乳动物的序列同源性超过50%，具有哺乳动物多巴胺（DAT）、去甲肾上腺素（NET）和血清素转运体（SERT）的混合药理学特征，从而使dDAT成为研究NSS药理学和底物特异性的有力工具20dDAT结构揭示了TCA识别的原子细节，NSS蛋白质结构的新结构元素，并表明胆固醇在真核NSS成员的变构控制转运中的作用。

热稳定和结晶

野生型dDAT不稳定，从细胞膜中提取洗涤剂后失去配体结合活性，不易结晶。为了稳定dDAT用于功能表征、抗体生成和结晶，我们筛选了高温下配体结合活性的单点突变体21最终将5个突变组合到用于结晶和结构测定（dDAT）的结构中晶体;补充图1). 净化dDAT晶体与高亲和力抑制剂尼索西丁结合K（K）D类29 nM(补充图2a)TCA去甲替林显示K（K）我156nM(补充图2b). 不幸的是，由于去甲替林的不稳定性，我们无法测量其与野生型dDAT的结合。去甲替林具有K（K）我hSERT为18 nM，hNET为4.4 nM22，值比dDAT低约9倍和35倍晶体在使用野生型dDAT阿米替林（去甲替林的前体）测量多巴胺摄取时，通过一种K（K）我30 nM20，而dDAT晶体构造在传输中处于非活动状态(补充图2c、d). 通过使用Fab复合物进一步增强了结晶，生成了dDAT晶体晶体-将X射线衍射到3.0°分辨率的Fab复合体。

dDAT的体系结构

dDAT的结构晶体与去甲替林结合显示出向外开放的构象，抗抑郁剂被结合在跨膜双层一半的空腔中，并且只能从膜的细胞外侧接触到溶剂(图1). 转运蛋白显示出具有12个跨膜（TM）螺旋的整体LeuT样折叠，其中螺旋1-5和6-10通过固有的假对称性相关，类似于LeuT15(补充图3). TM1和TM6中的残基通过这些TMs大约中点处的非螺旋、铰链状区域与配体和离子进行大量相互作用，将所有三个离子的键网络与抑制剂连接起来。TM3弯曲处的残留物有助于形成疏水囊，该疏水囊支撑配体的三环部分，该配体大致垂直于TMs，模拟一个楔子将虎钳的钳口分开。一个胆固醇分子位于TM5和TM7之间的凹槽中，准备调节运输周期中发生的TM1a的运动(图1a)17.

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dDAT的体系结构晶体

一，dDAT的结构晶体与膜平行观察。去甲替林、钠离子、氯离子和胆固醇分子分别以洋红色、紫色、绿色和黄色的球体表示。b条，dDAT视图晶体从细胞外表面。c，表面表征表明配体和离子结合位点可从细胞外前庭进入。去甲替林和TMs 1、3、6和8的颜色如面板a所示。

初级结合位点容纳去甲替林，但不能采用形成闭塞状态所需的TMs 1b和6a随后的螺旋运动。使用LeuT进行比较，LeuT的闭塞状态是在钠和亮氨酸底物的存在下形成的，而不是在色氨酸的存在下，色氨酸与初级位点结合，与dDAT背景下的TCA相当晶体我们建议色氨酸和TCA稳定LeuT和dDAT的外向构象晶体分别通过靶向主要结合位点和空间位阻转运体的胞外结构域，阻止胞外门关闭，从而通过“脚踏实地”机制发挥作用(补充图4a、b；补充表2).

鉴于dDAT的核心晶体与dDAT外围的LeuT非常相似晶体表现出与LeuT不同的几个特征，并且对神经递质转运和细胞定位很重要。在TM12中，Pro572中心的一个扭结导致螺旋的后半部分偏离转运蛋白，这表明LeuT的二聚化界面与真核生物NSS的潜在寡聚化界面不同(图1a和b,补充图5). 而以前的研究表明，NSS齐聚23,24，日期晶体是洗涤剂胶束和晶格中的单体(补充图6)因此，NSS组装可能需要膜双层或额外分子。变量EL2区域有许多预测N个-连接的糖基化位点25和一个二硫键26，在NSS向质膜的适当运输中发挥关键作用的修饰三.严格保守的二硫键26在两个保守半胱氨酸Cys 148和Cys 157之间的结构中观察到(补充图7). 在晶体中，EL2在晶格接触中起着中心作用，与相邻的Fab以870欧姆的速度堆积2接口(补充图6). 因为在dDAT中从EL2中删除了43个残基晶体构建，需要进一步研究以确定全长EL2在转运蛋白结构和功能中的作用(补充图8b). EL4与EL2一起含有Zn2+-哺乳动物DAT中调节转运的结合位点27dDAT中的等效残留物晶体在10 Au的Cα-Cα距离内，但由于它们是Glu 161、Leu 374和Ala 395，因此在dDAT中没有形成高亲和力的锌结合位点晶体.

三环抗抑郁药结合位点

去甲替林在dDAT中的明确密度晶体在主要部位观察到，大约穿过膜双层的一半(图2a). 根据先前的嵌合研究，在NET和DAT之间交换TM区域28，药物结合位点主要由螺旋1、3、6和8包围，其区域相当于LeuT的底物结合囊15和接近钠离子和氯离子的密度(图2a). 去甲替林的二苯并环庚烯环呈鞍状排列，围绕TM3的中心区域弯曲，并与Val 120、Tyr 124和Ala 117发生疏水相互作用(图2b). Val 120广泛保守，面向环庚烯环(补充图4a)以及用蛋氨酸等较大的替代物替换人类SERT中相应的Ile 172，显著降低了对大多数NSS抑制剂的亲和力19之前在人类SERT中发现，在抑制剂或底物存在的情况下，该位置可防止交联剂进入29TM6b中的Phe 325与去甲替林的一个苄基形成π堆栈。残基Gly 425（TM8）和Ala 479（TM10）也与药物的三环基团相互作用。这个N个-药物的甲基丙胺基团延伸穿过药物结合位点的宽度，并阻止TMs 1b和6a关闭“在”药物上方的细胞外门。胺基与苯丙氨酸43主链羰基形成氢键，与苯丙醇43侧链形成阳离子-π相互作用(图2b). 有趣的是，SERT中相当于Val 120和Phe 43（Ile 172和Tyr 95）的残基对于与抗抑郁药的相互作用是必要的30.

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抗抑郁药结合部位

一，去甲替林结合dDAT的整体视图晶体Fo-Fc公司药物和离子的密度（蓝色网格）分别以σ水平2.5和3.0绘制。b条，药物装订袋的特写视图。纳+并且Cl离子显示为球体。去甲替林用棒状物（洋红）表示。去甲替林的氨基来自F43（TM1a）的羰基氧和N个-去甲替林的甲基是来自F319的羰基氧的3.2º。药物结合袋内的残余物，界面面积大于10º2被表示为棒。c.dDAT药物或基质结合袋的比较晶体与LeuT（PDB id.2A65）的差异。亮氨酸的羧酸基和Tyr 108（球体）之间的距离在LeuT的闭塞状态（2A65）下为2.7º，在抑制结合状态（3F3A）下为5.1º，而dDAT中的等效相互作用晶体Asp 46和Tyr 124之间为3.2º。

生物胺转运蛋白在TM1和dDAT中含有关键的天冬氨酸残基晶体与由LeuT、GATs和GlyT运输的氨基酸底物相比，我们可以看到Asp46如何替代生物胺中缺少的羧酸基团(补充图8a)15Asp 46的侧链与Tyr 124的羟基形成氢键，相当于LeuT中的Tyr 108，在底物识别中起作用31(图2c). 这种天冬氨酸的突变会导致运输活性的大量损失，并降低可卡因的结合亲和力32Ser 421（TM8）与位置2处的钠离子进行配位，与TCA的丙胺基团在3.5°范围内，并且还与Phe 43的羰基形成氢键。因此，Ser 421参与了连接去甲替林和Na2位点的氢键网络，并被发现对人类SERT高亲和力识别抗抑郁药至关重要33.

这个N个-去甲替林的甲基距离Phe 319的主链羰基3.2º，立体阻止Phe 319a和TM6a关闭药物上方的细胞外门，从而稳定转运蛋白的外向开放状态。Phe 319相当于LeuT中的Phe 253，它将基板结合囊门打开(图2c)15–17在LeuT的底物结合、封闭结构中，Phe 319与Phe 253的相对位置显著不同，相反，在无底物和抑制剂结合结构中，其位置类似于Phe 253。为了解决去甲替林是否能与dDAT结合的问题晶体在LeuT-like闭塞构象中，我们叠加了dDAT晶体发现Phe 319和Phe 325会与TCA的二苯并环庚烯环发生冲突(图2c,补充图4c). 识别dDAT底物结合囊中结合的去甲替林晶体提供了第一个结构证据，证明TCA抗抑郁药通过阻止底物结合和稳定外向开放构象来抑制神经递质转运体18,19,34.dDAT晶体-NTT复合物和LeuBAT抗抑郁复合物35，最终证明抗抑郁药通过作用于主要或S1位点抑制NSS，与TCA通过非竞争机制抑制LeuT形成鲜明对比36通过细胞外前庭内的结合36–38.

离子结合位点

运输所必需的离子位置可以在dDAT中确定晶体在TMs 1和TMs 6的非螺旋铰链状区域附近的三个位置，以及靠近TCA的位置，电子密度（>4.0σ）。这两个位点的密度与LeuT中确定的Na1和Na2位点完全一致(图3a、b)15一个氯离子被定位在高密度的第三个位置，位于TMs 2、6和7之间，靠近Na1(图3a). 在建模过程中，在省略密度中放置离子导致了Fo-Fc公司精炼过程中的密度。离子的原子位移因子与B类-周围原子的值。位置1处的钠位于离去甲替林氨基约5.2º的位置，并通过Asn 49、Ser 320、Asn 352的侧链氧和Ala 44和Ser 320的主链羰基与八面体几何构型配位(图3a,补充图8a). 有趣的是，Na1处的钠也由一个水分子配位，而水分子又位于Asp 46的氢键距离内，因此表明TM1中的Asp间接参与钠离子配位。该位置的平均离子配位距离（2.7°）比Na的报告距离（2.42°）长+溶液中的离子，但短于K的报告距离+离子（2.84℃；补充表3)39.

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离子结合位点

一、Na1和氯离子结合位点。纳+为紫色，Cl为绿色，均建模为球体。b条，Na2现场协调。位置处的配位是与钠离子水分子（红色球体）3.3º的三角双锥。对于在配位范围内的残基，距离以ängstrom表示，相互作用用虚线表示。残留物根据其各自的TM进行着色。

氯离子位于距离Na1位点5.0º的位置，该位置之前是基于LeuT的计算和突变研究确定的40和GAT41最近对LeuT的氯依赖型E290S突变体的结构研究也在该位置发现了氯离子42氯化物通过TM6（Ser 320，Gln 316）、TM7（Ser 356）和TM2（Tyr 69）中的残基以四面体形式配位(图3a). 有趣的是，Ser 320的羟基连接了Na1和Cl−并定位为与这两种离子相互作用。Cl处的平均离子距离−站点为3.0º(补充表3)和B类-周围原子的因子与氯化物的因子相似，支持氯化物在此位置的放置。

Na2位点的钠位于药物朝向细胞质表面的平面“下方”，位于TMs 1和8之间，由Gly 42（TM1a）、Val 45（TM1-铰链）、Leu 417（TM8）的主链羰基和Ser 421和Asp 420（TM8(图3b). 平均离子氧距离为2.4°，与溶液中钠配位的报告值一致(补充表3). 虽然TMs 1、6、去甲替林、钠和氯化物之间相互作用的互联网络为离子和抑制剂结合的耦合提供了基于结构的机制43，我们对NSS中抑制剂结合的离子依赖性没有全面的了解。

胆固醇结合位点

胆固醇分子被放置在一个以TM5、TM7和TM1a为边界的槽形空腔中，其深度相当于膜的内叶(图4a). 支链脂族残基主要参与形成蛋白质-胆固醇界面（357Å2)从而使胆固醇掩埋约57%的溶剂可及表面积。Fo-Fc公司该位点的密度清楚地界定了由Leu 276、Leu 277和Ile 358残基锚定在TMs 5和7结合处的胆固醇异辛基的取向。甾醇环的β面主要面对TM5中的残基Tyr 273、Leu 270和Trp 266，也与TM1a上的残基Val 34、Leu 37、Leu 38和Ile 41相互作用。胆固醇的α-面与TM7中的Leu 347和Ile 351残基交界。

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胆固醇位点

一，胆固醇（黄色棒）显示为Fo-Fc公司密度（浅品红）轮廓为2.0σ。与胆固醇组接触的残留物表示为棒状物。b条胆固醇在维持转运蛋白外向开放状态中的潜在作用。胆固醇（带有透明表面的棒状物）与TM1a在LeuT（PDB id.3TT3）向内开放构象中的位置发生空间冲突17.

胆固醇在调节NSS成员的功能中起着重要作用44,45，稳定DAT的对外开放状态，同时伴随着B类最大值因为可卡因46在LeuT中，TM1a在从外向开放和闭塞状态过渡到内向开放状态时发生了巨大的构象变化17如果在dDAT中发生类似的构象变化，它将完全破坏胆固醇部位(图4b). 我们假设胆固醇对dDAT作用的一种机制是，胆固醇通过占据其结合位点在向外开放的抑制结合状态，稳定了转运蛋白向外开放的构象46.

细胞外和细胞质门

dDAT中的离子和配体结合位点晶体由于初级结合囊上方的门是开放的，因此可以从细胞外表面接触到溶剂。TM3的Tyr 124和TM6a的Phe 319之间的距离为10º，而在LeuT的底物结合闭塞状态下，相应的距离是其一半(图5a、b). 类似地，TM1b上的Arg 52和TM10上的Asp 475之间的10 Au分离使得主要结合位点可被细胞外溶液访问。三环部分的空间本体与扩展的N个-去甲三丁基林的甲基丙胺链阻止TM1b和TM6a接近TM3和TM8以覆盖假定的底物口袋并关闭闸门。

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细胞外和细胞质门和C末端闩锁

一，dDAT中开放细胞外门（红框）、封闭细胞质门（蓝框）和C端闭锁（绿框）的相对位置晶体.b条，细胞外闸门的宽度由Y124和F319（10º）以及R52和D475（10µ）之间的距离表示。去甲替林、离子和螺旋的颜色如图1.c，TM1a、TM2、IL1、TM6b和TM8之间的极性和静电相互作用关闭了细胞质门。d日，TM12之后的C末端螺旋通过与IL1的极性相互作用与转运蛋白的细胞质表面结合。极性键和静电键用灰色虚线表示。

与细胞外门相反，在转运蛋白的细胞内表面，广泛的极性相互作用在配体、离子袋和溶剂之间形成约24Å的厚屏障，以保持细胞质门关闭。在转运蛋白的细胞质表面，Trp 30的吲哚氮覆盖TM6b中Tyr 331的羰基氧，Arg 27与TM8的Asp 435形成盐桥(图5c). Arg 27、Trp 30和Asp 435在NSS同源基因和LeuT中严格保守，表明这些细胞内的门相互作用是钠同向转运体家族转运机制的一般和重要方面47,48Tyr 334是与人类DAT中的Tyr 355相对应的残基，先前证明它负责将多巴胺转运体的构象平衡转移到向内开放状态49.

C端子插销

dDAT C末端的两个新特性晶体从结构上很明显。螺旋12b相对于其在LeuT中的位置移动了22°，导致TM3暴露于溶剂和脂质中(补充图5). Pro572在大多数真核生物NSS成员中保守，可能位于这种扭结的根源，因此在螺旋的后半部分远离转运蛋白的其余部分方面发挥着重要作用。TM12b与dDAT细胞内C末端之间的发夹晶体通过Arg 589的ε-氮和Thr 582的羰基氧之间的氢键稳定(图5d). 第二个特征是C末端螺旋，它包含从残基586到595的2½圈，其中Trp 597和Arg 101之间的几个氢键和p-阳离子相互作用抑制了dDAT细胞质表面IL1附近的C末端螺旋晶体虽然TM12和C-末端的序列保守性在NSS正交系中相当低，但Gly 584是严格保守性的，并且只有Lys或Arg存在于dDAT的Arg 589位置晶体这表明结构中C末端的重定向是一个具有功能相关性的保守特征。对人类DAT的研究已经确定TM12之后的区域包含蛋白激酶C介导的内吞转运位点三,50磷酸化可能会改变C末端的构象或可接近性，使其与细胞机制相互作用以实现内化。我们还注意到锁存参与了IL1的相互作用，IL1又与TM1a相互作用，因此表明C末端锁存可能调节转运蛋白的活性。

结论

dDAT的结构晶体以抑制剂结合、向外开放的构象捕获转运蛋白。TCA去甲替林以主要底物位点为靶点，通过空间位阻胞外门关闭来稳定开放构象(图6a). 一个氯离子和两个钠离子位于配体附近，表明离子和抑制剂的结合是直接耦合的。与TM1a侧翼缝隙结合的胆固醇分子可能会稳定向外开放的抑制剂结合构象(图6b). 该结构揭示了一个C末端锁存器，该锁存器与靠近细胞质门的转运体细胞质面进行广泛的相互作用，从而处于调节转运活性的位置。总之，真核多巴胺转运体的结构揭示了对抗抑郁药识别和神经递质转运调控相关结构元素的新见解，为药物设计策略提供了基础。

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抗抑郁药与胆固醇的作用机制

一TCA去甲替林（洋红）楔入支架螺旋3和8以及核心螺旋1和6之间，阻止TMs 1b和6a的运动关闭细胞外前庭。b条，胆固醇（黄色）结合在细胞内囊中，阻止TM1a的运动开放，从而稳定DAT的外向构象。C端闩锁作为细胞质门的一部分与IL1相互作用。

方法总结

dDAT晶体构造(补充图1)在感染病毒的哺乳动物细胞中表达，并通过亲和层析和大小排阻层析纯化。在结晶之前添加Fab 9D5和去甲替林（1mM），DAT:Fab摩尔比为1:1.1，并浓缩至3mg/ml。在100 mM甘氨酸pH 9和38%PEG 350 MME存在下获得复合物的晶体。通过使用LeuT的多平面模型（PDB id.3F3A）的分子替换来解决结构问题Fab可变域和恒定域的集合。使用标准晶体学软件进行数据处理、模型构建和细化(补充表1).

方法

筛选、构建优化和蛋白质表达

通过荧光检测尺寸排除色谱法（FSEC）筛选DATs和NETs的多个同源序列后，dDAT被选为结构研究的有希望的候选物51此外，FSEC用于筛选其他参数，如洗涤剂功效、热稳定性、脂质效应、第三表位特异性单克隆抗体和纯化后的样品均匀性。DNA编码黑腹果蝇DAT由Susan Amara提供，通过去除前20个氨基酸（D1–20）、EL2（D164–206）中的缺失以及通过点突变通过基于PCR的方法进行修改，以提高热稳定性（V74A V275A V311A L415A G538L）。此修改的dDAT序列被视为dDAT晶体，与C端子GFP-His融合8用凝血酶裂解位点（LVPRGS）代替残基602-607标记。日期晶体-GFP-他的8由病毒介导的哺乳动物细胞表达产生52–54.

抗体生产

抗dDAT单克隆抗体晶体由Dan Cawley（OHSU载体和基因治疗研究所）使用标准方法提出。通过基于荧光的尺寸排除色谱和western blot筛选抗体，以选择识别天然折叠dDAT的克隆晶体蛋白质。在小鼠杂交瘤细胞（Fusion Antibodies Ltd.）和完整抗体蛋白（Edman降解）（哥伦比亚大学玛丽·安·加温诺维奇）上进行Fab区序列测定。使用4-巯基乙基吡啶树脂从杂交瘤上清液中纯化抗体。Fab蛋白由全长抗体的木瓜蛋白酶裂解产生，然后由Fc蛋白质A树脂和阳离子交换的捕获。Fab储存在20 mM pH为5的醋酸钠、250 mM氯化钠和10%的甘油中。

dDAT的纯化晶体

在含有正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）的TBS（20 mM Tris pH 8，150 mM NaCl）中以每1g膜0.1 g洗涤剂的w/w比率溶解膜。洗涤剂可溶部分与钴负载金属离子亲和树脂和dDAT孵育晶体-GFP-他的8用100 mM咪唑在20 mM Tris pH 8、300 mM NaCl、5%甘油、14µM脂质（1-棕榈酰-2-油酰基）中洗脱-锡-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）：1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺（POPE）：1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸-（1'-rac-甘油）（POPG）重量比为3:1:1）、1 mM DDM和0.1 mM CHS。凝血酶消化后去除GFP-his8标签，dDAT晶体在20 mM Tris pH 8、100 mM NaCl、5%甘油、14µM POPE、4 mM癸基-麦芽糖苷和0.1 mM胆固醇半琥珀酸盐中通过尺寸排除色谱分离。纯化的dDAT晶体蛋白质以1:1.1的摩尔比与Fab 9D5混合，并用于在1 mM去甲替林存在下以3 mg/ml进行结晶试验。

结晶

使用1µl蛋白质和0.5µl贮存溶液的滴比，通过悬挂滴蒸气扩散，在100 mM pH值为9的甘氨酸和38%PEG 350 MME中生长晶体。2天后，初始晶体在4°C下出现，7天后达到完整尺寸。晶体在液态N中快速冷冻2直接用于X射线衍射数据采集。

结构确定

X射线数据在先进光子源（阿贡国家实验室，束线24-ID-C）收集。使用HKL2000对数据进行索引、整合和缩放55(补充表1). 该结构通过分子替换进行了求解，包括PDB中Fab坐标的常数域（重链和轻链的常数域作为一组）和可变域（重、轻链的可变域作为第二组）以及LeuT的聚丙氨酸模型（PDB id.3F3A）的系综。使用完成了多模型搜索相位器56初始阶段通过使用COOT进行手动建模、细化和最大似然密度修改的迭代步骤得到改进57，PHENIX精炼58和PHENIX阶段和建造59分别是。经过多轮精炼，Fab和dDAT的主链和侧链原子均被放置晶体.将结构细化至可接受的R系数(补充表1)dDAT中的残基为20–24和600–605晶体由于密度低，重链未建模时为135–138。将去甲替林、离子和胆固醇分子放入F类o（o）-F类c在假定的底物囊、离子位点和转运体外围，密度在2s或更大时出现轮廓。使用MolProbity评估立体化学60.

配体结合和摄取测量

使用溶解在洗涤剂中的转运体进行闪烁邻近性分析61使用硅酸铜钇（Cu-YSi）珠（Perkin Elmer）在0.5 mg/ml，30 nM的条件下进行三H标记的尼索西丁（1:9三小时：1H） 和10 nM dDAT晶体-GFP-他的8蛋白质在与尺寸排除色谱相同的缓冲液中。未标记的去甲替林被用作竞争配体。使用MicroBeta TriLux 1450 LSC和发光计数器读取分析板。使用标准的单站点竞争方程拟合数据，以及K（K）我根据IC计算值50值使用Cheng-Prusoff方程。

使用表达各自突变结构的人类胚胎肾（HEK 293）细胞进行摄入分析。将细胞重新悬浮在10µM中三H-多巴胺（1:49三高：1H） 含有25 mM Hepes-Tris制成的吸收缓冲液，pH 7.1，130 mM NaCl，1 mM MgSO4，5 mM氯化钾，1 mM氯化钙25 mM D-葡萄糖和1 mM L-抗坏血酸62。在添加标签之前，用10µM冷地昔帕明预培养对照样品。用含1µM地昔帕明的冷摄取缓冲液在10分钟后对分析进行猝灭，用冷摄取缓冲溶液对细胞进行两次洗涤，并通过闪烁计数测量溶解细胞的活性。使用Origin 7.0绘制数据。

dDAT的热稳定性筛选晶体

根据建立在LeuT模板上的dDAT模型选择诱变位点，并将残基改为Ala、Leu或Phe21将单个突变体和野生型构建物转染到HEK细胞中并保存48小时，然后在洗涤剂溶解后测试结合活性。将样品分开，一部分保持在4°C，另一部分裂解液在40°C加热10分钟。三在加热之前添加H-尼索西丁，以选择稳定转运蛋白抑制剂结合状态的突变体。闪烁邻近性分析用于以高通量形式监测活动。融化温度持续升高的突变体(Tm公司)与野生型相比(Tm公司=35°C），并合并为一个结构，产生5个突变结构Tm公司约60°C。

补充材料

补充信息

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致谢

我们感谢Dan Cawley博士（俄亥俄州立大学VGTI）产生单克隆抗体，感谢Susan Amara提供野生型dDAT构建物。我们要感谢H.Wang和D.Claxton以及其他Gouaux实验室成员在手稿准备期间进行的有益讨论，以及他们的意见和建议。我们感谢L.Vaskalis在数字方面的帮助，以及H.Owen在手稿准备方面的帮助。我们感谢高级光子源（APS）东北合作访问团队（NECAT）的工作人员在数据收集方面提供的帮助。这项工作得到了美国心脏协会（a.P.）博士后奖学金、国家精神卫生研究所研究奖（K.H.W.）和美国国立卫生研究院（E.G.）的支持。E.G.是霍华德·休斯医学研究所的研究员。

脚注

作者贡献

A.P.、K.W.和E.G.设计了该项目。A.P.和K.H.W.进行了蛋白质纯化、结晶学和生化分析。A.P.、K.H.W.和E.G.撰写了这份手稿。

该结构的坐标已保存在蛋白质数据库中，注册代码为xxxx。重印和权限信息可在www.nature.com/reprints网站.作者声明没有相互竞争的经济利益。

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