《柳叶刀神经》。作者手稿；PMC 2014年10月1日提供。
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重复大小与临床和病理特征的关系C9ORF72型扩张载体（Xpansize-72）：一项横断面队列研究
美国佛罗里达州杰克逊维尔圣巴勃罗路4500号梅奥诊所神经科学系，邮编：32224（M van Blitterswijk博士，M DeJesus-Hernandez理学学士，E Niemantsverdriet理学学士、M E Murray博士，P H Brown理学硕士，M C Baker理学学士；N A Finch理学硕士、P O Bauer理学博士、L Petrucelli理学博士，D W Dickson医学博士，R Rademakers博士）；美国佛罗里达州杰克逊维尔圣巴勃罗路4500号梅奥诊所生物统计学科，邮编32224（M G Heckman理学硕士，Nancy N Diehl理学学士）；Banner Sun健康研究所，10515 W Santa Fe Dr，太阳城，亚利桑那州85351，美国（G Serrano PhD，T G Beach PhD）；美国明尼苏达州罗切斯特西南第一街200号梅奥诊所神经科，邮编55905（KA Josephs MD，D S Knopman MD，R C Petersen MD，B F Boeve MD）；美国佛罗里达州杰克逊维尔圣巴勃罗路4500号梅奥诊所神经科，邮编32224（N R Graff-Radford医学博士，K B Boylan医学博士）
通信地址：Rosa Rademakers，PhD，Mayo Clinic神经科学部，4500 San Pablo Road，Jacksonville，FL 32224，USA电话号码：+1 904 953 6279。传真号码：+1 904 953 7370。ude.oyam@asoR.srekamedaR - 补充资料
1
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总结
背景
9号染色体开放阅读框72中的六核苷酸重复扩增(C9ORF72型)目前是额颞叶痴呆（FTD）和运动神经元病（MND）的主要遗传原因。目前，尚不清楚扩张规模是否会影响疾病的严重程度或表型。
方法
我们对梅奥诊所和班纳太阳健康研究所获得的一组受试者进行了横断性Southern杂交特征研究（Xpansize-72）。所有受试者在C9ORF72型高质量的DNA可从额叶皮层、小脑和/或血液中获得。采用Southern印迹技术和密度测定法估计最丰富的扩张物种的重复大小。使用Wilcoxon秩和和Wilcoxson符号秩和检验对组织间的重复大小进行比较，并使用Kruskal-Wallis秩和检测对疾病亚组间的重复尺寸进行比较。使用Spearman相关检验评估重复大小与发病年龄和采集年龄的相关性；然而，使用Cox比例风险回归模型检验了重复大小与疾病发病后生存率之间的关系。
调查结果
我们的队列由84人组成C9ORF72型扩张携带者，包括FTD患者（n=35）、FTD/MND患者（n=16）、MND病人（n=30）和未受影响的受试者（n=3）。我们重点分析了三个主要组织亚群：额叶皮层（41名受试者[21名FTD，11名FTD/MND，9名MND]）、小脑（40名受试人员[20名FTD、12名FTD/名MND、8名MND]]）和血液（50名受试人[15名FTD（FTD），9名FTD/M ND（MND），23名MND:3名未受影响的扩张携带者]）。小脑中的重复长度（中位数12.3 kb[~1667重复单位]，IQR 11.1-14.3）明显小于额叶皮层（中位数33.8 kb[~5250重复单位]、IQR 23.5-44.9，p<0.001）或血液中的重复时间（中位数18.6 kb[~2717重复单位）、IQR13·9-28.1，p=0.0002）。在这些组织中，疾病亚组之间的重复长度没有显著差异（小脑p=0.96，额叶皮层p=0.27，血液p=0.10）。在FTD患者的额叶皮层中，重复长度与发病年龄相关(第页=0.63，p=0.003）和收集年龄(第页=0.58，p=0.006）；在小脑或血液中未检测到这种相关性。最后，只有小脑的重复长度大于1467个重复单位（25第个百分位数，HR 3·27，95%CI 1·34–7·95，p=0.009）：扩张时间较长组的中位生存期为4.8年（IQR 3·0–7·4），而扩张时间较短组为7.4年（IQR 6·3–10·9）。
解释
小脑、额叶皮质和血液之间的重复大小存在显著差异；小脑中相对较长的重复大小带来了重要的生存劣势。我们的研究结果表明，扩张规模确实会影响疾病的严重程度，这可能与遗传咨询有关。
介绍
9号染色体开放阅读框72中的重复扩增(C9ORF72型)是额颞叶痴呆（FTD）和运动神经元病（MND）最常见的已知遗传原因。1，2有人提出，这些疾病是由于转录重复序列时有毒RNA焦点的形成，1由于非ATG翻译产生聚集的二肽重复蛋白，三，4和/或C9ORF72蛋白功能丧失。5，6
而重复启动的PCR方法能够评估是否存在C9ORF72型重复扩增，需要Southern印迹技术来确定GGGCC重复序列的实际大小。然而，Southern印迹法耗时且具有挑战性，因此，迄今为止进行的研究非常有限。最近的Southern blot研究确实调查了57例神经退行性疾病患者的临床队列，7但对大脑重复大小的大规模Southern杂交研究尚未报道。为了解决关键问题，例如重复长度是否与六核苷酸重复序列扩增患者的临床表型、疾病发作或生存相关，我们对200多个来自C9ORF72型扩展载体。
方法
参与者和研究设计
在我们的病理学队列中，我们选择了所有C9ORF72型佛罗里达梅奥诊所脑库和班纳太阳健康研究所诊断为FTD和/或MND的重复扩张携带者，他们有足够的额叶皮层和/或小脑组织，可以提取高质量DNA进行Southern印迹。在我们的临床队列中，我们从每个携带C9ORF72型重复扩张；佛罗里达州和明尼苏达州梅奥诊所的阿尔茨海默病研究中心（ADRC）确定了FTD（和FTD/MND）病例，而佛罗里达梅奥诊所ALS中心确定了MND（和FTD/MND）案件。在那些在多个时间点采集血液的受试者中，我们包括了所有样本，此外，我们从FTD亚组中选择了一个家族，从MND亚组中选取了一个家庭，其中可以获得不少于四个扩张载体（受影响和未受影响）的材料。只有当从血液中提取足够质量的DNA以进行Southern印迹时，受试者才被纳入我们的临床队列(web附录第1页).
所有受试者和/或其法定近亲在进入研究前均获得书面知情同意，并在伦理委员会批准的情况下获取生物样本。
程序
按照DeJesus-Hernandez等人的描述进行Southern印迹。，1稍作修改。按照标准程序从冷冻组织、血液或细胞系中分离出DNA(web附录第2页). 用XbaI消化总共7–10μg基因组DNA，并在0.8%琼脂糖凝胶中在100V下电泳约6小时。然后将DNA转移到带正电的尼龙膜上（罗氏、彭茨伯格、上巴伐利亚、德国），并通过紫外线辐射交联。在地高辛（DIG）EasyHyb溶液（Roche）中预杂交后，用DIG标记的探针进行杂交。使用抗-DIG抗体（1:10000，Roche）检测探针，随后在X射线胶片上用CDP-星型底物（Roche。获得了30分钟到6小时之间的多次曝光，以最小化Southern印迹之间的信号强度差异，并解释了信号强度随时间的减少。共对495份样本（203份个体DNA样本）进行了63次Southern杂交；根据特定样本（疾病、患者和组织之间）的比较次数、Southern杂交的质量以及我们可用的DNA数量，对样本进行1-8次分析，以获得最准确的重复大小。使用AlphaEaseFC（版本4.0.0；Alpha Innotech，Santa Clara，CA，USA），根据条带相对于分子量标记的位置，通过计算条带的分子量来估计最丰富的扩展尺寸。当对给定组织的样本进行多次测量时，计算这些测量值的平均值并用于统计分析。在所有统计分析中，超过48.5 kb的重复扩增被视为50 kb的扩增，这是对其实际重复长度的保守预测(网络附录第3页).
统计分析
用中位数和四分位数范围（IQR）对数据进行总结。对于整个队列和每个疾病亚组，分别对C9ORF72型除了额叶皮层和小脑之间的比较外，在所有情况下（包括所有具有任一样本可用于给定比较的个体），使用Wilcoxon秩和检验确定额叶皮层、小脑、血液和颞叶皮层之间的重复长度，其中进行了配对Wilcoxon符号秩检验（仅包括两个样本都可用的个体）。在整个队列中，当比较小脑和颞叶皮层之间的重复长度时，我们还采用了配对Wilcoxon符号秩检验，仅使用了这两种测量方法都适用的18名受试者。在将血液中的重复长度与额叶皮层和小脑进行比较时，重叠较小，因此，我们使用分层van Elteren Wilcoxon秩和检验来解释我们未配对分析中的任何潜在混淆因素。8
为了确定在两个不同时间点获得的重复长度的一致性程度，我们估计了Lin的一致性相关系数，其范围从−1到1（1表示完全一致）。9使用Kruskal-Wallis秩和检验比较疾病亚组之间的重复长度。在整个队列中，并分别针对每个疾病亚组，使用Spearman相关检验、Wilcoxon秩和检验或Kruskal-Wallis秩和测试评估重复长度与临床特征的相关性。斯皮尔曼相关系数第页估计95%置信区间（CI）。值得注意的是，上述分析中使用了非参数方法，因为当满足参数测试的假设时，这些测试相对于其参数等价物具有可比较的效率，并且当不满足参数测试假设时，它们比其参数等价体更有效。
此外，我们使用Cox比例风险回归模型，分别在所有受试者和每个疾病亚组中调查了重复长度和疾病发病后生存率之间的关系。评估了危险比（HR）和95%CI，在最后一次随访时进行了审查，并将任何原因的死亡作为我们的生存终点。采用单变量和多变量Cox回归模型；尽管样本量相对较小，死亡人数相对较低，但当这种调整可能合理时，考虑了多变量模型。10对整个队列中的所有模型进行疾病类型调整。此外，对于涉及小脑和额叶皮层重复长度的整个队列中的模型，我们还调整了发病时的年龄。或者，在整个队列中，我们在涉及额叶皮层重复长度的模型中调整了收集时的年龄，以专门解决该变量的混淆潜力。FTD患者涉及额叶皮层和小脑重复长度的多变量模型根据发病年龄进行了调整。由于给定组中死亡的患者人数较少，因此未对任何其他模型进行多变量分析。在Cox回归分析中，重复长度被视为一个连续变量，也被视为使用三个不同截止点（中位数，25第个百分位数，75第个百分位数）。
为了调整多重测试并将家庭错误率控制在5%，我们分别对每个疾病亚组和每组类似比较使用了Bonferroni校正(web附录第3页). 所有统计分析均使用SAS（9.2版；SAS Institute，Inc.，Cary，NC，USA）和R统计软件（2.14.0版；R Foundation for statistical Computing，Vienna，Austria）进行。
资金来源的作用
研究发起人在研究设计、数据收集、数据分析、数据解释或报告撰写过程中没有任何角色。通讯作者可以完全访问研究中的所有数据，她对提交发表的决定负有最终责任。
结果
参与者
总共84个C9ORF72型来自梅奥诊所（n=80）或班纳太阳健康研究所（n=4）的扩张载体被纳入Xpansize-72研究(，web附录第1、4、5页). 在这84名受试者中，42名为病理诊断患者，其余42名为临床诊断患者（n=39）或未受影响受试者（n=3）。35名患者被诊断为FTD（21名病理性患者，14名临床性患者），16名患者被确诊为FTD/MND（12名病理性疾病，4名临床性疾病），30名被诊断为MND的患者（9名病理性病例，21名临床性病例），3名患者未受影响，但报告了FTD和MND阳性家族史（收集时年龄：29、31和44岁）。
表1
| 变量 | 总体队列（n=84） | FTD患者（n=35） | FTD/MND患者（n=16） | MND患者（n=30） |
|---|
| 患者特征 |
| 性别（男性） | 43 (51%) | 20 (57%) | 9 (56%) | 14（47%） |
| 发病年龄（岁） | 56·7 (50·5–65·5) | 60·6 (53·0–68·0) | 56·0 (52·0–66·2) | 52·3 (48·5–58·5) |
| 收集时的年龄（年） | 62·0(51·7–71·4) | 65·4 (58·2–74·6) | 63·7 (55·5–71·7) | 54·5 (49·6–61·4) |
| 疾病持续时间（年） | 4·8 (2·5–7·9) | 7·8 (5·9–10·9) | 5·2 (4·0–6·7) | 2·4 (1·3–3·5) |
| 家族史（阳性） | 49 (59%) | 20 (59%) | 9 (56%) | 17 (57%) |
| 诊断方法（病理学） | 42 (50%) | 21 (60%) | 12 (75%) | 9 (30%) |
| 诊断 |
| FTD公司 | 35 (42%) | .. | .. | .. |
| FTD/MND公司 | 16 (19%) | .. | .. | .. |
| MND公司 | 30 (36%) | .. | .. | .. |
| 目前未受影响 | 3 (4%) | .. | .. | .. |
| TDP-43型 |
| 1 | 16 (44%) | 13 (81%) | 3 (27%) | 0 (0%) |
| 2 | 1（3%） | 1 (6%) | 0 (0%) | 0 (0%) |
| 三 | 19 (53%) | 2 (13%) | 8 (73%) | 9 (100%) |
| 野生型等位基因长度 |
| 2 | 53 (63%) | 22 (63%) | 13（81%） | 17 (57%) |
| 5–7 | 15 (18%) | 6 (17%) | 3 (19%) | 4 (13%) |
| 8–17 | 16 (19%) | 7 (20%) | 0 (0%) | 9 (30%) |
| 重复长度（kb） |
| 额叶皮层 | 33·8 (23·5–44·9) | 33·9 (23·1–44·9) | 38·4 (25·6–50·0) | 25·8 (23·9–31·6) |
| 小脑 | 12·3 (11·1–14·3) | 12·2 (10·9–14·9) | 12·6（10·3–15·8） | 12·3 (11·3–13·2) |
| 血液 | 18·6 (13·9–28·1) | 17·5 (7·3–26·5) | 15·2 (8·0–21·0) | 21·4 (17·1–29·4) |
| 重复长度-逐对比较p值 |
| 额叶皮层与小脑 | <0·0001 | <0·0001 | 0·001 | 0·008 |
| 额叶皮层vs.血液 | 0·0001 | 0·009 | 0·005 | 0·28 |
| 小脑vs.血液 | 0.0002 | 0·61 | 0·55 | 0·0002 |
对于所有扩张载体，获取了额叶皮层、小脑和/或血液，这些组织构成了本研究的初步分析。41名患者的额叶皮层可用（21 FTD，11 FTD/MND，9 MND），40名患者的小脑可用（20 FTD，12 FTD/MDD，8 MND。为了评估随时间变化的血样测量结果的再现性，我们纳入了17名受试者的子集，这些受试者有多个时间点（中位数为23·2个月[IQR 11·5–34·8]）。所有扩张型携带者都是无关的，除了两个家庭，每个家庭都接受了四名受试者的调查（一个家庭：两名MND【一名先证者】，两名未受影响；二个家庭：二名FTD，一名FTD/MND（先证者），一名未受感染；web附录第3页).
对于上述样本的一个子集，还从颞皮层（n=18）、顶叶皮层（n=3）、枕皮层（n=3）、脊髓（n=5）、皮肤源性成纤维细胞（n=6）和其他外周组织（n=4，包括脾、心脏、肌肉、胰腺、肝脏和睾丸）中获取DNA。由于这些样品的数量相对较少，因此没有包括在我们的初步分析中。
小型C9ORF72型小脑扩张大小
我们进行了一项彻底的Southern blot研究，以评估C9ORF72型在所有扩展托架中重复扩展长度。我们的研究结果表明，额叶皮层的重复长度（33·8 kb[~5250个重复单位]，IQR 23·5–44·9）显著长于小脑（12·3 kb[~1667个重复单位]IQR 11·1–14·3，p<0.0001，，，web附录第9页). 当单独检查疾病亚组时，这些结果通常是一致的(). 为了确定小脑中相对较小的重复长度是否对该大脑区域具有特异性，我们研究了其他区域。我们评估了18名受试者的颞叶皮层(，web附录第9页)结果显示，颞叶皮层的重复长度（25.7kb[~3900个重复单位]，IQR 22.0-29.3）也显著长于小脑（p<0.0001）。仅对18名同时测量颞皮质和小脑重复长度的患者进行检查时，这一点是一致的（p<0.0001）。当对一系列患者的其他脑区进行比较时，小脑的重复次数仍然最少，其他脑区与额叶皮层相当（n=3，). 对5名患者的脊髓重复长度进行了检查，结果显示重复长度可变，范围从16.9kb到33.5kb(，web附录第9页).
中枢神经系统的重复长度WT=野生型C9ORF72型等位基因(web附录第1页). 在Southern杂交中，额叶皮层表现出相对较长的重复扩张，如10个典型病例所示（P1–P10，a）。小脑的重复扩张通常小于额叶皮层（P11-P20，B）。水平虚线表示23kb和9.4kb。散点图（C）显示了额叶皮层（n=41）、小脑（n=40）和血液（n=50）的重复长度。中间重复长度用灰色线表示。条形图显示了额叶皮层（黑色）、颞叶皮层（浅灰色）和小脑（深灰色），这些组织都可用（n=18，D）。对于两个示例，Southern blot显示了五个大脑区域（P16、P20、E）。图中显示了额叶皮层、脊髓和小脑均可用的患者条形图（n=5，F）。
外周组织重复长度的变化
对50名受试者的血液进行了调查，结果表明，血液中的六核苷酸重复长度（中位数18·6 kb[~2717个重复单位]，IQR 13·9–28·1）明显小于额叶皮层（p=0.0001），但长于小脑（p=0.002，，，). 当该分析按性别、诊断、家族史、发病年龄中位数、采集年龄和病程进行分层时，这些结果相似(web附录第6页). 为了评估血液中重复长度测量值随时间的重复性，我们检查了17名受试者的重复长度，他们在不同的时间点进行了两次测量。在这些受试者中，Lin的一致性相关系数表明具有很高的重复性（0.93[95%CI 0.87-0.99]）。
在其他组织中重复长度在Southern杂交上显示了十名代表性受试者血液中测定的膨胀大小，表明重复长度存在差异（P27–P36，a）。在血液中，重复扩张可以显示出与额叶皮层或小脑大致相同的长度，但也可以显示出意外的长度，如三个示例所示（P16、P20、P19、B）。单个患者的其他组织中也存在重复长度的显著差异（P20，C）。最后一条车道包含负控制。成纤维细胞的重复扩张比血液中的小，并且可以显示多条脆带（P37–P41，D）。
直接比较血液、额叶皮质和小脑中这些组织都可用的受试者（n=8），发现一些患者的情况相似，而其他患者的情况完全不同(，web附录第10页). 我们还评估了血液中三个未受影响的重复扩张载体的重复长度；其中两个显示出比其家族成员（22kb和29kb，web附录第11页). 第三个受试者的扩展数据（7.8 kb）与家庭成员一致（7.2 kb、7.3 kb和9.3 kb，web附录第11页).
在比较五名患者的不同非受累外周组织时，观察到了实质性的变化，其中大多数患者至少有一个组织的重复扩张相对较小，约为3kb(，web附录第12页). 我们还比较了皮肤来源成纤维细胞的重复长度和血液中的重复长度(). 重要的是，虽然血液中存在相对较长的重复扩增和涂片，但同一受试者的成纤维细胞都表现出较小的重复扩增（~7kb）和涂片。
重复长度与临床和病理特征的关系
C9ORF72型FTD、FTD/MND和MND患者在额叶皮质（p=0.27）、小脑（p=0.96）或血液（p=0.10，). 此外，在我们的整个队列中，没有证据表明重复长度与发病年龄或采集年龄之间存在关联(). 然而，在疾病亚组中评估这种关联时，FTD患者的发病年龄与额叶皮层重复长度呈正相关(第页=0.63，p=0.003），收集时的年龄发现类似(第页=0.58，p=0.006，). 对于其他疾病亚组，重复长度与发病年龄或采集年龄之间没有相关性(). 根据性别、TDP-43类型或家族史，重复长度没有明显差异(web附录第7页). 此外，野生型等位基因的长度没有显著相关性().
年龄、存活率和重复长度的差异FTD患者的重复长度与起病年龄（n=20，A）和采集年龄（n~21，B）之间的关系如图所示。每个相关图都会显示一条回归线，以增强视觉显示。根据25第个在整个队列中，小脑的百分位重复长度（11.1kb[~1467个重复单位]）得到证实（n=10≤25第个百分位数，n=28>25第个百分位数，C）。此外，根据25第个FTD患者小脑的百分位重复长度（11.1kb）显示（n=5≤25第个百分位数，n=14>25第个百分位数，D）。疾病亚组间额叶皮层（n=21 FTD，11 FTD/MND，9 MND和E）、小脑（n=20 FTD，12 FTD/MDD，8 MND、F）和血液（n=15 FTD，9 FTD/MDN和23 MND（G））的重复长度无显著差异；样本中位数由实心水平线表示。
表2
重复长度与发病年龄、采集年龄和野生型等位基因长度的关系
| 总体队列 | FTD患者 | FTD/MND患者 | MND患者 |
|---|
|
|---|
| 重复长度与： | 矛兵的第页（95%置信区间） | p值 | 矛兵的第页（95%置信区间） | p值 | 矛兵的第页（95%置信区间） | p值 | 矛兵的第页（95%置信区间） | p值 |
|---|
| 额叶皮层 | n=39 | | n=20 | | n=10 | | n=9 | |
| 发病年龄 | 0·27 (−0·04–0·58) | 0·094年 | 0·63 (0·38–0·88) | 0·003 | −0·28 (−0·88–0·33) | 0·44 | −0·10 (−0·77–0·57) | 0·80 |
| 收集时的年龄 | 0·25 (−0·06–0·56) | 0·12 | 0·58 (0·32–0·83) | 2006年0月 | −0·23 (−0·89–0·44) | 0·53 | 0·05 (−0·58–0·68) | 0·90 |
| 野生型等位基因长度 | −0·03 (−0·31–0·26) | 0·87 | 0·10 (−0·31–0·51) | 0·67 | .. | .. | 0·46 (−0·07–1·00) | 0·21 |
| 小脑 | n=38 | | n=19 | | n=11 | | n=8 | |
| 发病年龄 | 0·24 (−0·06–0·55) | 0·14 | 0·36 (−0·07–0·79) | 0·13 | 0·07 (−0·68–0·86) | 0·83 | −0·07 (−0·75–0·61) | 0·87 |
| 收集时的年龄 | 0·11 (−0·20–0·41) | 0·52 | 0·08 (−0·38–0·55) | 0·73 | 0·05 (−0·78–0·84) | 0·87 | −0·12 (−0·75–0·53) | 0·78 |
| 野生型等位基因长度 | −0·06 (−0·39–0·25) | 0·69 | 0·08 (−0·43–0·59) | 0·74 | .. | .. | −0·27 (−1·00–0·52) | 0·52 |
| 血液 | n=46 | | n=15 | | n=8 | | n=23 | |
| 发病年龄 | 0·07 (−0·21–0·35) | 0·66 | 0·13 (−0·37–0·62) | 0·65 | −0·10 (−0·79–0·59) | 0·82 | 0·25 (−0·18–0·67) | 0·26 |
| 收集时的年龄 | 0·15 (−0·11–0·42) | 0·28 | 0·28 (−0·22–0·78) | 0·32 | −0·02 (−0·56–0·53) | 0·97 | 0·26 (−0·16–0·68) | 0·24 |
| 野生型等位基因长度 | −0·01 (−0·29–0·28) | 0·97 | 0·09 (−0·44–0·62) | 0·75 | .. | .. | −0·16 (−0·55–0·23) | 0·47 |
在本研究的81名患者中，有77名患者（95%）获得了发病日期、死亡日期或发病后的最后随访信息。这些患者的中位随访时间为3.9年（IQR2-6.5），53名患者死亡（69%：额叶皮层39/41[95%]，小脑38/40[95%]，血液21/47[45%]）。
在额叶皮层和血液中，我们没有发现疾病发作后重复长度和存活率之间的显著相关性（模型调整了疾病类型，). 在对整个队列中的发病年龄或收集年龄进行调整后，这些无显著性的发现在额叶皮层没有改变（除了疾病类型外，，web附录第8页)或调整FTD亚组的发病年龄后().
表3
| 总体队列 | FTD患者 | FTD/MND患者 | MND患者 |
|---|
|
|---|
| 重复长度变量 | 心率（95%置信区间） | p值 | 心率（95%置信区间） | p值 | 心率（95%置信区间） | p值 | 心率（95%置信区间） | p值 |
|---|
| 额叶皮层重复长度 | n=39（39例死亡） | n=20（20人死亡） | n=10（10人死亡） | n=9（9人死亡） |
| 连续变量（每增加5 kb） | 0·91 (0·77–1·08) | 0·29 | 0·90 (0·67–1·21) | 0·48 | 0·87 (0·64–1·19) | 0·39 | 0·74 (0·46–1·19) | 0·21 |
| 分类变量（>中值） | 0·96 (0·42–2·18) | 0·93 | 1·14 (0·23–5·53) | 0·87 | 0·55 (0·14–2·22) | 0·40 | 0·78 (0·15–3·99) | 0·77 |
| 分类变量（>25第个百分位数） | 0·83 (0·39–1·78) | 0·63 | 0·76 (0·23–2·50) | 0·65 | .. | .. | .. | .. |
| 分类变量（>75第个百分位数） | 0·84 (0·37–1·95) | 0·69 | 0·86 (0·22–3·37) | 0·82 | .. | .. | .. | .. |
| 小脑重复长度 | n=38（38例死亡） | n=19（19人死亡） | n=11（11例死亡） | n=8（8例死亡） |
| 连续变量（每增加5 kb） | 1·10 (0·66–1·83) | 0·72 | 2·06 (0·70–6·05) | 0·19 | 1·00 (0·52–1·93) | 0·99 | 1·22 (0·11–13·75) | 0·87 |
| 类别变量（>中位数） | 1·62 (0·77–3·40) | 0·20 | 1·90 (0·56–6·47) | 0·30 | 1·21 (0·34–4·38) | 0·77 | 1·77 (0·38–8·20) | 0·47 |
| 分类变量（>25第个百分位数） | 3.27（1.34–7.95） | 0·009 | 4·10 (1.04–27.72) | 0·043 | .. | .. | .. | .. |
| 分类变量（>75第个百分位数） | 0·86 (0·37–2·02) | 0·73 | 1·09 (0·33–3·62) | 0·89 | .. | .. | .. | .. |
| 血液中重复长度 | n=45（21例死亡） | n=14（3人死亡） | n=8（8例死亡） | n=23（10例死亡） |
| 连续变量（每增加5 kb） | 0·98 (0·78–1·23) | 0·84 | 0·41 (0·11–1·59) | 0·20 | 0.93（0.70–1.25） | 0·63 | 1·14 (0·79–1·66) | 0·49 |
| 分类变量（>中值） | 1·00 (0·39–2·60) | 0·99 | 0·44（0·04–5·13） | 0·51 | 0·87 (0·19–3·96) | 0·86 | 1·31 (0·26–6·57) | 0·74 |
| 分类变量（>25第个百分位数） | 0·84 (0·28–2·56) | 0·76 | .. | .. | .. | .. | .. | .. |
| 分类变量（>75第个百分比） | 0·97 (0·29–3·25) | 0·96 | .. | .. | .. | .. | .. | .. |
重要的是，在小脑中，我们观察到重复长度与疾病发病后的存活率之间存在显著关联：重复长度大于25第个百分位（11.1kb，~1467个重复单元）具有生存劣势（HR 3.71，95%CI 1.55–8.88，p=0.003，根据疾病类型调整模型），在我们的FTD亚组中也发现了类似的相关性（HR 5.56，95%CI 1.49–36.21，p=0.008）。对于整个队列，重复扩张时间较长的组的中位生存期为4.8年（IQR 3.0–7.4），而扩张时间较小的组的中位数生存期为7.4年（IQR 6.3–10.9）(). 当校正发病年龄（除总体队列中的疾病类型外）时，趋势略有减弱，但在整个组（HR 3.27，95%CI 1.34-7.95，p=0.009）和FTD亚组（HR4·10，95%CI 1.04-27.72，p=0.043，).
讨论
在Xpansize-72研究中，我们试图确定C9ORF72型在84名受试者的大量组织中重复长度。我们证实在所有病例中都存在己核苷酸重复扩增。在小脑中，与额叶皮层和血液相比，中位数重复长度明显更小。在这些组织中没有观察到重复长度和疾病亚组之间的关联。此外，在FTD患者中，我们证明额叶皮层的长时间重复扩张与发病年龄和采集年龄的增加相关。重要的是，我们是第一个观察到疾病发作后重复长度与存活率之间的关系的人（背景小组的研究）。然而，我们想强调的是，涉及大脑样本的研究C9ORF72型扩张载体总是会受到相对较低功率的阻碍，因此，所有这些发现都应该得到其他小组和荟萃分析研究的验证。
我们的发现C9ORF72型小脑中的重复序列比其他脑区的小，也有报道称其他基因中的重复扩增。例如，对于强直性肌营养不良1型（DM1）患者，DMPK公司小脑皮层的重复扩张比其他各种组织小。11——13对于其他重复性扩张性疾病，如亨廷顿病（HD）、脊髓小脑性共济失调1型（SCA1）、脊髓小脑共济失调3型（SCA3）和齿状红细胞-扁桃体萎缩（DRPLA），也描述了同样的现象。14——20据推测，这种相对较小且稳定的小脑重复扩增是由高百分比的主要未分裂的终末分化细胞引起的，16由于具有较大扩张的神经元细胞的活性降低，16通过转录延伸的差异，21通过组织特异性甲基化水平，22或特定于特定细胞类型或区域的因子，如参与DNA修复的因子。11，14，23的病理检查C9ORF72型重复扩张携带者已经表明小脑含有典型的TDP-43阴性、p62/固碳体-1阳性神经元内含物，24这在大多数其他脑区是不存在的，突出了这种组织类型的独特特征。
当比较同一个体内不同组织的扩展等位基因大小时，发现了体细胞异质性，如DM1和HD的报道。14，25——29重要的是，对于DM1和HD患者，大小异质性取决于采集时的年龄；14，30在我们的研究中也发现了这种依赖性，并且在FTD患者的额叶皮质中表现最为突出。此外，DM1、DRPLA和脊髓小脑共济失调10型（SCA10）患者的发病年龄与扩张大小呈负相关。20，31——33值得注意的是，在我们的FTD队列中，我们观察到相反的效果：GGGCC重复扩张较小的患者发病年龄和收集年龄较低。虽然较小的扩张实际上可能导致发病年龄提前，但另一种解释可能是，这一发现可能是受采集年龄的影响，因为重复大小可能随着个体年龄的增长而延长；为了证实这一假设，有必要对额外的病理性FTD队列进行调查。
我们推测，FTD患者额叶皮层的年龄依赖性效应可能导致该主要受累区域的症状。在额叶皮层，即使考虑到潜在的发病年龄或采集年龄的混杂变量，我们也没有发现重复长度与发病后存活率之间的关联。与额叶皮层相比，小脑的重复长度似乎更稳定，受年龄影响较小。重要的是，我们能够检测到整个队列和FTD亚组小脑中重复长度和存活率之间的关联，小重复扩张导致存活率提高。当校正由于发病年龄差异而产生的可能偏差时，我们的发现仍然显著，因此，小脑重复长度似乎是疾病严重程度的一致预测因子。小脑的这种生存优势，其独特的病理特征，以及相对较小的C9ORF72型该区域的重复大小不受神经元丢失的影响，这表明小脑与其他脑区不同，这些差异背后的因素可能为有希望的新治疗靶点提供线索。
之前的Southern blot研究调查了C9ORF72型神经退行性疾病异质队列患者的重复扩张。7作者对68人进行了Southern杂交C9ORF72型重复扩张携带者（57例神经退行性疾病）及其与发病年龄的相关性(第页=0.38，p=0.02），与我们的FTD患者相比。与发病年龄的相关性可能会产生严重影响，例如，当一名25岁、有FTD/MND阳性家族史的年轻女性去门诊就诊，以确定她是否患有C9ORF72型重复膨胀。她的遗传顾问可能会告诉她，她有一个小的重复扩张，因此，她很可能很快就会出现症状。然而，我们的发现可能指向另一个潜在的解释：她可能因为年轻而有一个小的重复扩张。应进行病理队列的大规模研究和临床队列的纵向研究，以明确脑组织和/或外周组织中重复大小是否随时间变化，这可能为遗传咨询提供非常重要的信息。
以前的Southern印迹论文的研究队列主要由临床诊断的患者组成，其中大多数患者只能获得血液或细胞系。7对血样的主要研究可能解释了为什么他们没有报告与其他临床特征的相关性，例如发病后的存活率。值得注意的是，虽然我们的研究结果表明，血液似乎不是大脑确切重复大小和/或疾病严重程度的可靠标志，但我们希望血液是确定是否存在C9ORF72型在临床环境中重复扩张。
我们进一步证明，皮肤来源的成纤维细胞在Southern印迹上显示出一条小而脆的带，比同一受试者的血液小得多。成纤维细胞中相对较小的重复大小可能是由于具有较小重复大小的细胞的活性增加，从而导致原始异质细胞群中的其他亚群过度生长。这一发现强调，这些细胞中的重复长度似乎不是其他组织类型中重复大小的合适生物标志物。此外，由于体细胞嵌合体似乎依赖于年龄和组织特异性，测量的等位基因大小可能会受到受试者年龄和分析分离DNA的组织的潜在影响，如DM1所示。29这表明，在血液或成纤维细胞中测定的重复长度可能并不代表疾病表型或严重程度的最适当预测因子。根据我们的Xpansize-72研究，只有小脑（一个不受神经元丢失影响的稳定区域）中的六核苷酸重复长度与发病后的存活率相关。
我们的研究有几个局限性。虽然我们能够调查一个独特且相对较大的队列C9ORF72型扩展载体，我们的一些分析包括少量参与者，因此，这些分析应该仔细解释，尤其是因为不能排除II型错误（即假阴性关联）的可能性。与此相关的是，我们病理学队列中纳入的MND患者数量相当少，这使得我们无法得出任何关于MND病人的确切结论。此外，我们目前的设计无法评估较大时间间隔内的变化，也无法评估家庭内的潜在预期。自从研究从患有C9ORF72型扩张总是会受到相对较低功率的阻碍，并且由于不太可能所有组织类型都适用于所有参与者，因此其他小组和荟萃分析研究应该提供更大的研究机构来更彻底地解决这些问题。然而，应该考虑到，本研究中提供的重复长度并不是准确值，但基于我们优化的Southern印迹协议的估计，以及实验室之间的差异（例如Southern-blotting技术）将妨碍直接比较。
背景研究
系统性审查
使用以下搜索词“C9ORF72”搜索Medline（1950年至2013年7月）。所有关于C9ORF72型进行了彻底评估，旨在确定采用Southern印迹技术检测重复大小的研究。没有完全访问权限的论文和非英语写作的论文被排除在外。
解释
这项搜索确定了15篇文章，所有这些文章都集中在血液或细胞系，和/或仅包括少数受试者（n≤3）的脑组织。因此，Xpansize-72研究首次调查了C9ORF72型一个相对较大且特征良好的研究队列中的扩增携带者。此外，这项研究首次表明C9ORF72型疾病发作后的重复长度和存活率。本文所述的研究结果可以帮助研究人员、临床医生和遗传咨询师解开在C9ORF72型扩张携带者，解释诊断性基因检测，并向患者及其家属提供有关重复扩张的更详细信息C9ORF72型。
致谢
导致这些结果的研究得到了NIH拨款R01 NS080882、R01 AG026251、P50 AG 016574和ALS治疗联盟的资助。脑和身体捐赠计划得到了美国国家神经疾病和中风研究所（U24 NS072026帕金森病和相关疾病国家脑和组织资源）、美国国家老龄化研究所（P30 AG19610亚利桑那州阿尔茨海默病核心中心）、，亚利桑那州卫生服务部（合同211002，亚利桑那州阿尔茨海默病研究中心）、亚利桑纳州生物医学研究委员会（合同4001、0011、05-901和1001，亚利桑那州帕金森病联盟）和迈克尔·福克斯帕金森病研究基金会。
脚注
贡献者
MvB、MDJ和RR设计了该研究。MvB和RR协调并管理研究。MvB、MDJ、EN、PHB和MCB进行了实验室实验。MvB和RR分析了数据，并编写了报告。MGH和NND进行了统计分析。MEM、NAF、POB、GS、TGB、KAJ、DSK、RCP、BFB、NRG-R、KBB、LP和DWD从患者或临床数据中获取样本。所有作者都参与了数据的解释和报告的修订。
利益冲突
MDJ和RR拥有一项专利，用于筛选C9ORF72型基因。所有其他作者声明他们没有利益冲突。
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们提供这份手稿的早期版本。在以最终可引用的形式出版之前，手稿将经过文案编辑、排版和校对。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于期刊的所有法律免责声明都适用。
工具书类
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