摘要
与各种细胞活动相关的ATP酶的典型同聚环几何形状如何使其进行机械工作，这在很大程度上尚不清楚。小角度溶液X射线散射、结晶学和电子显微镜（EM）重建显示，部分ATP占用导致细菌增强子结合蛋白（bEBP）NtrC1的七元封闭环重排为不对称的六聚体裂环。负责与σ54–RNA聚合酶相互作用的高度保守且功能关键的GAFTGA环形成螺旋梯。我们认为，系综的分裂引导低聚物内ATP水解，环的不对称性引导ATP酶与σ54和启动子DNA复合体之间的相互作用。转录激活物NtrC1的结构与远距离相关的解旋酶Rho和E1的结构相似，揭示了同源ATP酶的一般机制，即环状几何形状内的复杂变构形成不对称的功能状态，允许这些生物马达对其靶点施加定向力高分子。
关键词：美国汽车协会+ATP酶、机械化学ATP酶、多聚体ATP酶、细菌增强子结合蛋白（bEBP）、σ54依赖性转录、σ54-依赖性转录激活剂
关于与各种细胞活动（AAA）相关的ATP酶的功能机制，这是一个长期存在且基本上没有答案的问题+ATP酶）是：化学上相同的亚基环如何与高度不对称的靶大分子相互作用？回答这个问题非常重要，因为AAA+ATP酶分子机器进行机械工作，重塑来自生命各个王国的细胞中几乎每种类型的大分子。
在细菌中，AAA的一个亚科+被称为细菌增强子结合蛋白（bEBPs）的ATP酶重塑了RNA聚合酶（RNAP）的σ54形式（Eσ54），该形式存在于与启动子DNA的复合物中。这种操作有助于将Eσ54和启动子DNA的封闭的起始前复合物转化为开放的转录活性复合物。这种重塑Eσ54启动子复合物的能力为细菌提供了营养获取、复杂发育程序和病原体毒力基因的适应性表达。功能关键表面“GAFTGA”（或L1）环路和支持L2环路是bEBP区别于其他AAA的标志性特征+ATP酶，调整基本ATP酶折叠以与Eσ54直接相互作用(Lee等人，2003年)。
此前，Eσ54复合物通过与GAFTGA环接触而与bEBP结合，但该低温电子显微镜（cryo-EM）三维（3D）模型缺乏高分辨率细节(Bose等人，2008). 一些bEBP已结晶为六聚体和七聚体，但尚未从这些结构中发现水解机制(Lee等人，2003年；Rappas等人，2005年,2006；Sallai and Tucker 2005年；Batchelor等人，2008年；Chen等人，2010). 我们之前已经证明，ATP而非ADP的结合导致极端嗜热者bEBP-NtrC1的结构发生巨大变化超嗜热菌(Chen等人，2007年,2010). 模拟这些小角度溶液X射线散射（SAXS）数据所需的假定对称性以及ADP和ATP结合晶体结构中的七倍对称性表明，跟踪水解循环中核苷酸状态的关键GAFTGA环协同向上和向下运动(Chen等人，2010年). 这些对称结构的相关性需要进一步探讨，因为从bEBP PspF的研究中有生化证据表明，在功能最佳的bEBP中存在混合核苷酸状态和潜在的结构不对称性(舒马赫等人，2008年；Joly和Buck 2011)。
在本研究中，我们使用等温量热法（ITC）、时间分辨SAXS（TR-SAXS）、平衡SAXS、结晶学和EM单粒子三维重建来监测NtrC1与金属氟化物ATP类似物ADP-BeF结合后构象变化的发展和程度x个或ADP-AlFx个其靶点σ54与启动子DNA结合。结果表明，ATP的部分结合驱动了原生质体从七聚体环到六聚体环的戏剧性重组，其中结合靶的GAFTGA环被提升到螺旋梯孔上方。两种特定的原聚体（环最高和环最低的原聚物）之间存在显著的差异，形成了核苷酸交换的可能位点。该缺口在σ54和启动子DNA的复合物中唯一定向，似乎通过四个接触发生。我们建议转录激活的bEBP根据变构作用在不同亚基上的不同结构和功能特性水解ATP，因为它构建了高度不对称的环。我们提请注意这种不对称环结构与Rho和E1的结构意外相似，两种ATP酶，分别起RNA和DNA转定位酶的作用。最后，我们讨论了三个遥远相关的不对称环之间的这种结构相似性如何部分地回答了介绍性问题：通过准分裂环的形成，化学上相同的亚基的六聚体中的异质性是可用的。利用环原生质体中的这种异质性来提供功能状态的不对称分布，可以使这些生物马达对其目标的不对称大分子施加定向力。
结果
ATP与NtrC1结合的复杂性
如前所述(Chen等人，2007年)在apo NtrC1 ATP酶的组装环形式中添加1–5 mM ATP和ATP类似物会导致其发生大规模构象变化，但添加ADP不会。研究还表明，从接近1mM浓度开始，ATP抑制σ54依赖性激活剂的ATP酶活性。对于NtrC1，这种抑制只是部分的(Chen等人，2010年); 对于PspF，它更完整(Joly等人，2006年；舒马赫等人，2008年). 因此，激活剂似乎对核苷酸浓度高度敏感，因此需要对ATP诱导的结构变化进行更详细的研究，以了解bEBP运动的功能。
最初，我们使用等温滴定量热法（ITC）测量ADP和ATP类似物与NtrC1活化剂结合时释放的热量。ADP结合单调地释放热量，表明存在单一类型的结合位点(; 补充表S1）。与此形成鲜明对比的是，ADP-BeF的结合x个不是单调的，这意味着存在对ATP具有不同亲和力的结合位点(; 补充表S1）。在将ITC数据拟合到标准的一个或两个位点模型时，位点总数是分数，约占总可用结合位点的80%。这种亚化学计量占位可以反映纯化蛋白样品中存在预结合核苷酸或存在非结合ATP酶亚单位，这些亚单位可能是非活性的，也可能是低亲和力的。在ITC实验之后，本征荧光的停流测量显示，与结合ADP-BeF相关的构象变化x个它们是复杂的，与至少三个不同的时间轨迹相关，最快的相位为几毫秒。
核苷酸与NtrC1 ATP酶的结合及其X射线散射反应。(A类)用ADP（闭合正方形）和ADP-BeF滴定的NtrC1的ITC测量x个（打开圆圈）。（实线）分别适用于具有一个或两个结合位点的模型（参数见补充表S1）。(B类)NtrC1与1mM ADP-BeF混合后的时间分辨散射曲线x个为了清晰显示，仅显示从5毫秒到3分钟的每三分之一轮廓；错误仅在插入.apo NtrC1的（绿色）配置文件；（红色）与核苷酸预平衡的蛋白质剖面。(C类)在0.01至0.12 Au的Q矢量范围内的散射强度积分−1(正确的轴线；开放圆）或回转半径(左边轴线；开菱形）与NtrC1与ADP-BeF混合后的时间x个（最终浓度分别为327μM和1 mM）。(D类)与相同C类，但NtrC1与ADP-BeF的指示浓度相平衡x个暴露于X射线之前。
ATP与NtrC1结合后的不同结构中间体
为了分析量热计和荧光实验中发现的相如何与结构变化相关，我们进行了TR-SAXS实验，其中ATP模拟物ADP-BeFx个与apo-NtrC1亚基混合，随后记录散射轮廓的时间轨迹。由于SAXS方法不够灵敏，无法直接检测核苷酸（～0.5 kDa）与NtrC1寡聚体（～210 kDa的寡聚物）的结合，因此散射曲线中观察到的任何变化都必须反映与核苷酸相互作用引起的蛋白质构象差异。我们修改了BioCAT光束线的现有TR-SAXS设置，以将辐射损伤降至最低，从而允许10毫秒样品曝光，以监测毫秒至几分钟的时间范围内散射的变化。由于传统的荧光停流测量表明内在NtrC1荧光的最快变化发生在几毫秒内，我们推测核苷酸结合发生在10毫秒X射线照射之前。NtrC1 ATP酶与ATP模拟物混合后不同时间获得的散射曲线如所示.通过监测所有Q矢量（综合强度）的强度总和来检查曲线()和回转半径（R克)()发现散射剖面在两个时间相关的阶段发生变化。第一阶段发生在0.007º范围内的Q矢量处−1至0.06º−1，反映了R的单峰下降克从～46º到～42º。第二阶段的变化主要出现在0.06 Au范围内的Q矢量上−1至0.10Ω−1，反映了ATP酶结构的小范围变化。我们得出的结论是，apo-NtrC1低聚物对结合ADP-BeF经历了一个先大后小的双相结构反应过程x个。
为了确定双相结构变化是否与核苷酸占有率相关，进行了滴定实验，在收集SAXS数据之前，将可变量的ATP类似物与恒定量的ATP酶亚基平衡。在滴定实验中观察到双峰跃迁()，表示两个变化的信号分布在类似的Q矢量范围内，如时间分辨实验所示。此外，不同Q矢量范围内散射强度的变化对ATP模拟浓度具有明显的依赖性，表明这些变化在不同程度上反映了核苷酸占据状态之间的转换。
ATP结合六聚体中间体的晶体结构
时间分辨和平衡SAXS实验证实，NtrC1系综的结构对结合核苷酸的数量极为敏感，并且环在达到其高占据状态之前至少经过一个中间构象。ADP-BeF的化学计量量略低于x个，我们能够生长衍射晶体。一个散射X射线各向同性为3.6º，一个散射X射线各向异性为3.2×5.2×3.2º（蛋白质数据库[PDB]沉积4LY6和4LZZ分别为晶体“S”和“Q”）(). 在这些晶体中，四个类似的六聚体环被封装成原始正交晶格；然而，每个环的局部特征打破了对称性(; 补充图S1）。与之前描述的NtrC1-ATPase结构域的对称七聚体环不同，所有新发现的六聚体在亚基并列中都表现出显著的不对称性。
NtrC1 ATP酶结构域六聚体中间体的晶体结构。(A类)NtrC1六聚体的俯视图和侧视图；不同颜色的亚基A–F增强了边界。子单元之间的接触表面积（PISA）(Krissinel和Henrick 2007)显示为按所列区域缩放的彩色圆圈（另见补充表S2）。核苷酸结合后NtrC1单体和低聚物重组的细节也参见补充图S1。(B类)NtrC1 ATP酶的七聚体到六聚体转换。在0、200和1000 mM ADP-BeF存在下NtrC1的溶液散射剖面x个CRYSOL计算的散射剖面上的（分别为灰色和黑色轮廓、纯灰色和纯黑色）(Svergun等人，1995年)新晶体的六聚体（黑色虚线）。除非另有说明，否则使用Pymol（Pymol Molecular Graphics System，1.5.0.4版，Schrödinger，LLC）渲染此3D结构和其他插图。
新的六聚体结构被用于计算溶液中的理论散射。将计算的剖面图（基本上彼此相同）与在不同ADP-BeF存在下NtrC1的测量散射进行了比较x个(); 它们与在1 mM ATP类似物存在下观察到的ATP酶散射最匹配。该图还说明了中间结构的存在，显示了在200μM核苷酸中330μM原异构体的部分占据如何足以在低Q矢量下稳定构象变化的第一阶段，而在高散射角下则不稳定第二阶段。
NtrC1六聚体的不对称性
通过检查亚单位的形状、结合囊和亚单位间的界面，可以明显看出显著环不对称的根源。虽然每个环的六个亚基中有五个亚基彼此相似，并且使用结构3M0E中的ATP饱和亚基进行分子替换(Chen等人，2010年)，第六个亚基（标记链F、L、R和X）必须使用ATP酶的亚结构域构建。NtrC1结构1NY5和1NY6的ADP-结合亚单位均不存在(Lee等人2003)给出了分子置换的解决方案。在闭合环的过程中，亚单位1和6之间的接口比其余亚单位对的接口紧密得多（补充图S1）。通过量化接触表面面积证实了这一观察结果(; 补充表S2；Krissinel和Henrick 2007). 此后，我们将其称为“间隙界面”（PDB文件中原型A/F、G/L、M/R和S/X之间）。在NtrC1六聚体周围，亚单位间接触面积的差异为2.7倍至4.2倍，从最高的1600–17002对于亚单位D/E型，最低为400–600Ω2有趣的是，A和F亚基的电子密度比其他环亚基的弱。因此，各残留物的B因子较高。六元环周围B因子的分布如所示图中显示，F亚基的A亚基和α亚域是集合中最灵活或可移动的成分。
NtrC1六聚体的不对称性。(A类)NtrC1六聚体根据B因子着色。(B类)例如，省略图（S晶体，亚基A–F）显示了用于放置核苷酸的NtrC1六聚体活性位点中的配体密度。另请参见补充图S2。(C类)亚基E的活性位点显示模型ADP-BeF三配体及其与P-loop、精氨酸指R299和Walker B残基的相互作用。
省略中的地图（2楼o（o）–1Fc；0.125当量/年三或1.7 RMSD）和补充图S3A（2Fo（o）–1Fc；0.177当量/年三或2.4 RMSD）总结了两种晶体的四个六聚体环中的核苷酸密度。补充图S3A显示了八个六聚体环之间活性位点中存在的配体密度的主要差异。ADP-BeF的存在很好地模拟了一些密度三（例如，参见)，其他则提示ADP，而一些似乎被弱占据或以apo状态存在。占用不足的亚单位包含一个重新定位的P环。根据间隙侧面亚基中核苷酸的电子密度强度，我们将六聚体环分为1型（S晶体，亚基F或R缺乏密度）、2型（S结晶，亚基L或X具有中等密度）、3型（Q晶体，亚单位A和M具有中等密度，和类型4（Q晶体，亚基G和S缺乏密度）。注意，缺乏核苷酸密度的亚基总是与环中的间隙相邻，但在S和Q晶体中与间隙的相对侧邻接。同样，B因子值表明，核苷酸结合的紧密性因界面而异，并可能反映间隙界面是否缺少核苷酸（如1型和4型环），或是否由ADP或ATP类似物结合（如2型和3型环）。除了它们的传感器2螺旋外，α-螺旋结构域的主链轨迹与核苷酸的存在或不存在相关：在S晶体中，在核苷酸结合的亚基和链F、L、R和X的亚基之间观察到不同的路径。这一观察可能揭示了α结构域内对核苷酸结合敏感的刚体构象变化。
将精细结构与先前发现的ADP结合（1NY6）和ATP结合（3M0E）结构进行比较，发现两个显著差异。首先，通过相对于环平面方向的微小偏移，将原单体包装为六聚体，而不是七聚体（补充图S1、S2）。这种转移的连续进行导致L1和L2干环从亚单位a向下螺旋级联到亚单位F(; 补充图S1B）。其次，使用RAPIDO和DynDom对原聚体结构进行分析，发现了刚体运动，如图所示(Hayward等人，1997年；海沃德和贝伦德森1998；2008年莫斯科和施耐德；Mosca等人，2008年). 这种运动与ADP-和ATP-束缚七头肌比较后观察到的刚体横摇非常相似(Chen等人，2010年)并包括功能性杆环的旋转()相对于亚基A–E（或其他环中的等效物），在亚基F中。对于S晶体的亚单位L和X，刚体2远离刚体1的旋转程度不如S晶体的子单位F和R以及Q晶体的F、L、R和X的旋转程度极端。每个环的前五个亚基具有相似的构象，全原子叠加的根平方偏差（RMSD）在0.49º至0.94º之间变化（补充表S3）。这些构象也与Walker B突变体E239A七肽环中存在的ATP-结合亚基的构象非常相似（补充表S3）。
NtrC1活化剂功能孔环的螺旋排列。(A类)围绕NtrC1六聚体的孔的L1（GAFTGA）和L2环；颜色与中的相同A类。电子密度在1.5σ处呈等高线。(B类)回路L1和L2的左手螺旋楼梯，子单元A和F的标签说明了标高的变化。(C类)亚基F和A的GAFTGA环(D类)亚单位A与S晶体结构的F、L、R和X重叠，显示了茎环L1和L2的刚体滚动。亚单位A（基本上与所有四个环中的亚单位B–E相同）遵循3M0E的ATP结合状态，而亚单位F和R遵循1NY6亚单位L和X的ADP结合状态，它们平衡在两个极端之间。在Q晶体结构中，每个环的前五个亚基处于类ATP状态，亚基F、L、R和X类似于S晶体中的F和R。
环不对称引导与σ54和启动子DNA的相互作用
根据新晶体结构计算的NtrC1散射曲线与实验测量的部分被ATP类似物占据的蛋白质散射曲线之间的良好拟合表明溶液中存在不对称六聚体环。为了确定六聚体NtrC1环的不对称性对与σ54和启动子DNA的相互作用是否重要，我们从透射电镜和单粒子分析中导出了NtrC1 ATP酶、σ54以及启动子DNA（MW～256kDa）负染三元复合物的3D重建，该复合物由ADP-AlF稳定x个.目视检查类平均值并以24º的分辨率重建显示ATP酶环中存在缺口(; 补充电影S1）。可以在ATP酶上方观察到额外的密度，推测是σ54和启动子DNA。三维重建的重投影与类平均值之间的一致性证实了粒子之间存在大量独特的方向，从而验证了模型。重要的是，在参考自由类平均值中也可以观察到环中的间隙()。
ATP酶晶体结构的亚单位A/F间隙在ATP酶、σ54和启动子DNA复合物的3D EM重建中持续存在。(A类)ATP酶、σ54和启动子DNA复合物的3D EM重建。ATP酶（粉红色）的密度与σ54和启动子DNA的密度不同。ATP酶的六聚体晶体结构（颜色如)符合其EM密度；箭头指向两个结构中对齐的间隙。(B类)EM密度在阈值处的等值线仅显示与ATP酶相对应的密度。(C类)ATP酶和σ54启动子DNA之间的四个接触点。放大触点1以显示亚单位A（红丝带）和σ54/启动子DNA的GAFTGA环。(D类)选定的正向投影(顶部行）和相应对齐粒子的平均值(中间的行）是在上面外观相似的无参考类平均值(底部行）；黄色圆点定位ATP酶环中的间隙。另请参阅补充图S3和补充电影。
根据ATP酶分子包膜与电子密度图的最高互相关，将NtrC1的分裂六聚体环拟合到重构的环状密度中。NtrC1六聚体的间隙区域在EM图中也缺乏密度（亚基A和F）(; 补充电影S2）。观察到的SAXS、EM和晶体数据的相关性与溶液和晶格中的某些区域是灵活的一致。最有趣的是，EM重建揭示了ATP酶的四个潜在区域，它们与σ54/启动子DNA形成两种类型的接触(; 补充电影S1）：具有功能性GAFTGA包含回路和其他子单元的接口。对于环，这些环包括原聚体A的GAFTGA环和原聚体E的环区上方。虽然激活子亚基A的含有GAFTGA的环在晶体结构中定义最差，但它似乎通过相互作用伴侣σ54/启动子的存在而稳定。第二种类型的接触出现在原体C和D以及原体E和F的α-螺旋和α/β亚结构域之间的界面上。结合起来，接触既桥接A/F间隙，又用亚基从间隙穿过环锚定靶的远处部分。虽然很清楚，但复合物σ54/启动子部分的密度不如ATP酶的密度明确。这可能是由于该复合体中缺乏其余RNAP引起的。
讨论
ATP的饱和度决定了NtrC1 ATP酶激活剂的高阶结构
我们先前的生化和结构分析表明两件事：（1）载脂蛋白和ADP饱和环形成类似的七聚体环（SAXS数据Chen等人，2007年)（2）通过高度协同的核苷酸结合和水解，可以避免交替结合到ATP或ADP的相邻亚单位之间的界面发生强烈冲突(Chen等人，2010年). 在本研究中，我们发现，随着ATP类似物的结合逐渐驱动七聚体形成分裂环六聚体，这些环结构的对称性被破坏。载脂蛋白NtrC1 ATP酶域与ATP类似物相互作用时的热释放双峰曲线实际上与ATP结合的强负协同性一致。也许是一组高亲和力结合事件促使环采用一种构象，这种构象对超过约三分之二饱和度的结合强加了负合作性。对DnaB进行了类似的观察大肠杆菌，另一种多聚ATP酶(Bujalowski和Klonowska 1993年)，最近公布了EBP-PspF的质谱数据，这些数据与七聚体EBP环在被核苷酸部分饱和时转化为六聚体EBP环非常一致(Zhang等人，2013年). 金属氟化物ATP类似物的NtrC1结合的SAXS数据表明，连续的结合事件产生一系列结构重排，包括低聚物的化学计量和亚结构域运动的变化。结果与以下假设一致，即EBP-ATP酶低聚物表现为一个亚单位的集成集合，其与核苷酸的相对占用强烈影响其相邻亚单位，正如先前对其他多聚ATP酶的建议一样(Sanders等人，2007年；Glynn等人，2012年)。
由于σ54仅在NtrC1与ATP类似物而非ADP结合时才能观察到与激活剂的结合，因此我们假设调节协同性的结构变化主要是由γ-磷酸盐的存在引起的(Chen等人，2007年,2010). 这种磷酸盐先前被证明在一个亚单位上的ATP结合间隙和环中相邻伙伴的精氨酸指（NtrC1中的R299）之间架起桥梁(Chen等人，2010年). 虽然我们在这里显示的开口六聚体环的电子密度来自低分辨率衍射数据，但它与亚基之间的拟议接触一致(). 因此，任何ATP结合事件都会破坏载脂蛋白七肽环的对称性。不对称性反过来会通过协同核苷酸结合影响剩余未被占据的结合位点的性质。虽然需要高分辨率数据进行确认，但检查γ-BeF周围的活性位点的电子密度三β-磷酸、精氨酸指、传感器1和2以及Walker谷氨酸盐（NtrC1的R299、N280、R357、E238和E239）表明每个亚基具有独特的特征，与它们具有独特的功能作用相一致（补充图S3B）。七肽的存在可能是截断NtrC1蛋白以仅产生ATP酶结构域的伪影。在全长NtrC1中，七聚体环和六聚体环之间的平衡可能会受到N端双组分受体和C端结构域的影响。质谱数据表明，在NtrC4全长结构中，六聚体比七聚体更受青睐，这是一种与NtrC1相关的EBP(Batchelor等人，2009年). 受体结构域形成稳定的同二聚体，C末端DNA结合结构域指导四个原体在“增强子”上串联阵列的组装(Doucleff等人，2005年；Vidangos等人，2013年). 然而，这种潜在的伪影强调了EBP分裂六聚体环的稳定性，并没有减少这种结构状态下γ-磷酸盐定向不对称的证据。
NtrC1激活剂和六聚螺旋酶的惊人相似性
引人注目的是，在来自不同家族的其他几种环状ATP酶中发现了孔环的阶梯状排列：来自大肠杆菌牛乳头瘤病毒的E1解旋酶和来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Enemark和Joshua-Tor 2006；汤姆森和伯杰2009；Itsathitphaisarn等人，2012年). 在这些不同类别的ATP酶中，这种相似的结构特征的存在特别有趣，因为它们的拓扑结构存在明显的差异，从而导致孔环的不同起源(). 这表明，共同的结构特征发生了趋同演化，这些结构特征维持着截然不同的功能；bEBP如NtrC1重塑与启动子DNA紧密结合的σ54–RNAP全酶，而E1和DnaB解旋酶解开DNA，Rho因子沿RNA链移位。
具有不同拓扑结构的不同同源ATP酶中功能环排列的结构相似性。(A类)3D模型和描述结构褶皱的卡通中显示了每个ATP酶的功能循环。NtrC1的环路L1（修饰H2插入）在其尖端包含用于结合σ54的“GAFTGA”基序。使用的结构：E1解旋酶为2GXA，Rho因子为3ICE(Enemark和Joshua-Tor 2006；汤姆森和伯杰2009)(B类)α螺旋（橙色）通过面向中央通道的T217残基与NtrC1的孔相互作用的假设模型。另请参见补充图S4。
NtrC1、E1和Rho结构的统一特征包括孔环的阶梯状排列、六聚环的整体平面性、一个半开放的原聚体/原聚体界面以及ATP酶环周围蛋白质和核苷酸的B因子的不对称分布。DnaB解旋酶显示出大部分这些特征，除了它的亚基以螺旋移位的方式组织，打破了其他ATP酶亚基的平面排列。MCM解旋酶和动力蛋白ATP酶结构域也清楚地显示了相邻亚单位之间的松散或开放界面(Carter等人，2011年；Lyubimov等人，2012年). 多聚ATP酶这种开放和不对称结构的一个更遥远和极端的版本出现在钳装五聚体中(Kelch等人，2011年). 所有这些ATP酶还显示包含具有不同核苷酸亲和力和功能的结合位点。
拓扑开放六聚体作为一种普遍趋势？
多重ATP酶是否有一个通用机制来调用拓扑闭合环的打开？Sauer小组最近的工作(Glynn等人，2012年)表明ClpX-ATP酶亚基与相邻亚基之间的“二硫键”交联不会显著破坏酶的功能。然而，具有两个二硫键的亚基的双重装订降低了ClpX底物去折叠的过程性。使用类似的交联方法，Tsai组(Biter等人，2012年)表明ClpB-ATPase不需要“解聚”即可实现其复性活性。这种证据可以用两种方式解释。Glynn等人（2012年）提出ClpX的α/β和α亚结构域之间的连接物的性质允许构象变化，这对功能至关重要，但这种变化可以发生在共价闭合环中。而在双股ClpX实验中看到的部分功能保留可能反映不需要开环，它还可以反映在共价闭合拓扑中发生的亚基-亚基结合（即“开环”）的减少，但不是全部损失。等效接头对EBP功能很重要，因为其中的氨基酸取代可以使ATP水解与转录激活解耦(Xu等人，2004年). 确实，在晶体中没有观察到拓扑开放的Clp型ATP酶（除了那些由于连续螺旋堆积而导致的，其中任何给定的六聚体都可以被视为“拓扑开放”）。在这项研究之前，NtrC1环也是如此；它们被视为闭合的扁平环。仅在ADP-BeF的过饱和量存在时x个是否观察到分裂环形式。也许晶体学提供的结构的单一快照尚未揭示所有AAA的重要中间结构+电机。因此，螺旋酶和bEBP激活剂可能使用开放或螺旋状态发挥作用，而蛋白酶和伴侣相关的ATP酶倾向于低于六倍对称性的闭合拓扑结构（例如，参见Glynn等人，2009年). 似乎可以肯定的是，所有的多聚ATP酶都需要打破旋转对称性或降低旋转对称性才能有效发挥作用。这一要求可能解释了通过使bEBPs PspF和NtrC1中的ATP饱和而抑制ATP酶活性的原因(舒马赫等人，2008年；Chen等人，2010年)。
迄今为止积累的许多ATP酶的大量数据表明，每种寡聚ATP酶可能以各种状态存在。不同的ATP酶可能使用不同的状态集来发挥功能，但每个ATP酶可能会调用一般多步骤机制中的大多数几何结构，这一点也有可能得到解释。
NtrC1 ATP酶的间隙界面作为核苷酸释放位点
本文报道的结果开始揭示协同核苷酸结合变构操纵bEBP-ATP酶低聚物结构的方式。显著的环协同性的一个重要结果可能是在活性位点之间分配ATP水解的独特倾向。我们认为环周围蛋白质和核苷酸的B因子的不同分布是这种位置依赖性作用的证据。由亚基A和F形成的唯一松散结合囊可作为核苷酸产物和反应物的出入口。对于EBP，亚单位A和B之间的结合亲和力也很弱，可能在ATP酶/核苷酸动力学中发挥作用。此前，基于六聚体环周围的核苷酸结合囊结构，提出了一个类似的Rho和E1解旋酶模型(Enemark和Joshua-Tor 2006；汤姆森和伯杰2009). 另一个考虑来自对各种AAA ATP酶的一些生化研究(Donmez和Patel 2008；Wang等人，2009年；亚当斯和里德2012). 这些研究表明，ATP水解的速率限制步骤是磷酸释放，表明产物状态需要ATP酶与磷酸阴离子而不是ADP之间的紧密结合。需要建立开放六聚体和bEBP活化剂的其他可能中间体的高分辨率3D结构，以阐明该机制的这一方面。
核苷酸状态足以稳定阶梯状GAFTGA环
NtrC1激活物结构的分裂环性质完全由环的核苷酸状态决定，而不需要与其靶底物σ54和启动子DNA进行任何额外的相互作用。该观察结果与NtrC1溶液散射一致，因此可以排除晶体堆积产生的可能伪影。在没有大分子底物的情况下形成的具有阶梯状孔环排列的同源ATP酶的唯一另一个例子是牛乳头状瘤病毒解旋酶E1的脱辅基晶体结构(Sanders等人，2007年). 它是在存在磷酸盐和镁离子的情况下结晶的，磷酸盐和镁存在于晶格中E1六聚体的结合囊中。研究人员将E1的明显不对称性归因于apo同源低聚物的内在性质，但这种不对称性可能是由磷酸盐和镁引起的2+离子与活性位点结合。如果是这样的话，核苷酸结合通常会出现γ-磷酸，从而引起大规模变化，从而显著扭曲同源环状ATP酶的旋转对称性。这一假设并不排除ATP酶与其大分子底物或辅助因子结合可增强、稳定或消除这种核苷酸诱导的不对称性的可能性。
NtrC1六聚体的不对称性指导其与靶σ54蛋白的相互作用
螺旋酶与核酸的相互作用被认为是由其阶梯环与底物螺旋性质之间的匹配所辅助的。环的开放也被假设为DNA或RNA链通过ATP酶马达启动底物移位的入口点。在bEBPs的情况下，人们不认为ATP酶像解旋酶一样释放启动子DNA；相反，ATP酶被认为通过重塑σ54因子作用于σ54–RNAP全酶(Wedel等人，1990年；Wang等人，1995年；Wedel和Kustu 1995). 该领域的一个主要问题是，bEBP同源异构体如何在σ54蛋白-RNAP复合物上进行这种机械工作。众所周知，完整的GAFTGA环对于ATP酶结合σ54蛋白和开放复合物形成的后续步骤是绝对必要的。此外，Buck和Zhang小组(Joly和Buck 2011；Zhang等人，2012年)提供了令人信服的结果，即在交互中涉及一个以上的GAFTGA循环。
此处显示的环不对称性表明，每个阶梯型GAFTGA环都可以被视为一个独特的绑定环境。一个简单的假设是，这些环特征的唯一性引导了与σ54的相互作用。我们的EM数据显示确实如此，揭示了ATP酶σ54和启动子DNA之间的特殊几何结构。在这种几何结构中，σ54/启动子复合物与一些暴露的GAFTGA环以及一些亚单位间界面形成不对称的横向接触(). 虽然之前观察到σ54蛋白可以与bEBP的其他寡聚状态结合(Rappas等人，2005年；Chen等人，2010年)，我们认为不对称六聚体为指导蛋白质-蛋白质相互作用提供了独特的结构。我们的NtrC1 ATP酶与σ54启动子RNAP复合物的初步EM数据表明存在类似的不对称NtrC1六聚体（S Chowdhury，S DeCarlo，and BT Nixon，unpubl.）。先前报道的σ54–RNAP与另一种bEBP蛋白PspF复合物的EM结构中，ATP酶激活物中也有明显的“缺口”（EMDataBank EMD 1566）（补充图S5；Bose等人，2008)。
在之前和最近的PspF研究中，研究人员建议σ54–RNAP复合物和激活剂之间有两个接触点(Rappas等人，2005年；Zhang等人，2012年). 很有意思的是，是否有第二个与由环中的间隙创建的bEBP进行特定交互的站点。间隙接口还创建了一个新的可用绑定接口。最近DnaB解旋酶非平面六聚体状态的晶体结构表明，其开环导致N末端DnaB结构域与邻近间隙的ATP酶亚基广泛接触；nongap亚基没有这种相互作用(Itsathitphaisarn等人，2012年). 在转录起始期间，bEBP系综也可能发生重大重排。
GAFTGA环和中心孔的作用
如上所述，NtrC1转录激活剂的新结构类似于将ssDNA或RNA底物穿过其各自中心孔的解旋酶的结构。此外，其他同源多聚体ATP酶（如ClpX）通过其毛孔将多肽底物穿过。因此，bEBP激活剂可能利用GAFTGA环将σ54或启动子DNA的一部分穿过中央孔。
广泛的突变研究表明，bEBP通过与区域I（蛋白质的N末端结构域）的相互作用重塑σ54蛋白质(Gonzalez等人，1998年；Bordes等人，2004年；Dago等人，2007年；舒马赫等人，2007年；Zhang等人，2009年). 区域I横跨约50个氨基酸，预计这些氨基酸将形成α螺旋；它具有两个短基序，建议与ATP酶的GAFTGA基序直接接触(Merrick 1993年；Zhang等人，2012年). 六聚体系综中NtrC1孔的尺寸接近蛋白质螺旋的直径，因此大到足以通过区域I通道(). σ54片段的核磁共振（NMR）研究超嗜热菌由Wemmer实验室解释(Hong等人，2009年)表明拉动区域I可以触发结合RNAP核心的σ54部分的重折叠。Zhang和Buck之前的研究(Bose等人，2008)被解释为σ54的核心结合部分物理性阻断RNAP活性位点的证据。然而，在本研究中提出的EM模型和早些时候发布的EM数据中(Rappas等人，2005年；Chen等人，2010年)bEBP环的孔隙中没有可观察到的密度。新数据表明，这种拉伸将从与开口环非对称表面的特定部分结合开始。随后可能会出现螺纹，也可能会从表面发生拉伸。动力蛋白ATP酶存在横向作用而非穿线作用的先例。它的环被认为是在位于动力蛋白环一侧的尾部结构域的帮助下对动力蛋白分子的柄部施加力，与环的两个或三个ATP酶结构域相互作用(Carter等人，2011年). 蛋白质底物和尾部之间的这种横向相互作用与针对解旋酶和ClpX和ClpB展开酶提出的中心螺纹聚合物模型有很大不同。为了区分这些可能性，需要建立bEBP激活剂与σ54底物复合物的高分辨率结构。
总之，我们对NtrC1-ATPase结构域的研究强调了AAA固有的封装化学计量学和界面角的灵活性+ATP酶。这项工作表明，变构路径对ATP的γ-磷酸的存在或缺失敏感，如何为同源ATP酶环提供有序的不对称性，即不对称性，赋予每个亚单位独特的身份，从而赋予其独特的功能，利用这些亚单位向不对称靶大分子传递机械功。
材料和方法
补充材料中给出了样品制备和实验的详细信息。
信息技术委员会
使用Microcal VP-ITC量热计（GE Healthcare）在25°C下分析核苷酸与NtrC1的结合。脱气后，将碱性缓冲液中的200μM NtrC1溶液（20 mM TrisHCl，pH 7.9，5%[w/v]甘油，200 mM KCl）装入细胞，并用核苷酸溶液（5 mM）填充注射器。
静态SAXS测量
在BioCAT光束线（ID18）上进行X射线散射实验(Fischetti等人，2004年)高级光子源。溶液通过毛细管并暴露于X射线束。对于滴定，将不同量的ADP置于恒定浓度的NtrC1蛋白质（330μM蛋白质，在添加5 mM TCEP的碱性缓冲液中）和盐BeCl的存在下2（1 mM）、氟化钠（8 mM）和氯化镁2（5毫微米）。
停止流动SAXS
在光束路径中插入Biolog停止流动装置，以便X射线通过反应杯，反应杯中含有老化样品。散射由Aviex CCD相机或采用CMOS混合像素技术构建的Pilatus探测器记录。
结晶、数据收集和精炼
在ADP-BeF存在下筛选NtrC1蛋白的结晶条件x个和镁2+使用Crystal screens I/II（Hampton Research）在油下。在含有300–500μM ADP-BeF的20%乙二醇中获得最佳晶体x个在初始蛋白质溶液中（20 g/L）。数据是在先进光源的光束线8.3.1和国家同步加速器光源的X29处收集的。使用CrystalClear软件（Rigaku）处理数据。对于这两种晶体，通过用ATP饱和结构的亚基（PDB 3M0E）作为搜索模型（Phaser）进行分子置换来发现初始相位估计(Mccoy等人，2007年). CNS首先进行精炼(Brunger 2007年；Schroder等人，2010年)然后使用Phenix中的参考模型约束(Adams等人，2010年)和库特(埃姆斯利和考坦2004). 处理金属氟化物类似物、结晶和衍射数据初始处理的详细信息在其他地方进行了描述(Sysoeva等人，2013年)。
相对长度单位
三元配合物含有NtrC1的ATP酶结构域(超嗜热菌), σ54 (肺炎克雷伯菌)和36碱基对（bp）启动子DNA(草木犀中华根瘤菌nifH). 成分在添加1 mM ADP-AlF的基础缓冲液中混合x个，并通过尺寸排除色谱纯化复合物（Superdex200，GE Healthcare）。将纯化的络合物吸附在辉光放电的碳涂层格栅上，并用甲酸铀酰染色。在JEOL2100F透射电子显微镜上获得低剂量图像。使用XMIPP进行了粒子拾取、基于最大似然的二维分类和使用随机圆锥倾斜的初始模型构建(Marabini等人，1996年). SPARX的ISAC程序(Yang等人，2012年)提供了未分类数据的无参考分类。通过迭代投影匹配和使用EMAN2和SPARX库的反投影，将初始RCT重建细化到24º分辨率（傅里叶壳层相关性为0.5）(Hohn等人，2007年). 加州大学旧金山分校Chimera对模型进行了分析(Pettersen等人，2004年)。
接入号码
原子坐标和结构因子以ID码4LY6（S晶体）和4LZZ（Q晶体）存放在PDB中，三元配合物的EM模型以登录码EMD5698存放在EMDataBank中。
