雷帕霉素调节生化代谢产物

雷帕霉素处理可增加糖酵解中间体

葡萄糖(图1A)以及大多数糖酵解中间体，如葡萄糖-6-磷酸（G6P，图1B)，果糖-6-磷酸(图1C)1,6-二磷酸果糖（与1,6-二磷酸盐葡萄糖呈等压线，图1D)，二羟丙酮磷酸（DHAP，图1E)和3-磷酸甘油酸(图1F)，wt和TAp73均增加^−/−雷帕霉素处理后的MEFs与未处理样品的比较。糖酵解中间产物的这种变化在48小时时最为显著。相反，wt和TAp73中的乳酸都降低了^−/−雷帕霉素处理48h的细胞与未处理细胞的比较(图1G).

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图1。糖酵解代谢产物。糖酵解是将葡萄糖转化为丙酮酸的几乎普遍的途径。在需氧生物中，丙酮酸盐进入线粒体，在那里被O完全氧化₂转换为CO₂和H₂O及其势能作为ATP基本保守。在缺乏足够氧气的情况下，动物体内的丙酮酸被NADH还原为乳酸。雷帕霉素暴露24或48小时对糖酵解代谢产物葡萄糖的影响(A类)，葡萄糖-6-磷酸(B类)，果糖-6-磷酸(C类)，3-二磷酸异戊酯，葡萄糖-1,6-二磷酸，肌醇-1(D类)，二羟丙酮磷酸酯(E类)，3-磷酸甘油酯(F类)，乳酸(G公司). 有关技术协议，请参见“材料和方法”。相对值显示在控件上。左侧面板：蓝色，显示野生型MEF；右侧面板：红色，显示TAp73^−/−MEF公司。WT，野生型；MEF；KO、TAp73淘汰赛MEF；U、 未经处理；R、 雷帕霉素；S、 饥饿。

这些变化可能表明糖酵解受阻或葡萄糖摄取和代谢增加。

雷帕霉素增加48小时戊糖磷酸途径的活性

为了进一步了解雷帕霉素治疗后葡萄糖的去向，我们研究了TCA循环和磷酸戊糖途径中间产物的变化。虽然雷帕霉素对TCA循环活性影响不大，但似乎对磷酸戊糖途径活性有很大影响。葡萄糖磷酸化为G6P后，G6P要么继续通过糖酵解，要么被分流到戊糖磷酸途径。在戊糖磷酸途径中，G6P转化为6-磷酸葡萄糖酸。将G6P转化为6-磷酸葡萄糖酸盐会导致NADPH水平增加，并可能通过后续生成的5-磷酸核糖增加核苷酸生物合成。因此，戊糖磷酸途径活性增加可能是为了避开氧化应激增加的时期或合成代谢/促生长活性增加的时期。在我们的样品中，戊糖磷酸途径中间体核酮糖-5-磷酸（与5-磷酸木酮糖呈等压线，图2A)，5-磷酸核糖(图2B)和核糖(图2C)雷帕霉素治疗48小时后，wt和TAp73均显著增加^−/−细胞。戊糖磷酸途径中间产物的这些变化可能表明，无论基因型如何，雷帕霉素治疗都会导致葡萄糖摄取增加。由于雷帕霉素治疗后氧化应激可能增加或出于合成代谢目的，葡萄糖可以被磷酸化并分流到戊糖磷酸途径。

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图2。戊糖磷酸途径。戊糖磷酸途径是合成代谢过程所需的NADPH的主要来源，也负责生产核糖-5-磷酸，核糖是核酸的重要组成部分。最后，该途径还可以用于产生甘油醛-3-磷酸，然后将其加入克雷布斯循环和电子传输链，从而获得能量。雷帕霉素暴露24或48小时对异丙基核糖-5-磷酸、木酮糖-5-磷酸的影响(A类)，核糖-5-磷酸(B类)，核糖(C类). 请参见图1用于颜色和图例代码。

由于磷酸戊糖途径可以反馈到6-磷酸果糖的糖酵解中，这可能解释了为什么在雷帕霉素处理48小时后，wt和TAp73中随后的糖酵素中间产物也增加了^−/−与其他处理和时间点进行比较。

雷帕霉素影响蛋氨酸代谢

蛋氨酸代谢为主要的甲基供体S-腺苷蛋氨酸（SAM）。利用SAM进行甲基化事件导致S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）增加，SAH进一步代谢为同型半月氨酸。同型半胱氨酸既可以通过转硫途径生成半胱氨酸，用于牛磺酸或谷胱甘肽的生物合成，也可以通过与5-甲基四氢叶酸（5MeTHF）反应的转甲基化途径生成蛋氨酸和THF。蛋氨酸代谢途径的调节基于蛋氨酸和半胱氨酸的可用性。如果这两种氨基酸的含量都足够，SAM就会积累，并对胱硫醚合成酶产生积极影响，从而促进半胱氨酸和α-酮丁酸的生成（这两种物质都是生糖的）。然而，如果蛋氨酸缺乏，SAM只会少量形成，从而限制胱硫醚合成酶的活性。在这项研究中，雷帕霉素治疗显著提高了蛋氨酸水平(图3A)而雷帕霉素似乎对SAM或SAH水平没有影响(图3B和C,分别）。相反，5MeTHF、同型半胱氨酸和半胱氨酸水平较低(图3D-F)在wt和TAp73中检测到^−/−雷帕霉素处理的细胞，通常在雷帕霉素48小时时更明显。尽管这些与牛磺酸生物合成相关的生化物质（半胱氨酸亚硫酸钠、次黄嘌呤和牛磺酸）随着时间的推移发生了变化，但在给定时间点，雷帕霉素处理和未处理的雷帕霉素在wt和TAp73中的水平几乎没有差异^−/−单元格(图S2A-C). 因此，雷帕霉素处理48小时的细胞中半胱氨酸水平较低，无论是重量还是TAp73^−/−MEF似乎不是由于半胱氨酸转向牛磺酸生物合成所致。

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图3。蛋氨酸代谢。蛋氨酸代谢由两条途径组成，即蛋氨酸循环和转硫序列。这些途径与两者共有3种常见反应，包括蛋氨酸转化为S-腺苷蛋氨酸（SAM），SAM在不同的转甲基化反应中的利用，产生甲基化产物和S-腺苷同型半胱氨酸（SAH），以及SAH裂解生成同型半氨酸和腺苷。由同型半胱氨酸和丝氨酸产生半胱氨酸的转硫反应也产生α-酮丁酸，后者首先转化为丙酰基辅酶a，然后通过三步过程转化为琥珀酰基辅酸。雷帕霉素暴露24或48小时对蛋氨酸的影响(A类)、SAM(B类)，撒哈拉以南(C类)，5-甲基四氢叶酸(D类)，同型半胱氨酸(E类)，半胱氨酸(F类). 请参见图1用于颜色和图例代码。

所述的蛋氨酸代谢变化表明，48小时雷帕霉素治疗可能会增加同型半胱氨酸向蛋氨酸的转甲基化。雷帕霉素对透硫作用的影响通过谷胱甘肽代谢途径的成分反映出来。

雷帕霉素治疗对谷胱甘肽合成的影响

谷胱甘肽是细胞中主要的抗氧化途径。虽然还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘苷（GSSG）的变化并不能明确表明雷帕霉素引起的氧化还原状态改变(图S3A和B)，其他标记物支持雷帕霉素治疗后的氧化应激，提示雷帕霉素处理的wt和TAp73中谷胱甘肽的利用可能增加^−/−半胱氨酸-谷胱甘肽二硫化物水平较高的细胞(图4A)以及与谷胱甘肽转换相关的生化物质，如半胱氨酸甘氨酸(图4B)，γ-谷氨酸氨基酸(图4C和D)和5-氧丙烷(图4E)与未经处理的细胞相比。此外，在谷胱甘肽生物合成增加的时期（例如氧化应激增加），半胱氨酸水平可能会耗尽或大大降低(图4F). 半胱氨酸水平的耗尽或降低随后会导致γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶与2-氨基丁酸反应(图S3C)或丙氨酸(图S3D). 用2-氨基丁酸或丙氨酸取代半胱氨酸，分别导致合成眼氨酸或去甲眼氨酸。双眼肌(图4G)和去甲眼药(图4H)体重和TAp73均显著增加^−/−雷帕霉素处理细胞48h，并与其他时间点和处理进行比较。较高水平的眼液和可能的去甲眼液表明氧化应激增加。

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图4。谷胱甘肽途径。谷胱甘肽可在细胞中以氧化（谷胱甘苷二硫醚，GSSC）和还原（谷胱甘肽，GSH-谷氨酸由γ-谷氨酰胺转肽酶（GGT）催化。L-半胱氨酸-甘氨酸是由GGT催化谷胱甘肽与L-氨基酸部分结合而形成的。该反应导致γ-（L）-谷氨酰氨基酸的形成，γ-谷氨酰基环转移酶将其转化为5-氧代-（L）-脯氨酸和L-氨基酸。5-氧代-（L）-脯氨酸然后被还原为（L）-谷氨酸。谷胱甘肽合成酶（GCS和GS）催化γ-（L）-谷氨酰-（L。雷帕霉素暴露24或48小时对半胱氨酸-谷胱甘肽二硫化物的影响(A类)，半胱氨酸甘氨酸(B类)，γ-谷氨酸亮氨酸(C类)，γ-谷氨酰胺磺酸盐(D类)，5-氧丙烷(E类)，半胱氨酸(F类)，眼炎(G公司)，去甲眼酸盐(H（H）). 请参见图1用于颜色和图例代码。

谷胱甘肽代谢的变化表明，雷帕霉素治疗，尤其是48小时后，无论基因型如何，都会导致较高的氧化环境。需要进一步研究雷帕霉素和氧化应激。

蛋白质印迹

用含有鸡尾酒抑制剂（Roche）的RIPA缓冲液提取蛋白质，并使用Bradford染色法（Biorad）测定浓度。对总蛋白（30μg）进行SDS-PAGE，然后用推荐稀释度的适当抗体进行免疫印迹。然后用过氧化物酶连接的二级抗体培养印迹，然后使用超级信号化学发光试剂盒（Thermo-scientific）进行增强化学发光检测。抗体：S6K1（细胞信号，1:1000）、P-S6K1。

流式细胞仪分析

按中所述进行流式细胞术。²⁷简单地说，wt和TAp73^−/−MEF种子为3×10⁵每100 mm板的电池数。培养物要么不治疗，要么用雷帕霉素治疗。处理后24和48小时，用0.025%胰蛋白酶在37°C下收集细胞3分钟，然后在PBS中添加10%FCS后，离心细胞，用PBS洗涤，并在70%冷乙醇中固定。利用这些条件采集细胞可以获得高产量的未受损细胞。固定后，用PBS清洗细胞，用RNase（100μg/ml）在37°C下处理15分钟，然后用碘化丙啶（10μg/ml，黑暗中30分钟）染色。然后使用FACScan流式细胞仪（Becton Dickinson）对样本进行分析。

代谢组学分析

样品立即储存在-80°C下，在分析时，按照参考文献⁴⁷简单地说，将提取的样品分成相等的部分，通过气相色谱/质谱（GC/MS）或液相色谱/色谱质谱（LC/MS/MS）平台进行分析。还包括从含有少量所有研究样品的均质池中创建的几个技术复制样品。比较野生型和TAp73之间的全球生化特征^−/−敲除小鼠胚胎成纤维细胞。本研究比较了三种培养条件：（1）在4h时间点收集的饥饿细胞，（2）未经处理的细胞，以及（3）在24h和48h时间点分别收集雷帕霉素处理的细胞；每个点分析5-8个独立的生物复制品。

该平台的LC/MS部分基于Waters ACQUITY UPLC和Thermo-Finigan LTQ质谱仪，该质谱仪由电喷雾电离源和线性离子阱质谱仪组成。将样品提取物分为两等分，干燥，然后在酸性或碱性与LC-相容的溶剂中重新配制，每个溶剂包含11个或更多固定浓度的注射标准品。一份样品使用酸性正离子优化条件进行分析，另一份使用碱性负离子优化条件，在两次独立进样中使用单独的专用柱进行分析。在酸性条件下重组的萃取物使用水和甲醇进行梯度洗脱，两者均含有0.1%甲酸，而同样使用水/甲醇的基本萃取物含有6.5 mM碳酸氢铵。MS分析使用动态排除在MS和数据相关的MS2扫描之间交替进行。

用于GC/MS分析的样品在真空干燥条件下重新干燥至少24小时，然后使用双三甲基硅三氟乙酰胺（BSTFA）在干燥氮气下衍生。气相色谱柱为5%苯基，温度在16分钟内从40°C上升到300°C。样品在使用电子碰撞电离的Thermo-Finigan Trace DSQ快速扫描单四极质谱仪上进行分析。每天对仪器进行质量分辨率和质量精度的调谐和校准。从原始数据文件输出的信息被自动提取。

对于计数大于200万的离子，可以进行精确的质量测量。可以对母离子和碎片进行精确的质量测量。典型质量误差小于5 ppm。计数小于200万的离子需要更大的努力来表征。碎片谱（MS/MS）通常以数据相关的方式生成，但如有必要，可以使用目标MS/MS，例如在低电平信号的情况下。通过与纯化的标准品或反复出现的未知实体的文库条目进行比较来鉴定化合物。已知化学实体的鉴定是基于与纯化标准品的代谢文库条目的比较。色谱特性和质谱的结合表明了与特定化合物或等压实体的匹配。

数据质量：仪器和过程可变性

仪器可变性是通过计算在注入质谱仪之前添加到每个样品中的内部标准的中间相对标准偏差（RSD）来确定的。通过计算100%基质样品中存在的所有内源性代谢物（即非仪器标准物）的中位数RSD来确定整个过程的变异性，这些基质样品是合并客户样品的技术复制品。

这项工作得到了英国医学研究委员会的支持；由“Allenza contro il Cancro”（ACC12）、MIUR/PRIN（20078P7T3K_001）/FIRB（RBIP06LCA9_0023，RBIP06LCA9_0C）、AIRC（2008–2010_33–08）（#5471）（2011-IG1155）、AIRC5xmille（#9979）、意大利人类蛋白质组网RBRN07BMCT、MIUR/PRIN（2008MRLSNZ_004）、Telethon Grant（GGPO9133）、，本文中所述的GM研究也得到了Min.Salute（Ricerca norcologica 26/07）和IDI-IRCCS（RF06 c.73，RF07 c.57，RF08 c.15，RF07 c.57）对GM的部分支持。工作得到了俄罗斯联邦教育和科学部（11.G34.31.0069）的支持。