癌基因ETS融合解除Ewing肉瘤和前列腺癌中E2F3靶基因的调控

与EWSR1/FLI1和E2F3基因组结合不同模式相关的基因调控模式

为了确定分离的EWSR1/FLI1增强子结合和结合的EWSR1/1 FLI1-E2F3启动子结合模式的功能后果，我们测量了诱导后基因表达的时间变化EWSR1/FLI1号机组在A673细胞中敲除。由此产生的基因表达变化与EWSR1/FLI1和/或E2F3结合位点相关。可以合理地假设，绝大多数直接基因靶标对EWSR1/FLI1蛋白水平变化的初始反应模式是快速的，并遵循显性模式。主成分分析（PCA）用于识别表达变化中的此类模式。三种主要动力学模式（PCA-1、PCA-2、PCA-3）(图2A)基因的表达变化可能与每个模式相关或反相关(图2B). 主导模式PCA1涉及立即下调（PCA1⁺)或上调（PCA1^负极). 第二个成分PCA2表现出最小值（PCA2⁺)或最大值（PCA2^负极)之后36小时EWSR1/FLI1号机组击倒，而第三个非零模式（PCA3^+,−)基本上围绕零线振荡。

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图2。

转录因子结合和基因表达变化对shRNA诱导的EWSR1/FLI1号机组. (A类)敲除诱导表达的前四个主要成分发生了变化。每个成分代表一种连贯、主导的表达变化模式。只有前三个分量显示出显著的非零信号；因此，在随后的分析中只使用了这三个成分。(B类)基因表达水平显著变化的热图(第页>0.8）与主成分1和2相关（+）和反相关（−）。由于其数量相对较少，与PCA3相关的基因在该图中不可见。(C类)与平坦背景模型相比，E2F3和EWSR1/FLI1结合区在基因附近富集，表达变化与两个最大主成分相关。这两个因素都有重叠，除PCA1外，这种关联性通常更强^负极：在EWSR1/FLI1基因敲除后快速上调的基因中，这两个因子的克隆化表现不足。此外，远端区域EWSR1/FLI1结合在PCA1后应答者组中的表达不足⁺.

EWSR1/FLI1结合与PCA1（3198个基因）和PCA2（548个基因）相关性最好，而与PCA3相关的基因只有37个(|第页|>0.8）（有关相关基因和基因本体术语的列表，请分别参见补充表S4和S5）。引人注目的是，根据PCA1/PCA2动力学模式，在基因附近观察到E2F3结合的显著共富集(图2C). 尽管EWSR1/FLI1结合区富集在三个主要主成分中，E2F3的最强信号出现在PCA1中⁺，代表早期EWSR1/FLI1-激活基因。在早期抑制反应的基因组（PCA1）中没有发现E2F3的富集，甚至共定位EWSR1/FLI1-E2F3结合的轻微表达不足^负极)支持EWSR1/FLI1-E2F3共定位定义了这些蛋白质正调控的基因子集的解释。

在我们早期的基因表达研究中(Kauer等人，2009年)，的EWSR1/FLI1号机组将shRNA转染五种ES细胞株96小时后的敲除反应与ES肿瘤和MSC之间的基因表达差异进行比较，MSC被认为是ES最可能的祖细胞(Tirado等人，2006年;Kauer等人，2009年;Riggi等人，2010年). 将该研究中确定的EWSR1/FLI1特征基因集与在此绘制的转录因子/DNA相互作用图进行比较，发现两者之间存在很强的相关性(P（P）< 10⁻⁴)在结合和基因表达之间。1417个击倒应答基因中，约60%（843）和30%（459）分别与EWSR1/FLI1和/或E2F3结合相关。同样，ES和MSC之间1986个差异表达的基因中，58%（1145）和28%（561）分别与EWSR1/FLI1和E2F3结合相关。

当分别关注上调和下调基因时，一幅更加微妙的画面浮现出来。正如我们之前的研究所预测的那样(Kauer等人，2009年)EWSR1/FLI1上调的819个基因与E2F3结合显著相关(P（P）< 10⁻⁴;n个=328）和EWSR1/FLI1绑定(P（P）< 10⁻⁴;n个= 469). 即使没有EWSR1/FLI1共定位，E2F3结合仍然可以预测上调(P（P）< 10⁻⁴;n个=150），但非共定位EWSR1/FLI1结合不能预测(P（P）> 0.6;n个=287）。然而，EWSR1/FLI1下调的509个基因的这种模式被逆转：E2F3结合没有(P（P）> 0.3;n个=131）相关，但EWSR1/FLI1结合高度显著(P（P）< 10⁻⁴;n个= 374). 重要的是，在下调组中，大多数关联是通过远端结合介导的。当考虑到唯一的远端结合时（即在转录起始位点的−4 kb到+300 bp范围内没有近端E2F3和/或EWSR1/FLI1结合的基因），EWSR1/FLI1的结合仍然与基因抑制高度相关(P（P）< 10⁻⁴;n个= 257).

转录因子识别基序的空间占据频率表明EWSR1/FLI1和E2F3协同结合

根据ChIP-seq数据中观察到的共定位，转录因子位点识别矩阵的电子分析(Quandt等人，1995年)揭示了E2F和ETS基序的强烈交叉富集(图3; 补充图S2a；补充表S6）。正如预期的那样，ETS（V$CETSP54_03和V$ELK1_02:2851和2234次出现）和E2F（V$E2F_Q2:3352次出现）基序的识别矩阵在EWSR1/FLI1和E2F结合区中占主导地位。此外，E2F基序（V$E2F_Q3）在EWSR1/FLI1结合区中的表达量是正常的36倍(图3A)，和ETS基序（例如V$ELK1_02）在E2F3结合区中的表达高出60倍(图3B). 识别基序的这种交叉富集可能表明协同结合，也可能反映一组共同的靶基因的独立调控。在后一种情况下，启动子中任一因子（E2F3或FLI1）的有效结合亲和力应独立于另一因子的识别基序的存在。为了确定这两个模型中的哪一个适用，我们计算了启动子的可检测结合事件的数量，这些启动子要么没有识别基序，要么都有识别基序。值得注意的是，与仅含有E2F识别基序的启动子相比，这两个基序的同时存在几乎使观察到E2F3结合的概率增加了一倍(图3C)，显然有利于协同结合。

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图3。

结合区的硅片分析。(A类,B类)EWSR1/FLI1和E2F3结合区内转录因子识别序列过度表达。图中所示的一组图案B类已被选中，以减少相似图案之间的冗余。完整列表见补充材料（补充表S3）。(C类)结合频率与启动子DNA序列中ETS和E2F结合基序的存在相关：显示E2F3、EWSR1/FLI1或两者同时存在的结合事件频率（即每个启动子的平均结合事件数）。在该分析中，启动子被细分为四组，包含E2F或ETS，或两者都不包含，或都包含。不包含这两个基序的组用于标准化，将频率设置为1。扩展分析以包括ETS和E2F基序在包含这两个基序的区域中的相对组织，这一点变得显而易见(D类)有效的绑定亲和力取决于该组织。实验观察到的绑定事件数(年-轴）重叠基因组中任何给定的ETS基序取决于定向距离(x个-轴）从ETS图案到下一个E2F图案。(E类)ETS和E2F识别位点的特定空间排列在E2F3和EWSR1/FLI结合区中过度表达。该图显示了EWSR1/FLI1和E2F3的ChIP-seq结合区内ETS和E2F基序的空间配置频率。除了在近距离出现全局最大值外，正如预期的那样，随着识别序列的整体增加，启动子区域中还可以看到E2F和ETS因子对频率增加的离散区域。作为参考，图中还显示了长度为80 bp（一个核小体间连接子的长度）和146 bp（核小体DNA的长度）的刻度。中描述的频率测量D类和E类可以最好地解释为条件概率，其中D类显示了在结合位点具有特定几何组织的情况下观察结合的概率，而E类显示了在存在绑定事件的情况下找到特定几何体的概率。尽管这两个观察结果通过贝叶斯定理相关，但它们是相互独立的，如补充材料中详细讨论的那样。

可以合理地假设，这种协同作用在某些空间配置中最有效，这些空间配置可以增强对DNA的可接近性和/或促进蛋白质的相互作用。扩展分析图3C包括转录因子识别基序之间定向距离的依赖性表明，E2F和ETS基序的接近通常会增加观察E2F3和EWSR1/FLI1结合的概率。然而，在不同的距离，观察到了额外的局部极大值，其中结合概率显著增加(图3D). 由于这些最大值的存在表明进化选择，我们进一步研究了特定识别位点配置在EWSR1/FLI1和E2F3实际结合的序列中过度表达的证据。我们发现，除了ETS和E2F基序的共定位特征（由整体“火山”状图表示）外，具有局部最大值的子结构出现在图3E（另请参见补充方法和补充图S2B）。这些最大值之间的距离与染色质核小体结构相关的长度标度惊人地相似：连接体DNA的特征长度（～80 bp）与局部最大值的位置和/或距离一致。此外，在ETS锚定下游225bp处E2F基序增加的可能性几乎精确地类似于80+146，连接体长度加上缠绕在核小体周围的DNA长度。

EWSR1/FLI1与E2F3在激活基因启动子上协同作用的功能证据

迄今为止的分析表明，EWSR1/FLI1和E2F3在激活基因的近端启动子上优先共定位，但这两个因子在体外的调节活性仍有待证实。因此，通过萤火虫荧光素酶报告子分析，在A673细胞中检测10个随机选择的具有近端EWSR1/FLI1和E2F3结合区域的基因的启动子片段的EWSR1/FLI1-和E2F3-依赖性活性。所有10种结构都表明，在条件反射后48小时，报告者的活动显著减少了两到三倍EWSR1/FLI1敲除，而表达基因的启动子没有任何EWSR1/FLI1或E2F3 ChIP-seq信号(PRKCI公司)空载体控制没有响应EWSR1/FLI1号机组调制(图4A). 相反E2F3型击倒效应对记者活动的影响不太明显，但变数更大。在所选的10个基因中，只有6个基因的活性在统计学上显著下降(图4A). 这些结果表明，EWSR1/FLI1而非E2F3的结合是启动子活性的速率限制。

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图4。

基因组EWSR1/FLI1和E2F3结合区的启动子结合和活性。(A类)萤火虫荧光素酶报告子对ChIP-seq鉴定为EWSR1/FLI1和E2F3靶基因的10个任意选择的基因进行分析。启动子片段(CDK2型: −122/+458;E2F3型: −272/+327;雷达51: −186/+164;VRK1系列: −269/+100;RFC2协议: −400/+25;ATAD2公司: −368/+202;建议零售价2: −463/+191;GEMIN4公司: −275/+87;MFLI1P公司: −251/+70;SKP2系列：−240/348）被克隆到pGL4.10载体（Promega）中，并在强力霉素诱导48小时后测试A673 ES细胞对EWSR1/FLI1条件性敲除的反应性EWSR1/FLI1号机组shRNA诱导（深绿色）或shRNA诱导的E2F3型（红色）。作为阴性对照，表达基因的启动子活性在EWSR1/FLI1号机组击倒(PRKCI公司：−139/265）和空矢量（pGL4.10）。这个年-axis表示相对于对照条件的启动子活性。显示了至少三个独立实验的平均值和标准偏差，每个实验一式三份。(B类)野生型和突变型报告活性的折叠变化ATAD2公司报告者在存在（浅绿色）和强力霉素诱导的EWSR1/FLI1缺失（深绿色）48小时后构建EWSR1/FLI1号机组shRNA诱导。ChIP和荧光素酶分析参见补充图S3。

E2F和ETS基序对三个基因EWSR1/FLI1依赖性启动子活性的贡献-GEMIN4公司,E2F3型、和ATAD2公司-随后通过定点突变策略进行测试。首先，通过ChIP-PCR分析，在另外两个样本中验证了这三个代表性靶基因的直接EWSR1/FLI1和E2F3结合区域EWSR1/FLI1号机组-表达胚胎干（ES）细胞系（补充图S3、TC71和TC252），并在A673细胞中表达EWSR1/FLI1号机组（补充图S4A–F）。在使用FLI1特异性（补充图S4A–C）或E2F3特异性（辅助图S4D–F）抗体进行ChIP后，PCR-扩增包含预测ETS和E2F结合基序的启动子区域，以及用于控制的侧翼上游区域。在每种情况下，信号仅在预测的EWSR1/FLI1和E2F3结合区域获得，并且在存在（+）时比沉默（-）后更强EWSR1/FLI1.如示例所示ATAD2公司(图4B)和E2F3型和GEMIN4公司（补充图S4G，H），如果荧光素酶报告子分析中的任一核心序列EWSR1/FLI1号机组或E2F3型绑定被中断。对于ATAD2公司在+33位的单个ETS核心基序或在-267位的高度保守的E2F位点（大约对应一个核小体和两个连接子的距离）的个体突变将响应降低了约50%，而在+14位的第二个E2F核心基序的扰动仅将强度降低了约25%。在所有单一突变实例中，启动子片段对EWSR1/FLI1号机组击倒。相反，在EWSR1/FLI1存在的情况下，破坏ETS和E2F位点的三重突变将启动子活性降低到与之后观察到的水平类似的水平EWSR1/FLI1号机组在wild类型构造中进行击倒，从而呈现ATAD2公司启动子对EWSR1/FLI1号机组调制。这一结果表明ETS和E2F基序都有助于ATAD2公司EWSR1/FLI1的启动子调控。值得注意的是，如中所示图4A经基因表达分析（未显示）证实，E2F3是EWSR1/FLI1直接激活的基因之一。因此，EWSR1/FLI1依赖于ATAD2公司没有功能性ETS结合位点的基因启动子可以通过E2F3结合来解释，反之亦然，如果没有功能性E2F结合基序，则可以通过EWSR1/FLI1的结合来解释。EWSR1/FLI1缺失降低E2F3的表达，因此，与ETS和E2F位点的离散突变相比，启动子活性的降低更强。这些数据支持EWSR1/FLI1和E2F因子在EWSR1/FLI1和E2F3结合的启动子上的功能相互作用，包括E2F3本身的功能相互作用。

不同的生物过程与启动子型EWSR1/FLI1-E2F模块和E2F3-独立的EWSR1/FLI1结合模式相关

对EWSR1/FLI1结合相关基因的基因本体（GO）分析表明，过度表达的过程通常与翻译（GO:0006412，1.6倍）、核糖核蛋白复合物的生物发生（GO:0022613，1.6倍，和RNA处理（1.4倍）。与E2F因子在增殖控制中的既定作用一致，E2F3结合靶点最丰富的GO术语是DNA复制（GO:0006260，富集2.4倍）、对DNA损伤刺激的反应（GO:0006974，双重）、细胞周期（GO:0007049，1.7倍）、RNA处理（GO:006397，1.7倍数）、，和RNA剪接（GO:0008380，1.9倍）。在这些E2F3靶点中，同时选择EWSR1/FLI1结合用于核糖核蛋白复合物（GO:0030529，1.5倍）、RNA加工（GO:0006396，1.4倍）和RNA剪接（GO:0008380，1.4倍，表明EWSR1/FLI1与E2F3在转录后基因表达调控基因的启动子以及增殖相关功能的启动子上合作。与之形成鲜明对比的是，我们发现EWSR1/FLI1靶向的基因最常见于无同时E2F3结合的非促性腺激素位点，并且主要受EWSR1/FLI1抑制，这些基因被不同的GO术语信号转导、分化和与ES的组织发生密切相关的术语注释。这些包括“骨重塑的积极调节”（GO:0046852，1.3倍）、“间充质细胞分化”（GO:0048762，1.4倍）和“神经系统发育”（GO:0007399，1.4倍(表1; 补充表S7）。另一个例子是，KEGG（京都基因和基因组百科全书）途径“轴突导向”在远端EWSR1/FLI1调控的假定靶点中的表达显著过高（补充图S5）。

表1。

E2F3和EWSR1/FLI1具有相邻结合事件的基因的精选显著丰富的基因本体术语

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总之，这些结果表明，EWSR1/FLI1通过两种机制调节不同的靶基因集：（1）通过主要发生在启动子外部的E2F3非依赖性EWSR1/FLI1结合抑制分化相关基因，以及（2）通过EWSR1/FLI1和至少E2F3在其近端启动子处的协同作用刺激与增殖和RNA加工相关的基因。由此产生的分化和增殖驱动的同时抑制是嵌合EWSR1/FLI1转录因子恶性转化的关键特性。

基因表达分析

序列数据分析

使用Illumina的扩展ELAND比对程序将序列读取映射到人类参考基因组（NCBI36/hg18）。从结果数据集中删除相同位置开始的读数以及与参考值偏差超过两个或校准分数<25的低质量读数。然后，通过计算基因组中每个核苷酸的读取事件的覆盖率来估计局部读取密度，其中定向读取被扩展到插入长度（100bp），插入长度是在文库制备过程中选择的大小。

P（P）-数值用于识别显著增加的读取密度。它们是根据累积泊松分布估计的，其中局部排放系数λ(x个)使用围绕中心的窗口的平均读取密度从输入（非IP）数据估计x个大小分别为1 bp、100 bp和1000 bp。其中，最保守（最大）的估计值maxλ_我(x个)用于最小化错误发现率。使用以下启发式方法确定离散富集区域：连续的如果同时满足以下条件，则称DNA拉伸显著富集：P（P）< 10⁻⁹该区域内的任何地方，以及P（P）≤ 10⁻⁶其他任何地方。随后，如果不同的重要区域之间的距离小于片段大小的一半（50 bp），则将其合并为单个区域。最后，以这种方式确定的小于平均片段长度（100 bp）的区域被拒绝。

通过报告最大phastCons得分（脊椎动物，从UCSC下载的44路保护得分；http://www.genome.ucsc.edu)在富集读取密度的离散区域内。

推测EWSR1/FLI1、E2F3调控靶基因的鉴定

基于最接近的基因启发法确定EWSR1/FLI1和E2F3结合的推测调控靶点；对于每个结合位点，这是具有唯一Entrez基因标识符的最近的RefSeq转录本。在多个RefSeq转录物映射到同一Entrez基因标识符的情况下，选择最长的转录物。使用定制的内部软件对基因进行基因本体分析。使用DAVID进行路径分析(Dennis等人，2003年).

DNA模体分析

使用基于矩阵的方法识别与已知转录因子结合位点基序相似的序列坐标(Quandt等人，1995年)计算读取密度丰富区域中已知基序的频率（TRANSFAC 11.4数据库），并与（1）整个基因组或（2）从基因组中随机选择的区域中的频率进行比较。对于（2），使用非选择（输入）DNA的测序数据生成随机位置分布。P（P）-过度表达的值是通过（对于[1]）Fisher精确检验或（对于[2]）计算随机迭代次数得出的，其中随机集中给定基序的频率大于或等于ChIP-seq数据集中观察到的频率。

通过将该基序在上下游±100个碱基上的命中率增加，计算共现数，并将该数与它们在整个基因组中的各自频率进行比较，再次使用Fisher精确检验计算，来估计给定基序周围其他转录因子的共富集P（P）-值。补充材料中描述了用于识别ETS和E2F识别位点对几何形状的算法。

染色质免疫沉淀分析

根据制造商的说明，使用MAGnify染色质免疫沉淀系统（Invitrogen）进行染色质免疫沉降。使用以下抗体：E2F3、sc-878；圣克鲁斯生物技术公司；Fli1，MyBiosource。通过EWSR1/FLI1敲除证实了FLI1抗体对A673细胞FLI1的特异性，并排除了ERG-表达VCaP细胞中与ERG的交叉反应。采用Phusion Hotstart II（Finnzymes）进行PCR。38个扩增周期中使用的引物如下：ATAD2:26/129 GAGCGCGGAAGCAGAG，GCTGCTGCGGAGAACCA，−117/18 GCCCGGCCTTCTCTCTCTA，GGCGCACAGCTCGCCA，−350/−240 CAGGGGGAGACGC，GAGCGGTCGTAGCCCGTT，−1678/−1470 CCCAGACATTCA，GAGGCGAGAACAGC，E2F3:131/262 CCGCCCCGATTTTTT，GCAGTCGGAGTTCCAAGTC，−123/62 CGGGTTGGGGGGCGGGGTGA，TGCAACGGATGCGGCGG，−272/−149 TCAAGGAGGCCTATGCAAAT，GGCGCTACCTTACTTC，−1457/−1334 AAGGAGTGCTACCTCTCTGGA，TGAGGATCACCTTGA，GEMIN4:−130/76 ACGTCCGGGTACCTGGC，TCCGAGACTCGC，−153/8 GGCGAGGCTCTAGT，TTGCTCACTCTC，−236/−47 GTTACCGGGTGAGGTGAAT，gcagtctccacgacgag，−1457/−1334 ggaggctacctgtggagacca，在gacctctctactactcacaagc。

使用Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（发酵剂）对启动子结构上的ChIP进行SYBR Green PCR。使用的引物如下：E2F3正向−46 GCGTAAACCGTATCCTTCA，pGL4.10反向1 AACAGTACGTGCAAG，GEMIN4正向GTTACCGTGAGTGAAT，pGL4.1反向2 CTCGAAGTACTCGTAGG。

报告基因分析

根据制造商的说明，使用QuikChange II定点突变试剂盒（Stratagene，200523）进行定点突变。用于引入突变的引物如下：ATAD2:ETS 33/35:CGCAGCTCTGTCTTATAGCTCCGAATTGGCGCCC，E2F−267/−265:CCCGCCCGTCCCTTACCAAATTCCAACGCGG，E2F 14/16 CGCGCTCCGAATTCGTTACCAAGCCGC，E2F3:ETS−7/-5 CATTGTCAGCAGCTATATCAGCATATGGCATTTCAGCTCGC，ETS 207/209 GAGGGGCTCTAGCGCGCCGG，GEMIN4:ETS−178/−176 CCGCTGGGACCCTTATAGAGGGGGCCGGGGCGCGC，ETS-92/−90 GGGAGGCTCTCCCTATAGGCGGCGCGTGC，E2F−70/−68 CGGCGCTGCGCTTTACTCGTGTGAGG，E2F 55/57 CGTGGCGTCCCTTACCGTCGTTCGAGTTCTC。

携带强力霉素诱导的A673细胞EWSR1/FLI1号机组shRNA与基于pGL4.10的报告基因构建物和pmaxEGFP（Amaxa GmbH）共同转染，使用20%密度的LipofectAMINE Plus试剂（Invitrogen）。转染后48 h用强力霉素处理细胞，转染后96 h（强力霉素诱导后48 h）用Bright-Glo荧光素酶检测试剂盒（Promega）进行基因报告检测。对于E2F3敲除实验，如上所述转染shRNA构建物（由Nevins博士善意提供），并在转染后48小时进行基因报告分析。通过标准流式细胞术监测EGFP阳性细胞的转染效率。

本研究得到了NIH、国家癌症研究所、癌症研究中心和奥地利科学基金会（FWF）的校内研究计划的部分支持，拨款22328-B09；欧盟委员会第七框架计划授予259348（“ASSET”）。R.S.是奥地利科学院DOC-fFORTE奖学金的获得者。我们感谢J.Waterfall的宝贵讨论。