介绍
刺猬（Hedgehog，Hh）信号在多种发育过程中起着不同的作用(1). Hh蛋白经过高压蒸煮产生活性脂质修饰的信号肽，通过与12通道跨膜受体Patched1（Ptch1）的相互作用来传递信号。Hh与Ptch1的结合减轻了七种跨膜蛋白Smoothened（Smo）的抑制作用。通过细胞内信号通路激活Smo信号，以控制锌指转录效应器Gli家族三个成员Gli1、Gli2和Gli3的活性。这些Gli效应器调节下游靶基因的转录，其中包括第1部分和Gli1公司Hh途径反馈系统的负成分和正成分(2).
将Hh途径活性与人类癌症联系起来的第一个证据是鉴定第1部分Gorlin综合征是一种罕见的常染色体疾病，与基底细胞癌（BCC）、髓母细胞瘤和横纹肌肉瘤的发病率增加有关(三–5). Hh途径几个成分的体细胞突变，包括第1部分和平滑（Smo）也在许多散发的基底细胞癌和髓母细胞瘤中检测到(6–9). 此外，最近的研究也表明Hh途径参与了多种内胚层起源器官的肿瘤(8). 这些肿瘤包括小细胞肺癌和食道癌、胃癌、胰腺癌和前列腺癌，它们通常都与Gorlin综合征无关。环胺和其他小分子Hh通路特异性拮抗剂的使用表明，在小鼠模型和一系列人类肿瘤细胞系中，几种癌症的生长需要Hh通路活性在体外(8,10,11). 然而，Hh途径在肿瘤发展、生长和转移中的确切作用仍有待确定。
目前，第1部分+/−小鼠是Hh相关肿瘤发生的主要模型(12,13). 就像戈林的病人一样，第1部分+/−小鼠易患基底细胞癌，并发展成髓母细胞瘤和横纹肌肉瘤，但仅在低外显率（~10%；参考文献。12,13). 已经开发出几种小鼠菌株，试图通过激活皮肤或大脑中的Hh信号来模拟BCC和髓母细胞瘤(14–18); 然而，这些模型导致胚胎期这些组织中Hh信号的普遍上调，并且在胚胎期或出生后早期往往是致命的。相比之下，人类患者中的大多数肿瘤是在正常细胞环境下偶然发生的。此外，组织背景本身可以对肿瘤的发展和由此产生的表型产生显著影响(19).
我们已经描述了一种小鼠菌株，冷却器CAGGS其中，Cre:：ER融合蛋白广泛表达，使他莫昔芬介导的Cre介导的遗传修饰得到控制(20). 尽管观察到罕见的Cre活性零星泄漏，但Cre:：ER融合在大多数组织中是不活跃的。然而，注射三苯氧胺后，在广泛的成人组织中观察到高水平的重组(20). 我们推断，该模型的低水平药物非依赖性偶发重组和精确的药物调节性高水平重组的属性，可能构成探索推定致癌基因和抑癌基因活性的策略基础。为了测试这个想法，同时生成一个更忠实地模拟Hh相关散发肿瘤的健壮小鼠模型，我们将冷却器CAGGS带有条件等位基因的转基因烟雾2针对普遍表达的罗莎26轨迹(21).烟雾2编码之前在人类BCC中发现的Smo突变形式(15). 在该等位基因中，第七跨膜结构域中的激活突变导致靶组织中Hh信号的配体依赖性组成激活。我们报告了一个稳健的散发性肿瘤生成模型，其中特定肿瘤的频率和潜伏期依赖于药物。该模型提供了对胃肠道Hh相关致瘤程序新方面的见解。此外，各种Hh相关肿瘤的转录谱显示了不同肿瘤类型之间的几种常见分子联系。
材料和方法
老鼠
要生成CAGGS-核心；R26-烟雾2老鼠冷却器CAGGS将转基因品系杂交到R26-烟雾2小鼠（小鼠具有混合遗传背景，包括129/Sv和瑞士韦伯斯特作为主要成分）。这个第1部分+/−本研究中使用的小鼠保持在类似的混合背景中。
小鼠对三苯氧胺的诱导作用
将他莫昔芬（西格玛，密苏里州圣路易斯）以3 mg/mL的浓度溶于玉米油（西格马）中CAGGS-核心；R26-烟雾2和CAGGS-核心；R26R型研究表明，在出生后第10天（P10）静脉注射他莫昔芬（1 mg/40 g体重）。注射三苯氧胺六周后，从CAGGS-核心；R26R型小鼠用4%多聚甲醛固定。冷冻切片以14-μm的间隔进行切割，并进行标准X-gal染色。
组织学和免疫组织化学
成人CAGGS-核心；R26-烟雾M2用PBS中的4%多聚甲醛对小鼠进行心脏灌注。收获器官并在多聚甲醛中进一步固定24小时。所有组织在30%蔗糖中清洗过夜，并包埋在鸟氨酸氨甲酰转移酶中，在14μm处进行冷冻切片。根据哈佛医学院病理学啮齿动物组织病理学核心设施（马萨诸塞州波士顿）的标准方案，对石蜡切片组织进行固定、清洗、脱水和处理。使用标准方案进行定期酸-雪夫（PAS）和阿尔西安蓝染色。
使用以下主要抗体在冰冻切片上进行免疫组织化学：兔抗GFP（1:1000；马萨诸塞州剑桥Abcam）、兔抗血小板衍生生长因子（PDGF）受体α（PDGFRα；1:1200；加州圣克鲁斯Santa Cruz Biotechnology）、兔抗体Ki67（1:1000，英国纽卡斯尔Novocastra NCL-Ki67-P）、，小鼠抗结蛋白（1:100；Sigma）、兔抗Zic（马萨诸塞州波士顿哈佛医学院R.Segal实验室赠送）、小鼠抗NeuN（1:100，加利福尼亚州特梅库拉Chemicon）和小鼠抗肌生成素（1:100：爱荷华州爱荷华大学发育研究杂交瘤库）。根据制造商的说明，使用Envision+系统（DAKO，Inc.，Carpindia，CA）进行3,3′-二氨基联苯胺亮场免疫组化。使用基于热的抗原检索方案进行免疫组织化学。
Affymetrix微阵列和统计分析
从髓母细胞瘤和横纹肌肉瘤肿瘤组织以及邻近的正常骨骼肌和小脑组织中纯化总RNACAGGS-核心；R26-烟雾2三苯氧胺产后注射组小鼠10周龄。总RNA是从三只猫的尾皮上切下的BCC中制备的CAGGS-核心；R26-烟雾2三种野生型（WT；R26-烟雾2)室友。根据Affymetrix的推荐方案制备样品。生成探针并将其与小鼠表达集430寡核苷酸阵列杂交，并根据制造商的建议进行扫描（Affymmetrix，加州圣克拉拉）。使用Resolver（华盛顿州西雅图罗塞塔）软件识别在每种肿瘤类型中相对于非肿瘤组织表现出统计显著差异的基因（倍变>1.5；P（P）< 0.001). 在所有三种肿瘤类型（独立分析）中显著上调或下调的基因列表如下补充表S4.
原代肿瘤细胞培养和逆转录PCR
新鲜髓母细胞瘤组织被分离出来，位于CAGGS-核心；R26-烟雾M2老鼠。将组织彻底切碎，用胰蛋白酶消化10分钟，然后研磨成接近单细胞悬浮液。通过细胞过滤器过滤后，将肿瘤细胞涂布在神经基底培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）中35 mm明胶涂层细胞培养皿上，并用KAAD-cyclopamine（3μmol/L；Calbiochem，San Diego，CA）或载体补充N2（Invit罗gen）。治疗三天后，使用Trizol试剂（Invitrogen）制备总细胞RNA。使用SuperScript II试剂盒（Invitrogen）和随机六聚体从1μg总RNA合成cDNA。使用0.5μL未稀释和4倍连续稀释的cDNA模板进行PCR，扩增引物序列如下：第1部分（5′-tgctggcatcaggagag和5′-gacaggagccagacag），Gli1公司（5′-atcacctgttggatgctggat和5′-ggcgtgaaatagacttccgaca），Gli2公司（5′-gagcaccccagtagaca和5′-gcccagtgtctag），烟雾（5′-ttgtggctcatcaccttcagc和5′-tgccaaacatggcaaataga），PDGFRα（5′-tgttgctgttggtgatt和5′-tccatcttggagtaagg），IGFBP4型（5′-agagcaacatcccaacaac和5′-acagtttggaatggatga），IGFBP7型（5′-ggaaaatctggccatcaga和5′-atttcatggaggcatcaac），地图3K7（5′-gggctgttcatatatgcact和5′-gagttgtccccttcatc），地图4K4（5′-catctccaggaaatctca和5′-taagtggctggtctc），以及β-肌动蛋白（5′-tcgtagatggcaccagtg和5′-gttaccaactgggaccagatg）。
结果
Hh相关散发性肿瘤的体细胞小鼠模型
要描述冷却器CAGGS转基因作为模拟小鼠散发性肿瘤发生的潜在驱动线，我们首先检测了散发性泄漏和条件报告等位基因的C介导激活R26R型(22)出生后动物在P10注射单剂量他莫昔芬（1 mg/40 g体重）。注射后6周采集主要器官，以检测药物诱导重组的程度。在没有三苯氧胺注射液的情况下，CreER的“泄漏”导致被检主要器官中0.1%至5%的细胞的β-半乳糖苷酶活性；在每个器官的不同细胞群中观察到广泛的贡献，没有明显的生殖层限制。相比之下，服用三苯氧胺6周后，在主要器官内的多种细胞系中，重组率明显较高，表明单次三苯氧酚脉冲在出生后小鼠中触发广泛重组的有效性(补充图S1).
为了确定这种散发/诱导重组模型在肿瘤程序研究中的有效性，我们将该工具与重组介导的细胞自主上调Hh信号通路联系起来(). 一个编码SmoM2并带有COOH末端YFP标签的cDNA片段被靶向罗莎26基因座（R26）3′至aLoxP公司-侧翼聚腺苷化终止序列盒。当携带该等位基因的小鼠(R26-烟雾2)被一个Wnt1-Cre系列为了使SmoM2在背侧神经管及其神经嵴衍生物中广泛激活，观察到了典型的Hh功能表型增益，表明了该方法的有效性R26-烟雾2Hh途径激活中的等位基因(21). 这个R26-烟雾2等位基因被杂交成冷却器CAGGS背景研究自发和药物诱导重组介导的激活R26-烟雾M2等位基因().
Hh相关肿瘤发生的体细胞小鼠模型。A、，的示意图冷却器CAGGS转基因和烟雾2Rosa26靶向等位基因CAGGS-核心；R26-烟雾2模型。B、，通过散发性渗漏和三苯氧胺诱导，重组介导SmoM2激活。
肿瘤发生谱和肿瘤发病率CAGGS-核心；R26-烟雾2老鼠
评估化合物CAGGS-核心；R26-烟雾2作为Hh相关肿瘤的体细胞小鼠模型，我们分析了20个队列第1部分+/−小鼠，33CAGGS-核心；R26-烟雾2散发CreER泄漏的小鼠，以及55只CAGGS-核心；R26-烟雾2在P10接受如上所述的三苯氧胺的小鼠。定期监测动物的恶性肿瘤发病情况。
这个CAGGS-核心；R26-烟雾2模型显示肿瘤光谱与第1部分+/−模型(). 与以前的报告一致(13,23,24)，在第1部分+/−我们只观察到小鼠髓母细胞瘤和横纹肌肉瘤的发病率较低，约为18周龄小鼠的10%。相反，CAGGS-核心；R26-烟雾2小鼠在相同的时间间隔内表现出显著增强的肿瘤发生。在没有三苯氧胺的情况下CAGGS-核心；R26-烟雾2小鼠出现横纹肌肉瘤和27%的髓母细胞瘤(). 三苯氧胺给药增加了小鼠体内横纹肌肉瘤的数量（平均数量：−三苯氧酐=3；+三苯氧嘧啶=7），并增加了该组髓母细胞瘤的发病率（40%）。此外，三苯氧胺治疗的动物早在5周龄时就出现肉眼可见的BCC样病变，所有动物在8周龄时都出现BCC样肿瘤。
肿瘤形成CAGGS-核心；R26-烟雾2老鼠。A、，不同的肿瘤光谱CAGGS-核心；26个月2老鼠。直方图显示了第1部分+/−(白色),CAGGS-核心；R26-烟雾2零星泄漏组(蓝色)和他莫昔芬产后注射组(红色)出现指示肿瘤的小鼠。B、，生存曲线第1部分+/−，零星泄漏组CAGGS-核心；R26-烟雾2和他莫昔芬产后注射组，显示存活长达18周的小鼠比例。基因型用颜色编码。
而散发性渗漏组的大多数小鼠存活至18周龄（全部第1部分+/−小鼠存活到这个时候）CAGGS-核心；R26-烟雾2注射三苯氧胺后小鼠显著缩短(). 到了18周大的时候，由于沉重的肿瘤负担和感染，这一组的所有小鼠都奄奄一息，根据机构指南强制实施安乐死。相反，在两组中均未观察到肿瘤形成冷却器CAGGS或R26-烟雾M212个月大的小鼠（数据未显示）。
横纹肌肉瘤CAGGS-核心；R26-烟雾2老鼠
这个CAGGS-核心；R26-烟雾2小鼠提供了一种特别有效的模型来研究Hh信号失调与横纹肌肉瘤（儿童最常见的软组织肉瘤）发生之间的关系。肌肉肿瘤CAGGS-核心；R26-烟雾2小鼠在组织学上与第1部分+/−小鼠和人胚胎横纹肌肉瘤。这些肿瘤的范围为1毫米三至4000毫米三由圆形未分化细胞和细长纺锤形细胞的异质混合物组成(). 在一些肿瘤细胞中有明显的骨骼肌分化证据（例如横纹肌）（数据未显示）。免疫组织化学显示，未分化和分化肿瘤细胞的肌中间丝标记物结蛋白均为阳性()表明可能起源于骨骼肌祖细胞。Ki67染色分析显示增殖指数相对较低(). 与人类胚胎性横纹肌肉瘤相似CAGGS-核心；R26-烟雾2小鼠的MyoD，肌生成素、和免疫球蛋白2表达式(补充表S1).
横纹肌肉瘤(苏格兰皇家银行)、基底细胞癌和髓母细胞瘤CAGGS-核心；R26-烟雾2老鼠。A、，横纹肌肉瘤的特征CAGGS-核心；R26-烟雾2鼠标。肌肉肿瘤显示圆形未分化细胞和细长梭形细胞的混合物。结蛋白存在于未分化和分化的肿瘤细胞中。B、，出生后三苯氧胺注射组小鼠尾部皮肤BCC。C、，小脑中散发性和他莫昔芬诱导的SmoM2表达诱导髓母细胞瘤。人类典型髓母细胞瘤的典型组织学特征，具有小的蓝色细胞，大量有丝分裂，很少有分化的组织学证据。髓母细胞瘤CAGGS-核心；R26-烟雾2小鼠表达神经元分化早期标志物Zic1和神经元分化晚期标志物NeuN(C类). Ki67染色显示肿瘤相对于WT组织的有丝分裂指数较高(A、 B类、和C类). 抗GFP抗体免疫染色显示SmoM2-YFP在肿瘤细胞中的表达(A、 B类、和C类).
有趣的是，在散发性漏液组发生的横纹肌肉瘤大多局限于大腿后部和腹壁。相反，在他莫昔芬治疗组，横纹肌肉瘤也在头部、颈部、舌头和睾丸旁的骨骼肌中检测到(补充图S2). 此外，在P10处注射三苯氧胺也会加速肌肉肿瘤发病的平均年龄，从非治疗组第一个肉眼可见的肿瘤的9周到注射三苯二甲胺后的5周。鉴于致瘤程序与出生后服用他莫昔芬有关，似乎出生后肌肉谱系内Hh信号上调可能导致肿瘤发生，这与肌肉祖细胞中SmoM2-YFP的细胞自主活动一致。发生的肌肉肿瘤主要是YFP+指示的表达式烟雾2等位基因().
为了进一步分析Hh信号上调对出生后肌肉的影响，我们检测了CAGGS-核心；R26-烟雾2出生后在P10注射三苯氧胺的小鼠。虽然检测到SmoM2表达细胞，但这些肌肉细胞不表达Ki67和肌生成素，后者是晚期肌源性祖细胞的标记物(补充图S3). 相反，在横纹肌肉瘤的肿瘤细胞亚群中，Ki67和肌生成素上调(补充图S3). 这些结果表明，在分化程度较高的肌肉细胞中激活SmoM2不足以产生增殖表型或将成熟肌肉恢复为未成熟细胞类型。
BCC输入CAGGS-核心；R26-烟雾2老鼠
尽管33例患者未发现明显皮肤损伤CAGGS-核心；R26-烟雾2在18周龄以下的散发性渗漏组小鼠中，早在服用三苯氧胺后5周龄时，尾部、耳朵和脚部就出现肉眼可见的皮肤肿瘤。正如先前在转基因模型中报道的那样，此类肿瘤不仅包括基底样滤泡错构瘤(25)，但也有具有人类基底细胞癌组织学特征的肿瘤，由不典型基底细胞的多灶结节岛组成，周围有栅栏，有丝分裂频繁，皮下真皮浸润(). 正如预期的那样，大多数肿瘤细胞是SmoM2 YFP+(). 表达谱显示，与人类基底细胞癌一样CAGGS-核心；R26-烟雾2小鼠表达高水平角蛋白17和Bcl-2(补充表S2).
髓母细胞瘤形成CAGGS-核心；R26-烟雾2老鼠
CAGGS-核心；R26-烟雾2小鼠小脑内出现髓母细胞瘤。肿瘤细胞密集，由一片片低分化的小细胞组成，细胞质稀少，Ki67免疫染色显示有丝分裂活性高(). 免疫组织化学显示肿瘤细胞早期（Zic1）和晚期（NeuN）神经元标记物阳性，这是颗粒神经元特异性的特征(). SmoM2-YFP在大多数细胞中的表达表明肿瘤来源于SmoM2表达细胞(). 除了典型的肿瘤外，除了小脑表面外，还经常观察到异常细胞巢，这与第1部分+/−小鼠（数据未显示；参考。26). 表达谱分析显示，人类髓母细胞瘤特征标记的转录上调很强，例如Myc、Nmyc1、Foxm1、Ezh2、Otx2、和Sox18系列(补充表S3).
胰腺和胃肠道病变CAGGS-核心；R26-烟雾2老鼠
Hh信号与胰腺癌有关(8,27). 我们发现CAGGS-核心；R26-烟雾M2老鼠。这些病变在很大程度上取代了正常的胰腺结构(). 它们大小不等，内衬立方上皮，有柱状化生灶，由增殖的卵巢样基质支撑，类似粘液囊性肿瘤（MCN）。为了进一步评估和表征这些上皮变化为粘液化生，通过Alcian blue染色（突出肠型粘蛋白）和PAS染色（突出胃型和肠型黏蛋白）评估这些病变。正常胰腺实质中未发现PAS阳性、Alcian蓝阳性上皮()但它是胰腺粘液囊性肿瘤和腺癌的特征。在这些小鼠中，胰腺囊性病变的非典型上皮PAS和Alcian蓝染色均呈强阳性，表明存在胃肠粘蛋白(). 黏液素在较小囊肿中的表达尤其高(). 根据病变的结构、增殖支持基质和多发性粘液化生灶，这些囊性胰腺病变与人类所见的低级别MCN最为相似。
胰腺粘液性囊性病变CAGGS船员；R26-烟雾M2老鼠。Alcian蓝和PAS染色显示局灶性肠型粘蛋白表达(箭头)在囊肿上皮中，但在正常胰腺组织中不存在。注意小囊肿中有显著的黏蛋白表达。
我们还注意到肠和胃的憩室错构瘤病变(补充图S4)前者很常见（20%不含他莫西芬；80%含他莫西芬注射液），而后者很少见（在他莫西芬注射液组中小于5%）。憩室病变内的上皮细胞排列紊乱，轻度增生(补充图S4). 然而，在憩室病变内或胃肠道其他部位没有观察到发育不良的迹象。据报道，其他内胚层衍生组织，如肺和前列腺，均会导致Hh依赖性肿瘤，但看起来正常。
SmoM2的激活不足以诱导小鼠出生后前列腺上皮的肿瘤转化
为了扩展我们的研究，使用CAGGS-核心；R26-烟雾2作为模型系统，研究这些内胚层衍生组织中的肿瘤具有更长潜伏期的可能性，延长超过tamoxifen治疗的最大寿命（18周）CAGGS-核心；R26-烟雾2我们检测了Hh信号在前列腺肿瘤发生中的潜在作用(28). SmoM2在前列腺上皮中被激活，使用Pb-Cre4号机组，一种Cre转基因，在出生后前列腺上皮中特异表达(29). 七Pb-Cre4；R26-烟雾2在12个月龄时观察小鼠，在9个月龄前观察8只小鼠。然而，我们没有在这些小鼠中检测到前列腺上皮细胞的增生性病变或肿瘤转化(). 与中的结果一致CAGGS-核心；R26-烟雾2这些数据表明SmoM2的激活不足以在小鼠前列腺中引发肿瘤。
出生后前列腺上皮中SmoM2的激活不足以诱导肿瘤转化。在WT的背侧前列腺上进行H&E染色R26-烟雾2鼠标和Pb-Cre4；R26-烟雾212个月大的小鼠。GFP抗体染色显示SmoM2 YFP在前列腺上皮中表达。增殖细胞Ki67染色(白色箭头)没有发现前列腺中有较高的有丝分裂指数Pb-Cre4；R26-烟雾2小鼠与WT对照组进行比较。
Hh相关肿瘤的表达谱
为了确定Hh肿瘤转录输出中的常见特征模式，我们比较了三种主要肿瘤类型的表达谱：基底细胞癌、髓母细胞瘤和横纹肌肉瘤。每个肿瘤都可能分别来自不同的细胞起源，即外胚层、神经外胚层和中胚层。在10周龄时收集三苯氧胺注射组小鼠的组织。将髓母细胞瘤和后肢横纹肌肉瘤的转录谱与邻近正常的小脑和骨骼肌组织进行比较。三苯氧胺诱导的小鼠尾皮基底细胞癌病变CAGGS-核心；R26-烟雾2将小鼠与来自年龄匹配WT的尾皮进行比较(R26-烟雾2)控件。使用Resolver软件进行的生物统计分析生成了157个基因的列表，这些基因在所有三种Hh相关肿瘤中的表达都发生了显著变化；所有三种肿瘤中有101个基因上调，而56个基因下调(补充表S4).
正如预期的那样，Hh途径的转录靶点得到了充分验证，例如Ptch1、Ptch2、Gli1、和细胞周期蛋白D1，在所有三种类型的肿瘤中均上调。令人惊讶的是，Gli2公司，是Hh转录反应的关键效应器，但不是以前与Hh介导的转录调节相关的效应器，被发现在所有肿瘤类型中都显著上调。
PDGFRα以及胰岛素样生长因子（IGF）和有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径的几个成分，包括IGFBP4型和IGFBP7型IGF途径和地图3K7和地图4K4在MAPK通路中，在所有三种肿瘤来源中均显著上调(补充表S1). 据报道，PDGFRα在人和人的基底细胞癌中上调对Hh途径激活的反应第1部分+/−老鼠(30); 我们的新数据表明，这一途径可能有更广泛的参与。有趣的是，PDGFRα的配体PDGFA在基底细胞癌和髓母细胞瘤中也上调，但在横纹肌肉瘤中没有上调(补充表S1–S3). 此外，SmoM2相关横纹肌肉瘤和髓母细胞瘤的免疫染色也证实PDGFRα的高水平表达(). 虽然我们只检测到胰岛素样生长因子2在横纹肌肉瘤（胚胎型横纹肌肉瘤的标志）中，两种IGF-结合蛋白，IGFBP4型和IGFBP7型，在所有三种肿瘤中均高度上调。因此，IGF调节系统可能是所有Hh相关肿瘤类型的共同靶点。
Hh相关肿瘤中Hh、PDGFRα、IGF和MAPK通路的调节。利用抗PDGFRα抗体的免疫组织化学方法鉴定横纹肌肉瘤中的强PDGFRβ染色(A类)和髓母细胞瘤(B类)相对于控制骨骼肌和小脑组织。C、，培养的原代髓母细胞瘤细胞Hh-调节mRNA表达的半定量RT-PCR分析CAGGS-核心；R26-烟雾2存在或不存在SmoM2抑制剂KAAD-环帕明的小鼠。治疗持续72小时。下降楔，cDNA模板的系列稀释。
为了确定这些基因的表达是否需要持续的Hh信号传导，我们使用KAAD-环帕明（Hh通路特异性拮抗剂环胺的衍生物）来调节SmoM2活性(31)在小脑肿瘤的原代培养中。新分离的2个月大的髓母细胞瘤细胞CAGGS-核心；R26-烟雾2用3μmol/L KAAD-环帕明处理小鼠72小时，用半定量逆转录-PCR（RT-PCR）分析基因表达。上面讨论的所有假定靶点都在对KAAD环胺的反应中下调，而平滑（Smo）和细胞质肌动蛋白似乎保持不变(; 数据未显示）。这些数据表明Hh信号对维持高水平的PDGFRα、IGFBP4、IGFBP7、MAP3K7、和地图4K4抄本。
讨论
这个冷却器CAGGS线作为Cre驱动程序，用于小鼠散发性肿瘤建模
当在遗传野生型环境中启动单细胞水平的突变导致肿瘤转化时，会导致偶发性癌症。然而，在大多数目前的转基因和传统敲除模型中，特定组织的所有细胞都激活了起始致癌事件(19). 还制定了其他策略来生成零星模型系统。例如，染色体内重组和姐妹染色单体交换不相等，发生率为10−3到10−7每个细胞生成的事件，已用于激活K-ras（拉斯维加斯），生成了一个小鼠模型，该模型紧密再现了体细胞中自发癌基因的激活(32). 随着肿瘤抑制基因和癌基因条件等位基因库的增加，我们推断具有广泛表达和调节重组的诱导Cre系，如冷却器CAGGS，可能提供一个更广泛适用和更具成本效益的散发性肿瘤发生模型。
在这里报道的工作中冷却器CAGGS该系将广泛组织中单个细胞中CreER活性的零星泄漏与定时、可滴定的他莫昔芬介导的激活相结合，以产生一个强健的、受调控的零星肿瘤发生模型。尽管我们已经证明了这种方法对显性作用癌基因（SmoM2）的有效性，但同样的一般策略也适用于针对特定遗传结果进行适当配置的任何Cre依赖模型。这可能包括此处的“显性”肿瘤模型，或假定抑癌基因的条件等位基因。当生殖系突变导致胚胎致死时，后一种策略可能特别有用，这是几个关键的肿瘤调节剂的情况，包括阿普克，普顿、和卢比。我们采用的方法为全面筛选小鼠的抑癌活性奠定了基础。此外，最近报道了一种携带冷却器CAGGS为便于检测Rosa26基因座重组而配置的转基因应该能够在构建嵌合体时直接进行快速肿瘤筛查(33).
髓母细胞瘤、基底细胞癌和横纹肌肉瘤CAGGS-核心；R26-烟雾2老鼠
这个第1部分+/−Hh通路相关肿瘤小鼠模型第1部分与Gorlin综合征相关的三种主要肿瘤类型：基底细胞癌、髓母细胞瘤和横纹肌肉瘤的外显率相对较低。在这个模型中，只有10%第1部分+/−小鼠发生横纹肌肉瘤和髓母细胞瘤(12,13). 此外，强健的基底细胞癌形成需要紫外线照射，并且具有较长的潜伏期(23). 肿瘤发病率可以通过肿瘤抑制功能的额外丧失而在遗传上得到提高。例如，p53基因的缺失使髓母细胞瘤的发生率显著增加到95%第1部分+/−老鼠(34). 然而，在本研究中未观察到横纹肌肉瘤和基底细胞癌的发病率或发病时间发生改变第1部分+/−; P53基因−/−背景(34). 这个CAGGS船员；R26-烟雾M2该模型对所有三种特征性肿瘤的外显率都显著较高。相对于Hh介导的肿瘤发生的现有模型(14–18)新模型中小鼠体内肿瘤形成的潜伏期短、外显率高、肿瘤类型谱增加，可能有助于临床前筛选抗肿瘤药物。
迄今为止，对Hh相关肿瘤的关注主要集中在髓母细胞瘤和基底细胞癌。横纹肌肉瘤是最常见的儿童软组织肉瘤，也与Gorlin综合征有关，尽管发病率较低(三). 令人惊讶的是CAGGS-核心；R26-烟雾2在散发性漏液组和三苯氧胺诱导组，模型发展为多灶横纹肌肉瘤，外显率均为100%；三苯氧胺注射液增加了肿瘤的发生频率，增加了肿瘤范围，加速了肿瘤的形成。虽然横纹肌肉瘤很可能起源于骨骼肌谱系内，但这些肿瘤的潜在细胞起源尚不清楚。研究表明，声波Hh（Shh）信号在胚胎肌祖细胞的分化以及随后快慢收缩纤维的分化中起着关键作用(1). 通过Smo激活观察到的出生后肌肉肿瘤的高频率可能表明Hh信号在出生后骨骼肌的发育或修复中持续发挥作用。然而，关于Hh信号在产后肌肉细胞调节中的扩展作用的报道很少(35). 正常肌肉的分析CAGGS-核心；R26-烟雾2小鼠表明，在分化后的骨骼肌细胞中激活SmoM2不足以修改正常分化的骨骼肌程序。相反，Hh信号很可能在干细胞或祖细胞内起作用，启动横纹肌肉瘤的形成。
Hh信号转导与内皮源性组织肿瘤
Shh最近被认为在胰腺癌的发生中起重要作用。胚胎期Shh配体的过度表达导致胰腺上皮内瘤样病变的发生，这些病变被认为是侵袭性胰腺癌的前兆(27). 有趣的是，我们观察到胰腺中SmoM2的激活会导致黏液性囊性化生，这种病变可能与人类中的低度MCN相对应。MCN虽然通常是良性的，但被认为具有恶性潜能(36). 目前对从低度粘液性囊性瘤变到高度异型增生再到胰腺恶性肿瘤进展的认识仍然非常有限，部分原因是缺乏动物模型。胰腺粘液性病变见于CAGGS-冷却器，R26-SmoM2小鼠很可能处于致瘤过程的早期阶段，为探索控制胰腺恶性转化的事件提供了新的机会。
包括肺、食道、胃和前列腺在内的其他内胚层衍生器官的肿瘤发生也与Hh信号有关(8,27,28,37–39). 在这些研究中，Hh配体和伴随的Hh信号活性在人类肿瘤细胞系中上调，并且在肿瘤细胞生长过程中需要持续的信号传导在体外分析和异种移植模型(27,28,37–39). 尽管我们在所有这些器官中观察到高效的CreER介导的重组，但即使在三苯氧胺诱导后也没有观察到致癌转化。此外，我们对Pb-Cre4；R26-烟雾2小鼠即使在12个月大的时候也没有检测到小鼠前列腺的肿瘤转化。因此，Hh信号传导可能不足以诱导前列腺肿瘤发生，因此可能在促进生长或转移方面具有有限的作用。
一种常见的Hh调节肿瘤程序
从这些和其他有关Hh相关肿瘤的研究中产生的一个中心问题是，是否有共同的机制原理强调肿瘤在不同组织中的发展。不同的Hh依赖性肿瘤的转录谱分析提供了一些见解。除了Hh途径中的预期反馈成分（Ptch1、Ptch2和Gli1）和已知的细胞周期调节因子（Cyclin D1）对该策略提供了有用的验证外，我们还鉴定了几个新基因。我们观察到Gli2本身是Hh靶基因的阳性转录调节因子(40)，在所有三种肿瘤中上调。我们的结果与最近的几项研究一致，这些研究表明，Hh通路激活导致髓母细胞瘤和基底细胞癌中Gli2表达增加(18,41,42). 此外，在转基因模型中，皮肤中Gli2的过度表达可诱导BCC的形成(17)，提示Gli2在Hh诱导的肿瘤发生中的作用。总之，这些发现表明了一种可能的共同机制，即肿瘤的形成和生长可能需要上调Gli1和Gli2以最大限度地提高转录输出。
我们还检测到所有三种Hh相关肿瘤中PDGFRα、IGF和MAPK通路成分的显著上调，表明Hh信号可能在肿瘤细胞中激活新的信号反应。有趣的是，PDGFRα在多潜能间充质细胞系（10T1/2）和Gli1诱导的中枢神经系统增生中受Gli1转录调节(30,43). 据报道，PDGFRα的表达在第1部分+/−小鼠基底细胞癌模型和人基底细胞癌(30). 通过MAPK途径激活的PDGF信号也与人类转移性髓母细胞瘤有关(44). 有趣的是，阻断PDGF和MAPK通路抑制BCC和髓母细胞瘤细胞的生长和迁移在体外(30,44). 这里报道的结果也表明PDGFRα上调在横纹肌肉瘤形成中可能起作用。因此，PDGF通路可能是所有Hh相关肿瘤的共同治疗靶点。
以前的研究表明胰岛素样生长因子2对于横纹肌肉瘤和髓母细胞瘤的发展必不可少第1部分+/−老鼠(45). 此外，Shh和IGF2在髓母细胞瘤形成中协同作用(46)IGF诱导的磷脂酰肌醇3-激酶信号的激活稳定了Shh转录靶N-myc公司小脑颗粒神经元前体(47). 在胎儿前列腺发育过程中，Shh已被证明可调节另一种IGF通路调节因子的表达，IGFBP6型(48).IGFBP6型也被确定为Gli1诱导上皮细胞系转化的潜在直接转录靶点(49). 观察到的上调IGFBP4型和IGFBP7型Hh相关肿瘤及其对肿瘤细胞中Hh通路的下调抑制进一步支持了这两条通路之间更普遍的联系。
PDGF和IGF通路可以通过细胞内级联信号调节MAPK的活性，包括细胞外信号调节激酶和c-Jun NH2-末端激酶（JNK）家族激酶(30,44). MAP4K4是MAPK通路的一个成员，在MAPK级联中作用于MAP3K7的上游，激活JNK家族激酶(50). 有趣的是，MAP3K7和MAP4K4在所有三种与Hh相关的肿瘤中都上调，并且它们在培养的肿瘤细胞中的表达也依赖于正在进行的Hh通路活性。总之，这些数据表明，在Hh依赖性致瘤程序中存在潜在的信号网络，如Hh、PDGF、IGF和MAPK途径。
目前开发更具体的基于机制的癌症治疗的策略在很大程度上依赖于候选靶点的确定。Hh途径拮抗剂的动物研究显示出相当大的前景(8,10,11). 然而，Hh信号在器官的发育、维持和再生中的参与可能会使仅基于直接通路抑制的治疗策略复杂化。鉴定Hh相关恶性肿瘤的其他常见成分可以使针对Hh相关肿瘤的靶向治疗更有效的联合治疗策略成为可能。
