大肠腺癌基因组测序确定复发VTI1A-TCF7L2聚变

摘要

结直肠癌已成为了解基因和途径中致癌突变的渐进获取的模型，例如APC、CTNNB1,TP53型RAS基因与TGF-β信号转导^1,7.外显子全序列测定最近发现了可能导致致癌的其他复发突变^2,三此外，结直肠癌的基因组研究有详细的肿瘤亚群，其特征是染色体不稳定（约60-70%），或高度微卫星不稳定，通常与遗传或散发性错配修复缺陷相关（约15%），还有一些病例属于这两类^7,8.

我们对9例结直肠癌和配对非肿瘤组织对照的基因组进行了测序(表1). 肿瘤在化疗或放疗前切除，并根据病理学估计纯度>70%进行测序。我们使用SNP阵列来确认肿瘤纯度和推断的倍性，并选择拷贝数改变提示染色体不稳定表型的样本。我们用成对的101碱基读码对这些样本进行了全基因组测序，平均肿瘤基因组的序列覆盖率为30.7倍，生殖系的覆盖率为31.9倍(表1). 我们能够可靠地调用约83%碱基的突变（范围为78-87%），这是基于唯一对齐序列读取的能力，并在肿瘤中获得≥14倍的覆盖率，在生殖系中获得≥8倍的覆盖度。

这些病例揭示了序列和基因组结构的频繁变化。使用MuTect和Indelocator算法^9——11，我们称9个样本中的137968个候选体细胞突变。为了评估我们的突变调用，我们验证了预测会导致蛋白质编码序列中非同义替换或插入缺失的候选突变(补充表1和2). 在这712名候选者中，521人可以通过质谱基因分型进行检测，我们确认84%（439人）为体细胞改变。值得注意的是，对于高等位基因比例（>0.33）的突变，基因分型验证率约为95%（308例中有292例）。较高等位基因分数突变的较高验证率与质谱技术要求变异等位基因检测最低阈值的可能性一致。

全基因组序列还允许我们评估体细胞突变的总体特征。使用所有候选突变，我们计算出相对于单倍体基因组的总体突变率约为5.9/Mb，范围为4.0-9.8个/Mb突变(表1). 假设这些事件中有多达16%为假阳性，这将预测每Mb约5个突变的突变率。该突变率超过了之前估计的测序拼接阵列中每Mb 1.2个突变率^三这可能反映了大规模平行测序的更高灵敏度。基因间区域的突变率（6.7/Mb）略高于内含子和外显子序列（分别为4.8/Mb和4.2/Mb），可能是因为选择压力和转录偶联修复^12,13在编码序列中，我们看到的非同义突变率为3.1/Mb，类似于桑格重测序中的2.8/Mb突变率².

体细胞突变的基本背景与之前的报道一致，即结直肠癌在CpG二核苷酸处表现出强烈的C>T转换倾向^2,三; 我们发现CpG位点的突变（百万分之37–72）比CpG跃迁以外的所有突变（百万分之3.2–8.5）都有所增加(补充图1). 用于检测偶发性错配修复缺陷的一致基因座的检查¹⁴没有微卫星不稳定的迹象。我们观察到编码区内的插入-缺失率较低（每个肿瘤0-5个事件）。

通过对非同义编码体细胞替换和小插入缺失的分析，在两个或多个肿瘤中鉴定出24个具有此类突变的基因(补充表3). 虽然小样本集不足以检测复发突变，KRAS、APC和TP53型尽管如此，相对于背景突变率而言，得分仍然显著。事实上，我们注意到KRAS、APC和TP53型分别在5个、7个和6个个体的肿瘤中(补充表2). 我们发现了其他已知的结直肠癌突变基因，例如NRAS、SMAD4、PIK3CA和FBXW7型，但鉴于样本集较小，这些基因的突变率没有达到统计显著性。需要大型测序项目来确定一组具有显著重复突变的完整基因；这些项目目前正在癌症基因组图谱下进行（见URL）。

全基因组测序可以详细研究染色体重排的性质。使用我们的算法（dRanger^10,11)，我们在9个肿瘤中确定了675个候选体细胞重排（平均值75；范围5-182；图1和补充表4)通过识别多个配对读取映射到不同基因组位点或方向错误的实例。为了评估这些发现的准确性，我们通过在肿瘤和生殖系DNA的假定连接处进行PCR，检测了331个候选体细胞重排；我们汇集PCR产物并对其进行热测序。我们确认92%的呼叫是真正的体细胞重排；我们发现四个调用（约1%）是种系重排，并将其从进一步分析中删除，其余22个调用（大约7%）未能在肿瘤或种系DNA中生成PCR产物。具有更多体细胞编码突变的肿瘤也包含更多重排(R（右）²= 0.55).

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图1

在以CIRCOS图显示的9例大肠肿瘤中检测到DNA结构重排和拷贝数改变³³染色体端到端呈圆形排列，每个染色体的细胞带标记在外环中。内环显示从全基因组测序推断出的拷贝数数据，蓝色表示缺失，红色表示获得。在圆圈内，重排显示为弧，其中染色体内事件显示为绿色，染色体间易位显示为紫色。

大多数预测的重排（82%）是染色体内重排，在这些重排事件中，大约一半（46%）涉及将染色体区域相隔超过1Mb的“长程”重排事件。根据配对序列的分析，我们将发生在亚Mb尺度的短程重排分为缺失（64%）、串联重复（19%）和反转（17%）(补充图1). 我们研究了这些重排中断点处的序列，方法是对跨越连接的PCR产物进行焦磷酸测序，并使用BreakPointer工具对连接预测重排的融合序列进行测序¹⁰连接处通常显示1–6个碱基的显著微同源性，非模板DNA的插入并不常见(补充图1)，观察结果与乳腺癌报告的结果一致¹⁵也与之前的报告一致，串联重复显示出更大程度的微同源性¹⁵.

三个样本（CRC-3、CRC-4和CRC-6）显示了染色体间易位的聚集性，其中一系列重排通过平衡易位导致两到三条不同染色体的广泛区域重排(图1). 我们看到了CRC-4中第8和20号染色体与CRC-6中第5和11号染色体之间的融合网络(图2). 因为这些事件中的大多数都不涉及拷贝数发生实质性改变的区域，它们代表了一种模式的变体（称为色三胞菌¹⁶)涉及由单个灾难性复杂基因组事件诱导的交替拷贝数状态。我们的结果表明，根据拷贝数分析，基因组中似乎“安静”的区域有可能发生复杂的结构改变。

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图2

两种结直肠癌染色体对之间的复杂重排。图的中央部分包含所有染色体上的拷贝数剖面，并在x个轴和复制数比率（log2）的比例年每个图的轴。上面的图显示肿瘤CRC-4，下面的图显示CRC-6的拷贝数分布，黑点标记沿着基因组每个位点推断的拷贝数比率。上面的插入框显示了CRC-4染色体8（深蓝色）和20（赭石色）的拷贝数和重排的详细视图，着丝粒标记为紫色圆圈。dRanger检测到的重排显示为绿色（染色体内）和紫色（染色体间）。下部的插入框显示CRC-6的详细拷贝数和重排图像，插入框显示5号染色体（红色）和11号染色体（灰色），并用线条标记基因组重排的位置。

我们检测了受基因组重排影响的特定基因。我们在已知的癌症相关基因中发现了微小的缺失，包括删除了表皮生长因子受体CRC-9中删除了PTEN公司在CRC-8中。多个样本中有22个基因存在断点。最常见的重排基因是宏2,A2BP1型,FHIT公司和IMMP2L公司(补充表3)它跨越了大量的基因组位点。以前的研究表明，这些基因在癌症中经常会出现局部缺失^17,18可能是因为结构脆弱。值得注意的是，两个样本CRC-5和CRC-7包含染色体3:12易位，其中染色体3的不同基因间区域融合到甲基转移酶编码的第一内含子PRMT8项目然而，我们没有发现PRMT8项目两个样本中任意一个样本的RNA转录本（数据未显示）。

接下来，我们试图鉴定功能性融合基因。这种情况以前在肺癌中也曾出现过¹⁹和前列腺²⁰除其他外，据我们所知，尚未有结肠癌的报道。我们发现了11个重排（2个染色体间重排和9个染色体内重排），这些重排可以产生框架内融合转录本(表2). 通过从97例原发性结直肠癌中筛选互补DNA（cDNA），我们发现其中一个可能的融合转录物反复表达。最初的观察发生在CRC-9，涉及10号染色体上的染色体内融合，融合了VTI1A型编码一种v-SNARE蛋白，介导高尔基复合体内细胞内小泡的融合²¹相邻基因的第四外显子，TCF7L2型(图3a-c). 我们在框架中找到VTI1A至TCF7L2另外两例和97例原发性结直肠癌中的三例（包括CRC-9指数病例）的融合(补充图2).

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图3

复发基因融合VTI1A型和TCF7L2型. (一)上部示意图描述了外显子（垂直线）在VTI1A型和TCF7L2型在第10号染色体上彼此相邻。放大显示了在肿瘤CRC-9中发现的不一致配对末端读数的位置，其中一个读数（用蓝色标记）位于VTI1A型另一个阅读（标记为红色）是在TCF7L2型. (b条)上图描述了融合生成的预测融合转录本的结构。插图中描述了跨越两个内含子融合的精确读数（用闪电标记），读数区域与原始值相对应VTI1A型蓝色内含子和TCF7L2型红色(c（c）)天然蛋白质结构域VTI1A型和TCF4-TCF7L2型，包括TCF4的两个备用C端子尾部，如图所示。以下是由融合基因外显子3编码的融合蛋白的结构VTI1A型第4外显子TCF7L2型CRC-9中确定。融合的两个变体显示为来自NCI-H508细胞系的数据，并显示编码全长（E-tail）和较短（B-tail）C末端的变体均表达（数据未显示）。(d日)相对表达式的测量VTI1A-TCF7L2用两种短发夹RNA构建物中的一种感染NCI-H508细胞中的mRNA，靶向融合基因，相对于靶向控制载体感染细胞中的表达GFP公司. (e（电子）)NCIH508细胞系的锚定非依赖性生长，表达VTI1A-TCF7L2和阴性对照DLD-1大肠腺癌细胞在RNA干扰介导的敲除VTI1A-TCF7L2与控制击倒目标相比GFP公司.

复发的发现VTI1A-TCF7L2融合特别有趣。TCF7L2型编码一种转录因子，称为TCF4，属于TCF/LEF家族，与β-catenin（编码CTNNB1公司)激活和抑制肠上皮细胞增殖和分化所必需基因的转录²².TCF7L2型是TCF/LEF家族在结直肠癌中表达最广泛的成员²³其表达与结直肠癌的生存率呈负相关²⁴此外，结直肠癌的遗传风险受基因多态性的影响TCF7L2型(^{参考文献。25,26})以及增强子的多态性MYC公司TCF4与β-catenin协同结合^27,28值得注意的是，TCF7L2型已知在结直肠癌中存在体细胞点突变^2,三我们还发现CRC-5中的一个点突变影响了第10外显子3′端的剪接位点，这是编码HMG-box DNA结合域的外显子，可能是一种有害突变。

测试的功能重要性VTI1A-TCF7L2融合后，我们找到了一个包含这种事件的细胞系。因为CRC-9中的融合是由介于VTI1A型和TCF7L2型，我们研究了38个结直肠癌细胞系的SNP阵列数据，以寻找类似的缺失。我们发现细胞系NCI-H508(补充图2)携带这样一个缺失，我们发现存在一个连接VTI1A型第5外显子TCF7L2型我们设计了针对跨越融合序列的RNA干扰载体。根据定量RT-PCR测定，两种载体将融合mRNA的表达降低了70%以上，导致NCI-H508细胞的锚定非依赖性生长显著减少，但DLD-1细胞系不含融合基因(图3d，e). 这一结果表明VTI1A-TCF7L2融合在NCI-H508细胞生长中起着关键作用。

生物化学功能VTI1A-TCF7L2融合蛋白尚不清楚。融合省略了TCF4的氨基末端结构域，该结构域结合β-连环蛋白(图3c). 对于TCF/LEF系列的其他成员（但不适用于TCF7L2型)，省略氨基末端结构域的亚型自然产生，并产生显性负蛋白²⁹然而，我们并不期望VTI1A-TCF7L2融合蛋白作为一种完全显性负性蛋白，因为工程化显性负性TCF4等位基因已被证明强烈抑制结直肠癌细胞系的增殖³⁰考虑到该融合基因中遗漏了β-连环蛋白结合域，我们最初假设该新鉴定的蛋白质可以使TCF4和/或β-连环素靶点的β-连链蛋白非依赖性激活。然而，携带融合蛋白的三种肿瘤也携带突变空气污染指数其产物抑制β-catenin。（CRC-9在空气污染指数，第二个肿瘤在空气污染指数第三个肿瘤有p.Ala1247Val空气污染指数变更）。NCI-H508是杂合的空气污染指数（携带半合子缺失）并携带正常等位基因CTNNB1公司，编码β-catenin，但在功能上依赖于β-catening(补充图2).

这些结果表明VTI1A-TCF7L2在激活的β-catenin环境中表达，NCI-H508依赖于融合基因和β-catening，尽管VTI1A-TCF7L2β-catenin结合域。需要进行研究以确定是否以及如何（i）融合基因与β-catenin的功能相互作用或干扰，以及（ii）添加一段N末端SNARE结构域影响功能或定位。与最近的报告相结合时TCF7L2型结直肠癌的突变以及TCF4在结直肠癌中也具有肿瘤抑制功能的证据^31,32这些数据表明，β-catenin及其协同因子在结直肠癌中的功能更加复杂。

本报告描述了首次对结直肠癌进行的全基因组测序研究。我们的结果没有证据表明高频复发易位，例如前列腺癌中的易位²⁰然而VTI1A-TCF7L23%的结直肠癌发生融合，表明该病发生了功能重要的融合事件，并提示进一步的结构特征可能会发现新的复发性重排。

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脚注

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