SirT1 Regulation of Antioxidant Genes Is Dependent on the Formation of a FoxO3a/PGC-1α Complex

Yolanda Olmos; Francisco J. Sánchez-Gómez; Brigitte Wild; Nieves García-Quintans; Sofía Cabezudo; Santiago Lamas; María Monsalve

doi:10.1089/ars.2012.4713

抗氧化剂氧化还原信号。2013年11月1日；19(13): 1507–1521.

数字对象标识：2009年10月10日/2012.4713年9月10日

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PMID：23461683

抗氧化基因的SirT1调控依赖于FoxO3a/PGC-1α复合物的形成

尤兰达·奥尔莫斯,^1,^*^† 弗朗西斯科·桑切斯·戈梅斯,^2,^* Brigitte Wild公司,^1,^三尼维斯加西亚·昆坦,^1,^三索菲亚·卡贝祖多,^1,² 圣地亚哥喇嘛,²和玛丽亚·蒙萨尔维^三

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摘要

SirT1是一种III类组蛋白去乙酰化酶，与代谢和活性氧物种控制有关。在血管系统中，它被证明可以减少内皮细胞的超氧物生成，防止内皮细胞功能障碍和动脉粥样硬化。然而，调节SirT1抗氧化功能的机制仍有待确定。转录因子FoxO3a和转录辅激活物过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活物1α（PGC-1α）已被证明诱导抗氧化基因的表达并被SirT1去乙酰化。目的：在这里，我们研究了抗氧化基因的SirT1调控以及FoxO3a和PGC-1α在这一调控中的作用。结果：我们发现，SirT1调节牛主动脉内皮细胞中几种抗氧化基因的表达，包括锰超氧化物歧化酶（MnSOD）、过氧化氢酶、过氧化物酶类3和5（Prx3、Prx5）、硫氧还蛋白2（Trx2）、硫氧化还蛋白还原酶2（TR2）和解偶联蛋白2（UCP-2），并可定位于这些基因的调控区域。我们还发现，FoxO3a或PGC-1α的敲除可以阻止SirT1过度表达诱导抗氧化基因。此外，SirT1增加了FoxO3a/PGC-1α复合物的形成，这是通过联合免疫沉淀（IP）分析确定的，同时降低了H₂O（运行）₂-依赖性FoxO3a和PGC-1α乙酰化。数据显示FoxO3a敲除增加PGC-1α乙酰化水平和反之亦然，表明FoxO3a和PGC-1α上的SirT1活性可能依赖于FoxO3a/PGC-1β复合物的形成。创新：提出了SirT1活动的统一机制。结论：我们表明，血管内皮细胞中抗氧化基因的SirT1调节依赖于FoxO3a/PGC-1α复合物的形成。抗氧化剂。氧化还原信号。19, 1507–1521.

介绍

一ll风险因素动脉粥样硬化与内皮活性氧（ROS）水平增加有关(51). 血管内皮中ROS的过度产生导致内皮功能障碍和动脉粥样硬化的进展(14,18). 内皮功能障碍的特征是一氧化氮（NO）生物利用度降低，继而内皮依赖性血管舒张和线粒体生物生成受损(7,39). 活性氧对正常内皮细胞功能也是必要的，并且已经证明在血管生成中发挥重要作用(17,48). 事实上，异常高的内皮活性氧水平也与功能失调的血管生成过程有关，如与肿瘤相关的血管生成(47)和糖尿病视网膜病变(4). 在正常生理条件下，细胞中ROS的主要来源是线粒体电运输链(22). 在病理状态下，线粒体ROS增加导致NADPH氧化酶（NOX）激活，其机制尚不清楚(12). NOX激活显著增加细胞ROS生成，并导致氧化应激依赖性组织损伤(24).

创新

氧化应激与衰老过程密切相关的概念受到了一些研究的挑战，这些研究强调了控制基因组稳定性的蛋白质（如SirT1）所起的主要作用。在这里，我们表明SirT1在氧化应激控制中起着中心作用，并在基因组稳定性和活性氧物种之间提供了中心联系，这表明衰老过程的统一机制也是血管内稳态调节的核心。

活性氧水平由一个复杂的防御系统控制，该系统限制氧化剂的积累，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶类、硫氧还蛋白和硫氧还毒素还原酶，以及参与谷胱甘肽水平和氧化还原状态控制的酶(27). 鉴于线粒体在活性氧控制中发挥的关键作用，该细胞器特别富含抗氧化蛋白，包括阻止线粒体产生活性氧的解偶联蛋白2（UCP-2）、解毒酶，如锰超氧化物歧化酶（MnSOD）、谷胱甘肽过氧化物酶4（Gpx4）、过氧化物酶5（Prx5）、，硫氧还蛋白2（Trx2）和硫氧还酶还原酶2（TR2），以及过氧化物酶原3（Prx3）和谷胱甘肽过氧化物酶1（GPx1）等线粒体亚型(27).

在过去的几年中，一些报告强调了SirT1作为内皮细胞内环境稳定的关键调节器的作用。SirT1是一种III类组蛋白脱乙酰酶。它对细胞氧化还原和营养状态高度敏感，已知它可以控制基因组稳定性和细胞代谢。它使具有不同细胞和组织功能的组蛋白和非组蛋白脱乙酰(10). 在血管系统中，SirT1已被证明调节血管生成过程(35)预防内皮功能障碍和动脉粥样硬化(44). 在这种情况下，SirT1被证明可以减少内皮细胞超氧化物的生成，抑制核因子-κB（NF-κB）信号传导，并减少粘附分子的表达。NF-kB活性和粘附分子的表达都是内皮氧化应激的标志，表明SirT1的保护活性可能与抗氧化剂的诱导有关(45). 然而，其在氧化控制中的作用仍然缺乏特征。

先前的研究表明，SirT1使转录因子FoxO3a脱乙酰化，这种调节增强了FoxO3a诱导抗氧化应激抵抗的能力(8). MnSOD和过氧化氢酶是FoxO家族转录因子（包括FoxO1a、FoxO3a和FoxO4）的特征性靶点。后来有证据表明，SirT1活性与心肌细胞中MnSOD水平的增加有关(46)和心脏中的过氧化氢酶(1)其中FoxO1a依赖性诱导和肾小管细胞(15)，其中它被提议与FoxO3a激活有关。此外，FoxO因子也被证明在内皮稳态调节血管生成中发挥关键作用(36). 在内皮细胞中，FoxO3a通过与转录共激活物过氧化物酶体增殖物激活受体γ-共激活物1α（PGC-1α）的相互作用，正向调节一组主要抗氧化基因(30). 反过来，先前已经证明PGC-1α可以保护内皮细胞免受ROS诱导的内皮功能障碍和细胞死亡的影响(49). 重要的是，PGC-1α是一种主要的代谢调节因子，是另一个SirT1靶点(25). SirT1对热量限制的反应是去乙酰化PGC-1α，并增强其对脂肪酸氧化和糖异生基因的活性(13,38). 值得注意的是，PGC-1α的表达受到SirT1的正向调节(2).

因此，我们决定确定SirT1在内皮细胞抗氧化系统调节中的作用。我们发现SirT1正向调节一组抗氧化基因的表达，并被招募到这些基因的启动子区域。重要的是，SirT1需要PGC-1α和FoxO3a来调节抗氧化基因的表达。我们观察到SirT1脱乙酰化PGC-1α和FoxO3a，以应对氧化应激，并增强PGC-1 al/FoxO3a转录复合物的形成和稳定性。

结果

SirT1调节氧化应激保护基因的表达

为了表征SirT1在抗氧化基因调控中的作用，我们首先使用重组腺病毒（Ad-SirT1）在牛主动脉内皮细胞（BAEC）中过度表达SirT1，并通过qRT-PCR和Western Blot分析由PGC-1α和FoxO3a调节的一组抗氧化基因的水平，即MnSOD、过氧化氢酶、Prx3、Prx 5、，Trx2、TR2和UCP-2。全尺寸Western Blot膜，包括研究中所有蛋白质的分子量标记，如所示补充图S1.

我们发现SirT1过表达增加了MnSOD、过氧化氢酶、Prx5和TR2的mRNA和蛋白水平。重要的是，SirT1还诱导了PGC-1α和FoxO3a的表达。然而，SirT1过表达未能增加Prx3的表达水平，实际上降低了Trx2和UCP-2 mRNA水平(图1A、B和补充图S2). 这一结果表明，SirT1实际上是内皮细胞中至少一些抗氧化基因的调节器，PGC-1α和FoxO3a mRNA表达的诱导可能在这一调节中发挥作用。我们还测试了SirT1过表达是否调节了另一个重要的抗氧化基因转录调节因子Nrf2的水平，但未发现SirT过表达显著改变Nrf2水平(补充图S3).

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图1。

SirT1调节氧化应激保护基因的表达。（A–D）牛主动脉内皮细胞（BAEC）中氧化应激保护基因的分析，这些细胞感染重组腺病毒后24小时收获。（A、C）qRT-PCR mRNA表达分析。（B、D）蛋白质分析（Western Blot）。（E）在对照组和SirT1过度表达的BAEC中监测活性氧水平的SirT1-依赖性变化，用50μM（M）H（H）₂O（运行）₂持续4小时或20μM（M）DMNQ持续2小时，如图所示。用CM-H标记细胞₂DCFDA和流式细胞仪分析（左和中面板），或用MitoSOX红标记并固定后，共焦显微镜分析。（F-G）血清缺失SirT1氧化应激保护基因的分析^+/+和SirT1^−/−MEF公司。BAEC公司（F）qRT-PCR。（G）西部印记。数据来自≥3个独立实验。数据为平均值+SD（*）第页≤0.05与对照组。呈现的斑点对应于一个典型的实验。

接下来，我们使用驱动SirT1特异性shRNA表达的重组腺病毒敲除BAEC中的SirT1。我们观察到，Ad-shSirT1不仅降低了MnSOD、过氧化氢酶、Prx5、TR2、PGC-1α和FoxO3a的水平，而且还降低了Prx3、Trx2和UCP-2的水平，这表明Sir T1也对Prx3Trx2、UCP-2进行了正调控(图1C、D和补充图S2). 这些结果表明，内源性SirT1是维持内皮细胞中一整套氧化应激保护基因的基础表达水平所必需的，并支持其对PGC-1α和FoxO3a表达水平的调节可能在这一过程中相关的观点。

SirT1过表达或敲除对细胞活力没有显著影响，这表明抗氧化基因调节不太可能是细胞活力改变的副作用(补充图S4).

为了评估抗氧化基因的SirT1调节是否真的增加了细胞的抗氧化能力，我们用中等浓度的H₂O（运行）₂(50 μM（M）)，并使用荧光探针氯甲基-2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（CM-H）评估了SirT1对总ROS水平的影响₂DCFDA）。我们发现SirT1降低了H区的DCF信号₂O（运行）₂-处理过的细胞，表明它实际上增加了细胞解毒能力(图1E，左侧面板）。接下来，我们测试了SirT1在存在内部活性氧源的情况下控制活性氧积累的能力。用2,3-二甲氧基-1-萘醌（DMNQ）处理BAEC，DMNQ是线粒体电子传递链的抑制剂，可驱动线粒体O的形成₂⁻以剂量依赖的方式，我们发现SirT1减少了DCF的积累(图1E，中间面板）。为了阐明SirT1对线粒体活性氧的影响，我们测试了用线粒体氧相对特异的探针MitoSOX标记的DMNQ处理细胞中的SirT1活性₂⁻（已经注意到，它还可以与其他氧化剂反应）(55). 我们观察到SirT1也显著降低了线粒体O₂⁻积累，支持SirT1增加线粒体解毒能力的观点(图1E，右侧面板）。

接下来，我们测定了SirT1中正在研究的抗氧化基因的表达水平^+/+和SirT1^−/−中小企业基金(11). qRT-PCR和Western Blot分析表明，所研究的氧化应激保护基因以及PGC-1α和FoxO3a在SirT1中的表达水平较低^−/−MEF比SirT1^+/+MEF，支持SirT1是抗氧化基因的一般调节器的概念，并需要维持抗氧化系统的基本表达水平(图1F–G和补充图S2). 有趣的是，人们注意到SirT1^+/-MEF还显示抗氧化蛋白水平显著降低，进一步强调了SirT1对其调节的相关性(图1G).

此外，当我们使用荧光探针CM-H测试SirT1缺失对总ROS水平的影响时₂DCFDA，我们发现SirT1^−/−MEF的ROS水平高于SirT1^+/+中小企业基金(补充图S5). 重要的是，还注意到SirT1表达在氧化应激条件下增加(补充图S6). 使用SirT1的全细胞提取物测试抗SirT1-抗体的特异性^+/+和SirT1^−/−Western Blot的MEF(补充图S7).

SirT1被招募到抗氧化基因的启动子区域

为了研究SirT1调节的机制，我们使用染色质免疫沉淀（ChIP）测试了SirT1-与目标基因启动子区域的关联。10%胎牛血清（FBS）和0.5%胎牛血清条件被用作调节SirT1活性的简单策略(8). 我们发现SirT1确实与钠2（MnSOD），过氧化氢酶,prx3系列,prx5型,解偶联蛋白-2,pgc-1α，和富士O3a(trx2型,tr2型未进行分析）。血清饥饿通常会增加SirT1的募集，但Prx5基因除外，它具有相反的作用(图2A和补充图S8). 这些数据表明，SirT1可能直接参与线粒体抗氧化基因的调控，包括PGC-1α本身。

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图2。

血清饥饿时，SirT1被招募到ROS解毒基因的启动子区域。（A–E）与所示ROS解毒基因对应的启动子区域的染色质免疫沉淀分析。使用特异性引物，通过qPCR分析交叉染色质启动子占用率。β-actin CDS用于控制非特异性富集。（A）SirT1结合位点。（B）SirT1位点的H4K16乙酰化水平。（C）Pol II招募。使用ATG的位置作为参考（+1），指示分析碎片的位置。（D、E）分析prx3和ucp-2基因。左侧面板，分析Pol II在转录起始区域和沿着基因的位置。中央小组，分析转录起始区域和ATG下游的“延伸”Pol II水平（Pol II在Pol II最大亚基CTD重复序列的Ser2位置磷酸化）。右面板，沿着ATG上游和下游的基因招募SirT1。使用ATG的位置作为参考（+1），指示分析碎片的位置。（F）mRNA和（G）分别通过qRT-PCR和蛋白质印迹分析在10%胎牛血清（FBS）或无血清（0.5%FBS）o/n中融合的BAEC细胞中SirT1靶基因的蛋白水平。数据来自≥3个独立实验。数据为平均值+SD（*）第页≤0.05与对照组。呈现的斑点对应于一个典型的实验。

接下来，我们决定评估SirT1募集是否与组蛋白乙酰化的减少有关。我们使用赖氨酸16（H4K16Ac）上组蛋白H4乙酰化形式的抗体进行了ChIP分析，赖氨酸是对SirT1活性高度敏感的位置(50). 我们发现乙酰化的变化与SirT1招募的变化呈负相关（更多的SirT1/更少的乙酰化）。这一结果表明，SirT1脱乙酰化物H4K16在抗氧化基因的补充时定位(图2B).

组蛋白去乙酰化通常与基因沉默和RNA聚合酶II（RNAP II）招募减少相关。我们通过ChIP监测RNAP II的募集，发现在转录起始位点附近的位置（所有基因的ATG引物，除了解偶联蛋白-2/-2500，因为在这种情况下，ATG位于外显子3），血清剥夺导致RNAP II募集的急剧减少，表明SirT1依赖性组蛋白脱乙酰化对RNAP II的募集产生负面影响(图2C).

由于血清缺乏并没有降低抗氧化基因的表达，在某些情况下反而增加了它(图2F–G和补充图S2)，我们首先分析了RNAP II募集的模式在上游SirT1结合位点是相同还是不同。我们发现，SirT1结合的上游位点显示了两种不同的模式。在草皮-2,过氧化氢酶和prx3系列，RNAP II结合也在饥饿条件下降低，但仅在prx3系列发起人。另一方面，RNAP II的招募实际上是由于在prx5型,解偶联蛋白-2和PPARγ辅激活因子1α启动子，表明SirT1的募集至少在某些情况下可能与替代起始位点RNAP II募集增加有关，尽管该位点本身乙酰化减少(图2C).

为了了解这两种招募模式如何导致共同的调控模式，我们选择了两个具有代表性的基因，prx3系列和解偶联蛋白-2为了进一步的分析，其中沿着基因监测SirT1结合、RNAP II募集和延伸RNAP II的水平(图2D-E). 如前所述，在转录起始点附近的位置，血清剥夺导致RNAP II募集减少，但下游导致RNAPⅡ水平增加。起始位点的招募减少和下游水平增加可能表明转录率增加。为了验证这一观点，我们使用抗RNAP II C末端结构域磷酸化形式（CTD2P）的抗体，通过ChIP监测RNAP II延长的水平。我们发现两组患者在血清饥饿状态下“延长RNAP II”显著增加prx3系列和解偶联蛋白-2基因，表明起始位点RNAP II募集减少被启动子清除增加所补偿。SirT1结合只能在prx3系列基因，但也在解偶联蛋白-2基因。这些结果可能解释了SirT1募集如何与持续或增加的基因表达相关，尽管血清剥夺导致RNA II募集普遍减少，正如观察到的那样(图2F–G,补充表S1).

SirT1需要PGC-1α和FoxO3a来诱导氧化应激基因的表达

SirT1控制一组抗氧化基因的表达，这些基因以前被描述为转录调节因子PGC-1α和FoxO3a的直接靶点(30,49). 重要的是，这两个因子在转录（见上文）和转录后水平上均受SirT1调节(8,38). 这些结果促使我们研究抗氧化基因上的SirT1活性在多大程度上依赖于这两种调节因子。

为了评估SirT1活性是否需要PGC-1α，我们测试了当SirT1在BAEC中过度表达时敲除PGC-1（Ad-shPGC-1）α的效果。通过qRT-PCR和Western Blot对抗氧化基因表达的分析表明，PGC-1α敲除细胞中SirT1对MnSOD、过氧化氢酶、Prx5、TR2和FoxO3a的诱导明显减少(图3A、B和补充图S2). 这些结果表明，PGC-1α是SirT1调节一组参与线粒体ROS解毒的基因所必需的。

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图3。

SirT1需要PGC-1α来诱导氧化应激保护基因的表达。（A、B）BAEC与Ad-SirT1和Ad-shPGC-1α或各自的对照腺病毒复合感染。感染后12h，细胞被剥夺血清o/n并收获。通过qRT-PCR分析氧化应激保护基因的表达（A）和Western Blot（B）.（C、D）。将BAEC全细胞提取物与特异性PGC-1α抗体或正常IgG进行免疫沉淀（IP），作为对照，并按指示进行western blot分析。输入表示1/10的全细胞提取物未经免疫沉淀。（C）BAEC被Ad-PGC-1α感染，感染后8 h用10 mM（M）烟酰胺15h。（D）BAEC与Ad-SirT1和Ad-PGC-1α或各自的对照腺病毒共感染o/n。感染后24h去除血清o/n，然后用50μM（M）H（H）₂O（运行）₂或车辆行驶4小时。（E）将汇合的BAEC在半乳糖培养基中培养，在无血清的情况下培养48小时。将全细胞提取物与特定PGC-1α或SirT1抗体或正常IgG进行免疫沉淀（IP），作为对照，并按指示进行western blot分析。数据来自≥3个独立实验。数据为平均值+SD（*）第页≤0.05与对照组。呈现的斑点对应于一个典型的实验。

我们已经证明SirT1直接调节PGC-1α的表达。为了评估SirT1对PGC-1α活性的调节是否也能发挥作用，我们首先测试了SirT1对BAEC中PGC-1 a脱乙酰的能力。首先，我们使用过表达PGC-1α的BAEC，并用泛硅蛋白抑制剂烟酰胺治疗。烟酰胺增加了乙酰化的PGC-1α，这表明血管内皮细胞中的sirtuins调节PGC-1的乙酰化。烟酰胺处理也导致高分子量形式的Ac-PGC-1α的增加，并且可能对应于多泛素化的PGC-1α(三,31). 因此，这一结果表明，sirtuins也可能在内皮细胞PGC-1α蛋白的稳定中发挥作用(图3C).

据描述，为了应对氧化应激，PGC-1α乙酰化水平显著增加(三). 为了直接评估SirT1对PGC-1α乙酰化的影响，我们测试了氧化应激条件下SirT1-过度表达的影响。我们发现，SirT1显著降低了PGC-1α乙酰化水平，而SirT1-敲除增加了PGC-α乙酰化，这表明，SirT1调节PGC-1β乙酰化以应对氧化应激(图3D和补充图S9). 重要的是，SirT1过表达也降低了氧化应激条件下PGC-1α的泛素化(补充图S10).

然后，我们使用联合免疫沉淀（co-IP）分析测试SirT1/PGC-1α相互作用。我们在半乳糖取代葡萄糖的培养基中培养BAEC 48小时，以促进线粒体代谢并诱导PGC-1α水平。在这些条件下，我们能够在PGC-1α免疫沉淀物和反之亦然，证实SirT1和PGC-1α在内皮细胞中相互作用(图3E). 为了测试SirT1/PGC-1α相互作用是否对氧化还原敏感，我们用抗氧化剂EUK-89预处理细胞；然而，没有观察到显著差异(补充图S11).

为了评估SirT1活性是否需要FoxO3a，我们测试了当SirT1在BAEC中过度表达时，敲除FoxO3a（Ad-shFoxO3）的效果。基因表达分析表明，SirT1诱导FoxO3a敲除细胞表达MnSOD、过氧化氢酶、Prx5、TR2和PGC-1α的能力明显降低(图4A、B和补充图S2). 这些结果表明，FoxO3a是SirT1调节抗氧化基因所必需的。

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图4。

FoxO3a是SirT1诱导抗氧化基因所必需的。（A、B）首先用Ad-SirT1或对照腺病毒对BAEC进行o/n感染，36 h后用Ad-shFoxO3a或对照腺毒对BAEC细胞进行o/n感染，最后用qRT-PCR测定ROS解毒基因的表达水平（A）和Western Blot（B）. (*)第页≤0.05与对照组。（C、D）对BAEC全细胞提取物进行免疫沉淀（IP）处理，以获得特定的FoxO3a（C）或抗HA（D）抗体或正常兔IgG作为对照，并按指示进行western blot分析。输入表示1/10的全细胞提取物未经免疫沉淀。（C）BAEC用10 mM（M）烟酰胺15h（D）BAEC与Ad-SirT1和Ad-FoxO3a-WT共感染o/n。感染后24小时，细胞被血清剥夺o/n，然后用50μM（M）H（H）₂O（运行）₂或车辆（E）汇合的BAEC在不含血清的半乳糖培养基中培养48小时。作为对照，用特异性FoxO3a或SirT1抗体或正常IgG对全细胞提取物进行免疫沉淀（IP），并用western blot进行分析，如图所示。数据来自≥3个独立实验。数据为平均值+SD（*）第页≤0.05与对照组。呈现的斑点对应于一个典型的实验。

我们已经证明SirT1调节FoxO3a的表达。为了确定SirT1对FoxO3a活性的调节是否也对SirT1-抗氧化活性起作用，我们测试了SirT1/是否调节内皮细胞中的FoxO3a乙酰化。烟酰胺治疗并未增加乙酰化FoxO3a水平，但导致高分子量Ac-FoxO3a的增加，这可能与多泛素化FoxO3a相对应(9). 因此，这一结果表明，sirtuins也可以在内皮细胞的FoxO3a蛋白稳定中发挥作用(图4C). 事实上，SirT1被发现可以减少氧化应激条件下FoxO3a的泛素化(补充图S10).

为了测试SirT1对FoxO3a乙酰化状态的影响，我们测试了SirT1过度表达的影响。如前所述(8)，FoxO3a被乙酰化以应对氧化应激，SirT1过度表达显著降低其乙酰化(图4D). 因此，这些结果证实了SirT1调节内皮细胞中FoxO3a乙酰化(图4D).

最后，我们用co-IP分析测试了内皮细胞中Sirt1和FoxO3a的相互作用。我们在葡萄糖被半乳糖取代的培养基中培养BAEC 48小时，这是一种诱导FoxO3a水平的条件。在这些条件下，我们能够识别SirT1 IP中的FoxO3a和PGC-1α，以及反之亦然证实SirT1和FoxO3a在内皮细胞中相互作用(图4E和补充图S12). 为了测试SirT1/FoxO3a相互作用是否对氧化还原敏感，我们用抗氧化剂EUK-89预处理细胞；然而，没有观察到显著差异(补充图S11).

SirT1调节PGC-1α/FoxO3a复合物的形成

我们之前已经证明PGC-1α和FoxO3a形成复合物来调节内皮细胞中的抗氧化基因(30). 考虑到SirT1对氧化应激基因的调节需要PGC-1α和FoxO3a，我们决定测试Sir T1是否对BAEC中的氧化应激反应调节PGC-1 al/FoxO3a复合物的形成。首先，我们测试了SirT1过表达（Ad-SirT1）的影响，发现SirT1-在这些条件下增加了与PGC-1α相关的FoxO3a水平(图5A上面板和补充图S2). 相反，SirT1的敲除（Ad-shSir T1）具有相反的效果(图5A下部面板和补充图S2)表明SirT1正向调节PGC-1α/FoxO3a复合物的形成。

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图5：。

SirT1调节PGC-1α/FoxO3a复合物的形成。（A）BAEC与Ad-PGC-1α和指示的腺病毒共感染。感染后12h，细胞被剥夺血清o/n，然后用50μM（M）H（H）₂O（运行）₂用特异性PGC-1α抗体或正常IgG对全细胞提取物进行免疫沉淀（IP），作为对照，并用Western Blot进行分析，如图所示。输入表示1/10的全细胞提取物未经免疫沉淀。（B）SIRT1公司^+/+和SIRT1^−/−MEF用Ad-PGC1α感染o/n，感染后12 h去除血清o/n。用特异性抗PGC1α抗体（PGC-1α）或兔IgG免疫沉淀细胞提取物作为对照（IgG），并用western blot进行分析。（C）BAEC与Ad-FoxO3a-WT和Ad-SirT1或相应的对照组共感染o/n，在感染后12 h去除血清o/n后，用50μgM（M）H（H）₂O（运行）₂蛋白质水平通过Western Blot分析（D）用Ad-SirT1、Ad-shSirT1或相应的对照腺病毒对BAEC进行o/n感染，感染后12 h，去除细胞血清o/n，然后用FoxO3a特异性抗体进行固定和免疫荧光分析。呈现的斑点对应于来自3个以上独立实验的代表性实验。

为了进一步研究SirT1在调节PGC-1α/FOXO3a复合物形成中的作用，我们使用SirT1^+/+和SIRT1^−/−过表达PGC-1α（Ad-PGC-1α）的MEF，并监测与PGC-1 a共IP的FoxO3a的量。我们观察到在PGC-1αIP中发现的FoxO3a的数量在SirT1中较低^−/−MEF比SirT1^+/+MEF，支持之前的观察，即SirT1是FoxO3a/PGC-1α复合物形成的正调节因子(图5B和补充图S2).

SirT1调节FoxO3a水平和磷酸化

磷酸化是调控FoxO亚细胞定位和活性的重要机制(9). 有人提出磷酸化和乙酰化是相互依赖的机制，它们相互作用以调节FoxO蛋白对不同刺激的反应(37). 因此，我们决定测试SirT1是否对FoxO3a磷酸化起作用。为此，我们在BAEC中过度表达SirT1（Ad-SirT1），并通过Western Blot检测FoxO3a的磷酸化水平。我们发现SirT1过度表达导致FoxO3a磷酸化显著降低，FoxO3a总水平显著增加(图5C). 同样，免疫荧光（IF）分析表明，SirT1过表达增加了核FoxO3a水平，而shSirT1具有相反的作用(图5D和补充图S13).

PGC-1α调节FoxO3a乙酰化水平和反之亦然

两种替代机制可以解释SirT1在PGC-1α/FoxO3a复合物上的活性，SirT1可以单独作用于PGC-1β和FoxO3a，也可以作用于预先形成的复合物。为了确定PGC-1α或FoxO3a的乙酰化状态是否会受到PGC-1 al/FoxO3a复合物形成的影响，我们测试了PGC-1 a击倒BAEC中的FoxO3a乙酰化水平和FoxO3a击倒BAEC中的PGC-1 a乙酰化水平。我们发现抑制PGC-1α表达导致FoxO3a乙酰化显著增加(图6A和补充图S2). 类似地，shRNA-介导的FoxO3a敲除诱导乙酰化PGC-1α的增加(图6B和补充图S2). 这一结果可能表明SirT1可能对PGC-1α/FoxO3a复合物具有活性，因为在缺乏这些因素之一的情况下，另一个可能不会脱乙酰。

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图6。

FoxO3a和PGC-1α相互影响乙酰化水平。（A、B）BAEC被Ad-shPGC-1α感染（A）Ad-shFoxO3a公司（B）或相应的对照腺病毒，感染后12h，细胞被剥夺血清o/n并收获。用FoxO3a对全细胞提取物进行免疫沉淀（IP）（A）或PGC-1α（B）特异性抗体或正常IgG作为对照。用western blot分析乙酰化水平。（C、D）用Ad-PGC-1α或对照Ad-S感染BAEC，并在感染后48小时收集细胞。（C）western blot分析WCE中FoxO3a磷酸化。（D）FoxO3a.的免疫荧光分析。左面板共焦显微镜图像。右侧面板，FoxO3a细胞质/核比率。数据来自≥3个独立实验。数据为平均值+SD（*）第页≤0.05与对照组。

我们已经证明，SirT1的FoxO3a脱乙酰化降低了FoxO3a-Akt依赖的磷酸化。现在我们测试了PGC-1α过表达是否具有相同的效果。我们发现，PGC-1α的过度表达导致Akt依赖性FoxO3a磷酸化显著降低，并伴随着FoxO3总水平的增加(图6C). 为了确定这种减少的磷酸化是否导致FoxO3a细胞溶质/核比率的改变，通过if分析了PGC-1α过度表达对FoxO3a定位的影响(图6D). 这一结果进一步表明，PGC-1α/FoxO3a复合物的形成对其修饰酶，尤其是SirT1的活性起作用。

PGC-1α过表达不能弥补SirT1在抗氧化基因调节中的不足

为了评估抗氧化基因上的SirT1活性在多大程度上依赖于其对PGC-1α/FoxO3a复合物的活性，我们测试了PGC-1β的过度表达是否可以补偿Sir T1中的SirT1缺失^−/−MEF公司。我们首先测试了SirT1中PGC-1α的乙酰化水平^+/+和SirT1^−/−MEF感染了Ad-PGC-1α，并观察到正如预期的那样，SirT1中PGC-1α乙酰化程度较高^−/−MEF公司(图7A). 然而，当我们比较SirT1中PGC-1α过度表达的影响时^+/+和SirT1^−/−MEFs，PGC-1α对抗氧化基因的折叠诱导在SirT1中没有显著差异^+/+比SirT1中的^−/−MEF，尽管SirT1的基础水平和诱导水平都较低^−/−所有测试基因的MEF(图7B和补充图S2). 这些结果表明，SirT1对抗氧化基因活性的部分丧失不能通过人工增加FoxO3a/PGC-1α复合物的形成来补偿，可能涉及SirT1-招募时调节启动子的H4K16去乙酰化。

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图7。

在没有SirT1的情况下，PGC-1α活性降低。SIRT1公司^+/+和SIRT1^−/−MEF用Ad-PGC1α或对照腺病毒（Ad-Shuttle）感染o/n，感染后12 h去除血清o/n并收获细胞。（A）用特异性抗PGC1α抗体（PGC-1α）或IgG作为对照（IgG）免疫沉淀细胞提取物，并用western blot分析PGC-1 a乙酰化。（B）氧化应激保护蛋白的qRT-PCR和Western Blot分析。对照样品的值为1。数据来自≥3个独立实验。数据为平均值+SD（*）第页≤0.05与对照组。（C）建议模型的示意图。在应激条件下，如果SirT1没有活性，PGC-1α和FoxO3a都被乙酰化，并以降解为目标。在SirT1存在下，PGC-1α和FoxO3a的脱乙酰化促进形成活性转录复合物，诱导抗氧化基因并促进应激条件下的存活。

讨论

确定参与氧化应激防御机制调节的关键转录因子在血管内皮方面非常重要，在血管内皮中，高ROS水平在内皮功能障碍中起决定性作用，因此，在动脉粥样硬化的出现和发展以及血管生成过程的控制中。在这项研究中，我们表明SirT1正向调节血管内皮细胞中一组氧化应激保护基因的表达，并提供证据表明，至少对其中一些基因来说，这种影响可能是通过调节PGC-1α/FoxO3a转录复合物介导的(图7C).

SirT1以前参与调节两种ROS解毒酶MnSOD和过氧化氢酶(1,15,46). 在这里，我们表明SirT1是原代内皮细胞和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中一组抗氧化基因的调节器，表明它是一种一般的非细胞型特异性活动。此外，它表明SirT1阻止了线粒体活动产生的活性氧的积累，并强调了控制新陈代谢和活性氧稳态的系统之间的紧密耦合。

以前有报道称，SirT1是UCP-2表达的负调控因子(5)在胰腺细胞中。这种差异可能与UCP-2在胰腺中发挥的特定作用以及在BAEC中SirT1过度表达时观察到的UCP-2下调有关。

在肌肉细胞中，SirT1被招募到PGC-1α启动子并积极调节其表达(2). 在这里，我们表明SirT1不仅可以诱导内皮细胞中PGC-1α的表达，还可以诱导FoxO3a的表达。值得注意的是，虽然FoxO转录后调控已经被广泛研究，但对其转录调控知之甚少。我们的结果表明，一组抗氧化基因上的SirT1活性至少部分依赖于这两个抗氧化基因表达的关键调节因子的诱导。

我们已经研究了介导SirT1活性的机制，并且我们发现SirT1-与抗氧化基因的调控区域相关。SirT1结合与H4K16Ac减少相关，这是SirT1-活性的标志。一般认为乙酰化减少与基因沉默有关(29). 然而，主要在酵母中进行的大量研究表明，组蛋白脱乙酰化，特别是H4K16脱乙酰化，可以在基因表达调控中发挥积极作用(41). 迄今为止所描述的作用机制涉及活性基因编码区内组蛋白的去乙酰化，通过抑制编码区内的异常启动来确保正确的转录启动(19)和启动子特异性效应，仍缺乏特征(42). 我们的结果表明，H4K16的SirT1脱乙酰化伴随着启动子近端区域RNAP II水平的普遍降低，但这不会导致基因表达降低。重要的是，我们发现SirT1的招募与延长RNAP II水平的增加相关，这表明SirT1-活性可能有助于抑制异常启动和/或延长因子的招募增加。

尽管组蛋白脱乙酰酶转录激活的机制尚不清楚，但有证据表明脱乙酰酶的赖氨酸特异性可能是一个关键的决定因素。尤其是，H4K16似乎是脱乙酰酶发挥激活作用的重要靶点(53). 似乎在其他位点乙酰化的背景下未乙酰化的H4K16对转录很重要，但在其他未乙酰化残基的背景下的未乙酰化H4K15对异染色质的形成很重要。到目前为止，哺乳动物中唯一的H4K16Ac与基因沉默相关的特征例子是rDNA调节(54). 最近的一项研究揭示了乙酰化H4K16Ac在基因沉默中发挥双重作用的机制：它招募Sir2-4并排斥Sir3(32). 因此，乙酰化将有助于向靶基因招募SirT1，而这种招募可能导致转录增强或减少，这取决于随后是否招募了额外的沉默/激活因子。然而，缺少哺乳动物这种调节的实验证据。

我们的结果表明，SirT1可能至少部分通过直接结合目标基因的启动子发挥作用，可能是通过与转录因子的相互作用招募的。虽然SirT1主要起到辅升压作用，但有证据表明SirT1-也可以起到辅激活剂的作用。例如，SirT1将Tat回收为未乙酰化形式，并在Tat转录激活期间充当转录辅激活子(33).

我们以前的研究表明，FoxO3a/PGC-1α复合物调节几个抗氧化基因(30). 我们现在发现，PGC-1α和FoxO3a的敲除显著降低了所研究的抗氧化基因的SirT1诱导；表明PGC-1α和FoxO3a都是SirT1的必要伙伴。所涉及的机制可能至少部分与观察到的FoxO3a和PGC-1α的诱导有关，但也可能取决于这些因子的SirT1脱乙酰化。我们发现，在内皮细胞中，SirT1过度表达可降低氧化应激反应中的FoxO3a和PGC-1α乙酰化。之前已经注意到，FoxO4被p300乙酰化，并被SirT1去乙酰化以应对压力(21)，还描述了SirT1对氧化应激的反应中FoxO3a脱乙酰化(8). 研究还表明，PGC-1α被乙酰化，并在氧化应激条件下降解，SirT1被提议用于防止这种影响(三).

我们的结果还表明，虽然PGC-1α和FoxO3a在应激反应中的乙酰化促进其泛素化和降解，但SirT1的脱乙酰化促进蛋白质稳定。烟酰胺实验表明，烟酰胺诱导PGC-1α和FoxO3a IP中的乙酰化高分子量物质增加，这可能与这些蛋白质的多泛素化形式相对应(31,34). 此外，氧化应激增加了乙酰化并降低了PGC-1α和FoxO3a的水平，而SirT1过度表达则逆转了这一作用。这一结果表明，SirT1不仅可以在转录水平调节PGC-1α和FoxO3a细胞水平，如前所示，还可以通过调节其蛋白质稳定性/降解。

我们对FoxO3a的研究结果似乎与之前对FoxO1的观察结果形成了对比，因为最初有人提出FoxO3乙酰化通过减少蛋白酶体的降解来增加其蛋白质水平(20). 然而，最近的观察表明，FoxO1乙酰化增加导致磷酸化增加(37)是泛素化和蛋白酶体降解的特征良好的触发因素(9). 重要的是，我们还表明SirT1在基础和氧化应激条件下保护FoxO3a免受Akt磷酸化。

为了进一步研究FoxO3a和PGC-1α的SirT1脱乙酰化如何在SirT1-诱导抗氧化基因中发挥作用，我们测试了Sir T1对FoxO3/PGC-1α复合物形成的影响，发现Sir T1-增加了PGC-1 al/FoxO3a复合物的形成。我们设想SirT1可以通过两种替代机制发挥作用。SirT1能够独立地脱乙酰FoxO3a和PGC-1α，脱乙酰蛋白之间的亲和力增强。或者，SirT1可能是靶启动子招募的三元复合物的一部分。由于我们的SirT1-ChIP数据支持第二个模型，因此我们对这一假设提出了质疑，以测试FoxO3a和PGC-1α是否可以调节彼此的乙酰化水平，并发现PGC-1β减少FoxO3a乙酰化，而FoxO3a减少PGC-1 a乙酰化，支持SirT1与PGC-1α和FoxO3a是三元络合物的一部分的概念。

出现的模型是，氧化应激会诱导PGC-1α和FoxO3a的乙酰化，而这种乙酰化会导致这两个因子的泛素化和降解加速，除非SirT1是活性的。SirT1将与FoxO3a和PGC-1α相互作用，使两者脱乙酰，并与它们形成三元复合物，该复合物将被募集到抗氧化基因中，从而提高细胞在应激条件下的存活率。因此，ROS响应的关键决定因素是SirT1的激活程度(16).

Nrf2是抗氧化基因表达的另一个重要转录调控因子。重要的是，最近有研究表明，Nrf2在代谢控制中也发挥作用(52). 这些观察结果使其成为SirT1、PGC-1α和FoxO因子控制的调节回路中的假定相关伙伴。然而，这种可能性仍有待调查。

综上所述，本研究的结果揭示了SirT1作为内皮氧化应激保护系统和ROS稳态的关键调节器的新作用。我们的结果也强调了SirT1调节在血管内稳态中的潜在治疗作用。因此，目前可获得的高度特异性化学SirT1活化剂具有很大价值，现在似乎使其成为现实。

材料和方法

细胞培养

如前所述，分离和培养BAEC(23,26). BAEC用于第3-6代。妊娠第13.5天，来自C57BL6 SirT1的胚胎^+/−x C57BL6 SirT1^+/−杂交以分离MEF，MEF按说明制备和培养(40). MEF用于第1-4段。SirT1^+/−所用的小鼠是CNIC动物设施内建立的群体的一部分。动物实验方案由网络中心动物护理和使用机构委员会批准。所有使用的方案均符合赫尔辛基宣言和美国国家卫生研究院出版的《实验动物护理与使用指南》（NIH出版物编号85-23）。

腺病毒载体与感染

先前已经描述过重组腺病毒Ad-PGC-1α、Ad-SirT1、Ad-FoxO3a和Ad-shFoxO3a(30,38,43,49). 使用pSilencer构建沉默Ad-shPGC1α和Ad-shSirt1^™Ambion的腺病毒1.0巨细胞病毒启动子系统（加利福尼亚州卡尔斯巴德）。使用的寡核苷酸列于Supp.Inf中。用腺病毒载体感染细胞，感染倍数为10–25，持续12–16小时。感染后24或48小时，用PBS冲洗细胞3倍，然后收获细胞。

蛋白质印迹

如前所述获得全细胞裂解物(28). 20–25μg全细胞蛋白提取物在8%–15%的SDS-PAGE凝胶上溶解，转移到PVDF Hybond-P膜上（Amersham Biosciences，Fairfield，CT），并与PGC-1α（Cayman Chemical）、FoxO3a（cell Signaling，Danvers，MA and Santa Cruz，CA）、P-FoxO3a（Thr³²)（明尼苏达州门多塔高地Millipore）、SirT1（圣克鲁斯）、Prx5（圣克鲁兹）、Trx2、TR2和Prx3（韩国首尔大运洞Seodaemun-gu LabFrontier）、Catalase（加利福尼亚州特梅库拉Chemicon International）、MnSOD（加拿大不列颠哥伦比亚维多利亚州Stressgen）、UCP-2（加利福尼亚州圣地亚哥Santa Cruz and Biolegend）、乙酰化赖氨酸（马萨诸塞州丹弗斯Cell Signaling）β-肌动蛋白（西格玛，都柏林，俄亥俄州）和HA（杂交瘤12CA5）。β-actin作为负荷对照。

共免疫沉淀

通过免疫共沉淀实验分析蛋白质相互作用。制备全细胞提取物，并使用针对PGC-1α（Santa Cruz H-300，Santa Cru z，CA）、HA-taged FoxO3a（小鼠单克隆12CA5）和SirT1（Santa Cruz）或对照正常兔或小鼠IgG的特异性抗体进行免疫沉淀(28). 通过Western Blot用特异性抗体评估免疫沉淀物中PGC-1α（Cayman Chemical，Ann Arbor，MI）、FoxO3a（Santa Cruz）和SirT1（Santa Cruz）的存在以及Lys乙酰化水平（细胞信号）。

染色质免疫沉淀

ChIP实验基本上如前所述进行(49)进行了一些修改（补充信息）。

相对信使核糖核酸水平的测定

使用TRIzol分离RNA^®试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）。用M-MLV（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）扩增随机引物，逆转录1μg总RNA。在7900序列检测系统（加利福尼亚州卡尔斯巴德应用生物系统公司）中，通过实时PCR（qRT-PCR）测定相对表达水平。底漆如前所述(7). PCR产物的数量标准化为18S rRNA水平。

ROS分析

细胞与2μM（M）5-氯甲基-2′7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（CM-H₂DCFDA；分子探针，加利福尼亚州卡尔斯巴德）在37°C下放置30分钟。然后将细胞胰蛋白酶化并重新悬浮在PBS中。通过流式细胞仪测量荧光强度。

通过用MitoSOX红（Molecular Probes，Carlsbad，CA，USA）标记细胞来测量线粒体超氧化物，基本上如所述（6）。简言之，BAEC生长在盖玻片中，与3μM（M）MitoSOX Red静置10分钟，用多聚甲醛固定，并用荧光显微镜进行分析（Leica TCS SP5，Buffalo Grove，IL）。

免疫荧光

BAEC在盖玻片上生长，用3.7%甲醛固定，用0.1%Triton透化，然后与第一抗体（α-FoxO3a）和第二抗体（α-IgG兔ALEXA-488缀合物）连续孵育。如前所述，用TO-PRO-3对细胞进行复染，用共焦显微镜（Zeiss LSM 700，Obercochen，Germany）进行安装和检查(6).

统计分析

Kolmogorov-Smirnov检验用于检验样本值分布的正态性。示例值如下所示平均值±标准偏差（SD）。通过方差分析和Bonferroni校正对两个或多个独立组的连续变量进行多重比较。使用SPSS for Windows 17.0版（伊利诺伊州芝加哥市SPSS公司）进行统计分析。Levene方差和方差相等性检验t吨-采用平均数相等性检验。全部第页-数值是指显著性的双尾检验；第页，0.05被认为是显著的。

补充材料

补充数据：

单击此处查看。^{（701K，pdf）}

使用的缩写

交流电	乙酰化的
广告	重组腺病毒
阿波（ApoE）^−/−	载脂蛋白E
BAEC公司	牛主动脉内皮细胞
炸薯条	染色质免疫沉淀
CM-H公司₂DCFDA公司	氯甲基-2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯
联合IP	免疫共沉淀
DMNQ公司	2,3-二甲氧基-1-萘醌
联邦调查局	胎牛血清
像素1	谷胱甘肽过氧化物酶1
像素4	谷胱甘肽过氧化物酶4
H4型	组蛋白4
如果	免疫荧光
K16号公路	赖氨酸16
MEF公司	小鼠胚胎成纤维细胞
锰超氧化物歧化酶	锰超氧化物歧化酶
核因子-κB	核因子-κB
不	一氧化氮
氮氧化物	NADPH氧化酶类
PGC-1α	过氧化物酶体增殖物激活受体γ-辅活化因子1α
Prx3系列	过氧化物酶原3
Prx5公司	过氧化物酶原5
RNAP二	RNA聚合酶II
ROS公司	活性氧物种
第页	小发夹
2号机房	硫氧还蛋白还原酶2
Trx2型	硫氧还蛋白2
UCP-2号机组	解偶联蛋白2

致谢

这项工作得到了西班牙“经济竞争力部”（SAF2009-07599授予M.M，SAF 2009-07520授予S.L.，CSD 2007-00020授予M.M.和S.L.）和“马德里自治委员会”（S2010/BMD-2361授予M.M）的支持。我们感谢M.Serrano博士（CNIO）对SirT1的支持^+/-老鼠和L.Durán寻求技术支持。

作者披露声明

不存在相互竞争的财务利益。

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文章来自抗氧化剂和氧化还原信号由以下人员提供玛丽·安·利伯特公司。