活性谷氨酰胺酶C自组装成一种可被变构抑制剂破坏的速构上低聚物^*

透射电子显微镜

用于显示负染网格、蛋白质样品，浓度为0.5至1μ米在发光多孔碳涂层格栅上沉积60 s，然后用2%乙酸铀酰进行两步印迹和染色。使用在200 kV电压下工作的Jeol JEM-2100在15000–80000倍放大率下采集−1-和−3-μm离焦之间的图像，并记录在F-416 CMOS相机上（Tietz视频和图像处理系统）。

结晶和X射线晶体学

使用传统的坐滴蒸汽扩散技术在291 K下进行结晶实验。将三份蛋白质（3.3 mg/ml）混合到一份含有17%PEG 3350、0.2米氯化钠和0.1米Bis-Tris，pH 6.5。5天后观察到成簇的平板，并将其用作种子，在含有11%PEG 3350，0.2的母液溶液中进行标准条纹播种米氯化钠和0.1米双三重，pH 6.5。在低温（100K）下收集数据之前，将采集的晶体用10%的乙二醇添加到母液中进行低温保护。在巴西Luz Síncrotron国家实验室的D03B-MX1光束线上获得了X射线衍射数据。使用Mosflm处理数据(14)和Scala(15). 第一组相是通过Phaser中实现的分子替换获得的(16)，使用无配体形式GAC的数据集，可在蛋白质数据库代码下获得3秒3(5). 使用Phenix进行位置和B因子优化循环(17). 使用Coot进行额外部分的手动构建和实际空间细化，包括傅里叶电子密度图检查(18). Molprobit程序评估了最终模型的整体立体化学质量及其与实验数据的一致性(19)和适当的Coot例程。

GAC配合物的LC-MS/MS联用分析

GAC复合物减少（5 m米二硫苏糖醇，56°C下25分钟），烷基化（14 m米碘乙酰胺，室温下黑暗中30分钟），用胰蛋白酶（Promega）消化。样品在真空浓缩器中冷冻干燥，并在0.1%甲酸中重新配制。然后，通过Proxeon纳米电喷雾离子源，在LTQ Velos Orbitrap质谱仪（Thermo Fisher Scientific）上通过EASY-nlC系统（Thermo-Fisher科学）结合LC-MS/MS分析4.5μl（1μg）所得肽。使用柱前EASY柱（2 cm×100-μm内径，5-μm粒径）和分析柱PicoFrit柱（20 cm-75-μm外径，5-μm粒径；新目标），在0.1%甲酸中用2-90%乙腈梯度分离肽，流速为300 nl/min，持续65 min。纳米电喷雾电压设置为2.2 kV，源温度为275°C。LTQ Velos Orbitrap中的仪器方法建立在高能碰撞解离碎片的数据相关采集模式下。全扫描MS光谱(米/z（z）300–1600），累积到目标值1×e（电子）⁶Orbitrap系统中的分辨率设置为第页=60000，将电荷态≥2的五个最强肽离子依次分离到50000的目标值，并在HCD中碎片化，归一化碰撞能量为40%，Orbitrap系统中的分辨率设置为第页=7500（对于MS/MS）。触发MS/MS事件的信号阈值设置为80000计数，使用0.1 MS的激活时间。启用了动态排除，排除大小列表为400，排除持续时间为60秒，重复计数为2。对于交联分析，使用Proteome Discoverer 1.3版（Thermo Fisher Scientific）将Xcalibur v.2.1（赛默飞世尔科技公司）生成的原始数据文件转换为峰列表格式（mgf）。在MassMatrix软件中分析mgf文件，以根据包含GAC氨基酸序列的数据库自动搜索化学交联。交联分析的参数为固定修饰的氨基甲酰化（+57.021460 Da）、可变修饰的蛋氨酸氧化（+15.99491 Da），不可被酶溶解的二巯基琥珀酸-DSS（138.06808 Da）化学交联，四种胰蛋白酶缺失裂解，前体的公差为10 ppm，碎片离子的公差为0.02 Da(20). 人工验证潜在的交联肽。该实验分别对四聚体形式和超低聚体形式进行了四次和七次。只有在四聚体样品中的残基Lys之间观察到独特的赖氨酸连接（在以下肽中强调）¹⁸¹和Lys²⁰⁷(α-K（K）CVQSNIVLTQAFR和β-LK（K）ECMDMLR）、Lys²⁰²和Lys⁵⁷⁸（α-LTLQTTSDGVMLDK（K）DLFK和β-DTVWK（K）K） 和Lys⁴⁰³和Lys⁵¹²（α-SGVAGGILLVVPNVMGMMCWSPPLDK（K）MGNSVK和β-EK（K）K） ●●●●。

计算生物学

为了获得谷氨酰胺酶纤维的模型，我们应用了之前开发的受实验DSS交联数据约束的刚体对接算法(20). 最初，我们使用环路重建程序重建单体的N端和C端区域，并将四聚体的副本，即配体结构域，放置在受体结构域的N端。仅使用我们重建模型（Lys）中观察到的唯一单体间连接¹⁸¹–赖氨酸²⁰⁷)，我们选择了能量最低且在11以内的诱饵Å 赖氨酸对距离。

细胞分析

MDA-MB 231细胞购自ATCC（最初传代29代），并在添加10%胎牛血清（Cultilab）的RPMI 1640培养基（巴西坎皮纳斯Cultilab1640培养液）中培养。pcDNA3.1/V5-His-hGAC（GAC-V5）克隆由Richard Cerione博士（纽约州伊萨卡市康奈尔大学）善意提供，突变K320A（相当于小鼠基因中的K325A）按照制造商的说明使用QuikChange II定点突变试剂盒（GAC.K325A-V5）进行。经Western blotting证实，选择脂质转染细胞G418进行稳定表达。通过将空载体转染细胞获得模拟对照。为了完成内源性GAC敲除，用含有pLKO-shGAC质粒的慢病毒颗粒转导相同的细胞克隆（正向，5′-CCGCCTTGTTCTGTCAGAGTTCGAACTCTGACAGAACAGAGGTTTG-3′，反向，5′-AATTCAAAAACCTCTTGTCAGAGGTCGAGGTCGAGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT，并选择一组细胞进行嘌呤霉素耐药性检测。细胞用20 m溶解米三氯化氢，pH 7.5，150 m米氯化钠，1%Triton X-100，1 m米乙二胺四乙酸，1米米DTT，1米米钒酸钠₄，1米米β-磷酸甘油，11μg·ml⁻¹抑肽酶，11μg·ml⁻¹胃蛋白酶抑制素和1米米PMSF公司。用SDS-PAGE对裂解产物进行拆分，并将蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上。将膜与稀释在20 m内的一级抗体孵育过夜米特里斯，135米米NaCl和0.1%吐温20。在暴露于Pierce SuperSignal West Pico底物后，用辣根过氧化物酶偶联二级抗体检测一级抗体。我们使用了Genescript定制的抗V5 1:10000（Invitrogen），如参考文献。51μg·ml⁻¹、抗Vinculin 1:1000（细胞信号）和抗VDAC 1:1000（电池信号）。至于免疫荧光和谷氨酰胺消耗研究，MDA-MB 231细胞接种在6孔板（Becton Dickson）中，密度为2.5×10⁻⁵细胞·cm⁻²，在37°C和5%CO条件下培养48小时₂然后用3.7%甲醛在PBS中固定并渗透，0.2%Triton X-100。用PBS中的3%BSA、0.8%Triton X-100封闭细胞，并在室温下孵育1 h，抗V5 1:20000稀释在PBS/0.8%Trito X-100中的3%BS A中。使用山羊次级抗鼠剂Alexa 633（Invitrogen），在封闭溶液（1:200）中稀释，以显示体外表达的V5标记的GAC。细胞核和肌动蛋白用2.5μg·ml染色⁻¹DAPI（Sigma）和卵磷脂-Alexa 488（1:40）。使用平板阅读器荧光显微镜Operetta（PerkinElmer Life Sciences）收集数据，并使用软件Harmony 3.0量化细胞数量和面积。使用Bio-Profile Basic 4（Nova Biomedical）评估培养基中的谷氨酰胺消耗量。BPTES处理的细胞可以附着24小时，然后用添加10μ米在全细胞裂解物谷氨酰胺酶活性测定中，细胞在25m内用重悬液进行裂解米Hepes，pH 8.0，150 m米氯化钠，1米米EDTA、0.01%Triton X-100和1×蛋白酶抑制溶液（Qiagen），然后通过胰岛素针进行20次中风。根据已发布的简化分析，对整个细胞提取物进行谷氨酰胺酶活性分析(5)，使用5μg裂解液/孔和我-谷氨酰胺浓度为7.5m米在胰蛋白酶化和台盼蓝培养后，用Invitrogen计数仪测量分离的活细胞直径。

细胞内蛋白质交联

约3×10⁶将细胞接种在10厘米的培养板中，让其贴壁过夜。第二天，取出培养基，用PBS洗涤细胞两次，并用2mL孵育24小时米 我-光亮氨酸和4 m米 我-补充有10%PBS透析FBS的无亮氨酸和无蛋氨酸DMEM中的光甲硫氨酸（Pierce）。培养后，去除培养基，用PBS清洗细胞两次，然后在Epi-Chemi II暗室设备（UVP实验室产品）中365 nm照射15分钟。收集细胞进行裂解，并用3–15%的梯度SDS-PAGE（用50:1丙烯酰胺：双丙烯酰胺混合物制备的3、9和15%的SDS-PAGE溶液，按1.5:2:1的体积比例逐个倒入）分解交联蛋白。如前一节所述，使用抗V5 1:10000（Invitrogen）进行免疫印迹。

乳腺肿瘤细胞内谷氨酰胺浓度的测定

从肿瘤样本的代谢组学实验中，Yueva等。(21)据报道，每克蛋白质中谷氨酰胺的含量为40至数百纳米。我们发现了独立的GAC。K325A-V5、GAC-V5和模拟转化MD-MBA 231细胞的平均直径分别为13.3、10.9和10.6μm。假设这些电池呈球形，则可以计算出以下电池体积：1.2 nl（GAC.K325A-V5电池）和0.6 nl（GA C-V5和模拟电池）。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒（ThermoScientific），我们对2×10⁶细胞，从三个细胞克隆中取样。基于Yueva检测到的最低谷氨酰胺含量等。(21)对于40 nmol Gln/g的蛋白质，我们估计这些细胞含有3.7至7.4 m米谷氨酰胺。

谷氨酰胺酶同工酶的上部结构

GAC是已知的三种哺乳动物谷氨酰胺酶同工酶中对无机磷反应最活跃的(5). 为了进一步研究活性增加与较大寡聚物物种之间的相关性，我们通过TEM观察了KGA和LGA（也称为GLS2）组装成超四聚体结构的能力。上部结构组装在20m处进行诱导米磷酸盐，通过与DSS交联稳定，然后进行凝胶过滤净化。寡聚体较长的趋势与三种同工酶的活性水平密切相关。更具体地说，GAC-20米处最活跃的谷氨酰胺酶米P（P）_我-形成最长的杆状低聚物(图2,左上面板)之后是KGA(图2,右上面板)然后是LGA(图2,左下面板)之前已经证明对P不敏感_我(5,22)并且不形成上部结构。颗粒最短和最长尺寸的平均值为：GAC为16±2和181±108 nm，KGA为14±3和74±26 nm，LGA为9±2和12±3 nm(图2,右下面板).

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图2。

谷氨酰胺酶同工酶与自组装趋势。三种谷氨酰胺酶同工酶在20m培养后交联的TEM分析米磷酸盐。上层结构的平均长度与先前公布的谷氨酰胺酶活性水平呈正相关(5). GAC是最活跃的同工酶，形成最长的聚合物(左上面板)之后是KGA(右上面板)活性较低，结构较短，最后是LGA，它对磷酸盐不敏感，因此不会形成纤维(左下面板). 除非另有规定比例尺表示100 nm。

BPTES破坏GAC上部结构

与目前GLS1激活的二聚体到四聚体模型相反，抑制剂BPTES已被证明可将GLS1锁定为非活性的四聚体形式(6). 为了解释BPTES发挥作用的抑制模式及其与上层结构形成的关系，我们测定了20 m浓度下GAC的详细BPTES剂量-反应曲线米圆周率。之所以选择这种磷酸盐浓度，是因为它更接近缺氧条件下的生理浓度(23)并大大刺激GAC催化活性(5). 我们观察到对GAC的强烈抑制作用，其中纳米级BPTES影响最大催化速率，k个_{cat-app公司}，而不更改K（K）_{米-应用程序}用于谷氨酰胺(图3A类)，这是其他人已经发表的变构非竞争性抑制剂的明确指示(6,7). 奇怪的是，超过200 n米BPTES，观察到二次效应，抑制剂也开始影响K（K）_{米-应用程序}（与没有BPTES相比增加了3倍），将BPTES重新定义为混合模式抑制剂(图3A类). 通过拟合一个误差加权logistic sigmoid函数来解释抑制剂增加导致酶周转率下降的原因，我们得到了一个IC₅₀80.4±7.2牛顿米对于BPTES，这与DeLaBarre提供的值一致等。(7). 催化速率的上限和下限分别为16.4和7.9 s⁻¹，坡度为1.7±0.2(R（右）²=0.99），表示合作绑定(图3A类). 关于对K（K）_{米-应用程序}，上限和下限分别为4.6和13.8 m米，带IC₅₀629±61牛顿米对于BPTES（山坡坡度2.0±0.3，R（右）²= 0.99).

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图3。

BTPES抑制GAC上部结构的形成。 A类，BPTES对GAC抑制的剂量-反应曲线，在20m浓度下测定米磷酸盐，对酶的表观周转率和米氏常数有两种互补效应。B类，BPTES捕捉选通回路(黑色缎带)相对于GAC的催化囊呈刚性开放构象（由绿色表面).C类，傅里叶2的赤平极视图F类_{光突发事件}−F类_计算map（at 1σ）确认了精细晶体模型中的建议构象。D类，TEM分析BPTES对GAC上部结构形成的影响。无论之前是否将BPTES添加到蛋白质溶液中，丝的形成都受到阻碍(中间面板)或之后(底板)20米孵化米磷酸盐。E类和F类相反，GAC。K325A对BPTES处理不敏感(E类)，并且该抑制剂也不能破坏非交联的GAC。K325A长丝(F类).

结合上述研究，我们还测定了小鼠GAC与BPTES（2.77）配合物的晶体结构Å 分辨率，R（右）_因素25.3%，以及R（右）_自由的29.5%；表1). 虽然与先前报道的BPTES-结合谷氨酰胺酶结构类似，但两个抑制剂分子紧密地容纳在四聚体界面上，平均主根均方偏差为0.44和0.56Å 当叠加到蛋白质数据库结构时3个UO9和3伏分别为(7,8)，我们的晶体形态呈现出一个关键的独特特征。由于小分子与四聚体界面的结合，在所有的GAC晶体模型中，门控环主链的有序性较差，在所有四个单体中都处于稳定的开放构象。这主要是因为BPTES和Lys之间的联系³²⁵因此，环路假设为一个单圈螺旋的构象(图3,B类和C类). GAC二聚体和BPTES分子之间形成15个氢键（数据未显示）。每个单体的11个残基与BPTES共有界面，总面积为620ŲBPTES的总溶剂可及表面（788Ų)80%在与酶相互作用时被掩埋。

接下来，我们评估了BPTES对GAC超低聚物形成的影响。在磷酸盐和抑制剂存在下制备并随后交联的野生型GAC样品的TEM和尺寸排除色谱显示，无论是在20 m蛋白质孵育之前还是之后添加BPTES米磷酸盐；当浓度为30μ米BPTES的(图3D类). 在没有磷酸盐和BPTES的情况下，网格上被破坏的颗粒的分布类似于野生型蛋白质，如图1A类(顶部面板).

最后，我们观察到突变体GAC。根据剂量-反应曲线，K325A除了过度活跃外，对BPTES也不敏感(图3E类). 因此，BPTES不能破坏非交联GAC。K325A低聚物，在有或无磷酸盐的情况下组装(图3F类).

上部结构特征

由于其长度分布不均匀，GAC上部结构本质上不适合结晶。然而，通过结合TEM、化学交联、MS分析和计算生物学，我们为上层结构提供了一个低分辨率模型。延伸的粒子倾向于以非常有限的方向吸附在显微镜网格上。然而，最好的显微照片显示了平行于聚合物的平移和旋转对称元素的组合，从而沿其纵轴形成螺旋对称。对低通滤波图像的详细分析提供了其几何属性。在特定染色条件下，观察到的螺旋聚合物类似于右手双链螺旋，每转上升约53±2 nm，链倾斜度为25°，单链平均宽度为6.6±0.7 nm(图4A类).

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图4。

GAC超低聚物组装模型。 A类从TEM显微照片中去除高频（与噪音密切相关）突出了上部结构的右手双绞线性质，从而可以确定其几何特征。B类，手动验证交联MS/MS光谱b和年交联肽的α链和β链的离子系列（在残基Lys之间¹⁸¹和Lys²⁰⁷，赖氨酸²⁰²和Lys⁵⁷⁸和Lys⁴⁰³和Lys⁵¹²离子表示为箭头具有相应的米/z（z）值。C类，如MS所示，DSS链接赖氨酸对在四聚体中的相对位置。活性位点的边界由固体表面界定。†，赖氨酸⁵⁷⁸未在晶体结构中建模。提出的单链生长方向是通过N末端结构域对之间的端到端相互作用，穿过四聚体的最长轴。交替橙色和黄色有利于沿着单链鉴定四聚体。D类，每个交联对中的一个赖氨酸残基分别被谷氨酸取代，并测定酶活性(左侧面板)和上部结构形成(右侧面板). N末端区域突变体（GAC.K202E和GAC.K207E）增强了这两种效应。另一方面，GAC。谷氨酰胺酶结构域内的K512E产生一种无功能蛋白，类似于乙酰化模拟GAC。K316Q号。这个绿色区域界定GAC二聚体之间的预期斯托克斯半径(D类)和四聚体(T型)，根据晶体结构尺寸计算。这个星号表示以前发布的野生型GAC结果(5).E类，手动建模双绞线(面板i)，使用来自C类并遵循几何限制A类.英寸第二组，计算出的傅里叶F类_计算map（双链模型的振幅和相位）-限制为35Å 最大分辨率是二维投影，最终结果如所示第三小组所有特征都与第四组，关于交替出现的高密度狭窄区域（表示为实心三角形)和低密度宽的盘状区域（表示为开放三角形).

同时，用胰蛋白酶消化尺寸排除纯化的交联聚合物以及以四聚体形式交联的GAC（用作对照），并对所得肽进行液相色谱-串联质谱联用。交联肽根据四聚体的晶体结构建模，DSS的间隔臂长度为～11.4Å 作为连接赖氨酸侧链胺基之间最大距离的限制。这是区分不同可能的分子间和分子内交联所必需的。仅在四聚体样品中观察到独特的连接（光谱如图4B类)，残留Lys之间¹⁸¹和Lys²⁰⁷（均位于同一单体的外N端部分），Lys²⁰²和赖氨酸⁵⁷⁸（后者位于C终点）和Lys⁴⁰³和Lys⁵¹²（均位于谷氨酰胺酶结构域内，位于两个不同单体的活性部位两侧），如图4C类观察到这些DSS-介导的连接在聚合时无法形成，这表明它们各自的表面在上层结构形成时与溶剂发生了闭塞。然后，每个交联对中的一个赖氨酸残基被带相反电荷的谷氨酸残基取代，并测试单独突变的蛋白质（称为GAC.K202E、GAC.K207E和GAC.K512E）的超低聚物依赖性谷氨酰胺酶活性。两个N末端突变体，GAC。K202E和GAC。K207E导致酶活性增强(图4D类,左侧面板)与野生型GAC相比，其相干形成更大的颗粒(图4D类,右侧面板). 相反，谷氨酰胺酶域突变体GAC。K512E完全失去了磷酸依赖的酶活性，因此也失去了自组装成超低聚物的能力。三点突变加强了蛋白质酶活性对超低聚物形成的需要，最重要的是，进一步显示了与催化囊无关或远离催化囊的区域对超低聚物形成和酶激活的重要性。

在重组GLS1的原始生化特性中，Kenny等。(12)通过生成截短的、无催化活性的重组结构，证明了GLS1 N末端部分对酶活性的重要性。然而，GAC随后的晶体结构清楚地表明，属于N-末端部分的残基没有直接参与催化，甚至没有它们对活性位点的正确折叠或稳定的要求。基于在GAC晶体结构中观察到的尺寸，66Å 对于单链，表明聚合发生在四聚体的最长轴上，因此表明通过N末端区域进行端到端的相互作用。因此，生长始终倾向于一个方向，并且可能无限期地发生，因为N末端的粘性末端总是在两端可用（模拟链生长的几个四聚体的计算对接如所示图4C类,左侧面板). 因此，由于活性依赖于灯丝组装，而N末端部分是关键，我们为Kenny的发现提供了一个合理的解释等。(12).

接下来，为了生成双股丝状结构的模型，使用螺旋参数作为约束条件，手动将两股单股的坐标文件缠绕在一起(图4E类). 应用于参考显微照片的高斯低通滤波器去除高于0.028的空间频率Å⁻¹因此，估计有35个Å 真实空间中的分辨率。根据其纵向和角向的外形尺寸，估计的最小重复单元（一个完整的螺旋圈）由缠绕股中的每一股中的七个四聚体组成。四聚体的固有2重二面体对称性(5)由于每条链都是非极性的，因此无需确定双链螺旋是平行的还是反平行的。为了根据实验数据验证模型F类_计算傅里叶电子密度图由FFT程序生成(24)（至35Å 最大分辨率），使用从三维双绞线坐标文件计算的结构因子，然后使用电子显微镜软件Imagic在理论上投影到二维(25). 最终结果显示在右侧面板属于图4E类并呈现出与典型显微照片中观察到的特征完全可比的特征图1E类(底部面板)特别是关于高密度的窄的、紧凑的区域与低密度的宽的盘状区域之间的交替图案的存在。

最后，Lys³¹¹在人类GLS1中，谷氨酰胺酶被发现是体内乙酰化反应的高分辨质谱分析(13). 该赖氨酸残基属于谷氨酰胺酶结构域，位于与催化囊和门控环相对的表面上，不直接参与活性部位。为了评估这种可逆的翻译后修饰对上层结构形成和蛋白质活化的影响，我们在小鼠蛋白质的等效残基（GAC.K316Q）中产生了一个点突变，用谷氨酰胺残基取代它，以模拟乙酰化赖氨酸的非带电性质。有趣的是，新突变的蛋白质对活化剂磷酸盐的敏感性较低，同时组装成超低聚物的趋势降低，使蛋白质的大小仅与四聚体和二聚体兼容(图4D类,左边和右侧面板).