血小板衍生生长因子-D过表达促进PC3前列腺癌细胞的上皮-间充质转化

摘要

介绍

上皮-间充质细胞转化（EMT）是上皮细胞发生显著形态变化的过程，其特征是从上皮鹅卵石表型向拉长的成纤维细胞表型转变。EMT的过程包括上皮细胞-细胞连接的丢失、肌动蛋白-细胞骨架的重组和间充质分子标记物的上调，如波形蛋白、纤维连接蛋白和N-钙粘蛋白[1]. 细胞-细胞连接的解体，包括E-cadherin和闭塞小带-1（ZO-1）的下调和重新定位，以及β-连环蛋白从细胞膜到细胞核，导致EMT的诱导[2–4]. 上皮细胞具有规则的细胞-细胞连接和粘附，抑制单个细胞的细胞运动。相反，与上皮细胞相比，间充质细胞在细胞间的粘附性较弱，使间充质干细胞更具活动性和侵袭性，这些过程与获得肿瘤干细胞表型一致[三]. EMT是由细胞外信号（如胶原蛋白和生长因子，包括转化生长因子）的相互作用触发的-β（转化生长因子-β)成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因子（EGF）和血小板衍生生长因子（PDGFs）-A和-B[5–9]. 然而，EMT发生的机制尚待阐明，尤其是新发现的PDGF-D在EMT过程中起什么作用（如果有的话）；这个问题需要深入调查。

众所周知，PDGF-D通过激活其同源受体（血小板衍生生长因子受体）来调节许多细胞过程，包括侵袭和血管生成-β[PDGFR（PDGFR）-β]) [10,11]. PDGF-D被认为通过移除N末端补体子成分C1r/C1s、Uegf、Bmp1结构域而激活，从而使C末端生长因子结构域激活[12,13]. 众所周知，PDGF和EGF等生长因子可以通过激活受体酪氨酸激酶来激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt，从而在细胞信号转导中与雷帕霉素（mTOR）通路的哺乳动物靶点相关[14]. 最近的研究表明，细胞运动需要mTOR，由S6K和4E-BP1介导[15]，Akt/mTOR途径的下游靶点。

越来越多的证据表明核因素-κB（NF-κB） 多种炎症介质和生长因子激活[16,17]与血管生成、侵袭、转移和抗凋亡过程相关[18,19]，已被证明有助于前列腺癌的发展和/或进展[20]. 有趣的是，最近的研究表明，NF的激活-κB通路是诱导和维持上皮-间质转化所必需的[21,22]. 这部分是由于NF-κ通过上调转录因子ZEB1和蜗牛介导的抑制E-钙粘蛋白表达和诱导波形蛋白表达的B介导的EMT期间抑制E-钙黏蛋白表达[23,24]. 其他研究表明，NF亚单位Rel B-κB、 可诱导Bcl-2表达并促进雌激素受体阴性乳腺癌细胞的侵袭，这些细胞与EMT相关[22]. 此外，Bcl-2已被证明参与血管生成、侵袭和转移的过程[25,26]. 然而，PDGF-D、NF的详细机制-κB、 Bcl-2及其相互作用调节EMT，从而调节肿瘤细胞的侵袭、血管生成和转移过程，尤其在前列腺癌中尚未阐明。

因此，在本研究中，我们使用过表达PDGF-D的PC3细胞来研究PDGF-D-在EMT诱导中的作用及其潜在机制。我们发现PDGF-D的过度表达导致了EMT的诱导，如E-cadherin和ZO-1表达的缺失和间充质标记物（如vimentin）的增加所证明的，这也与细胞形态和生长动力学的显著变化相一致。我们还发现NF的激活-κB和mTOR信号，导致Bcl-2表达增加，这与PDGF-D过度表达PC3细胞的侵袭行为增加有关。此外，与对照细胞相比，具有EMT特征的细胞在实验性骨转移动物模型中的生长速度显著加快。这些结果表明PDGF-D的过度表达有助于获得癌干细胞特征，这与EMT的诱导一致，并进一步表明PDGF-D可能是前列腺癌的潜在预防和/或治疗靶点。

材料和方法

结果

PDGF-D诱导PC3细胞形态改变

为了揭示PDGF-D在前列腺癌发生发展中的可能作用，我们使用了一种过度表达模型，在该模型中，PC3细胞被稳定转染PDGF-D-表达质粒或空载体pcDNA3质粒。实时反转录（RT）-PCR显示，与PC3 Neo细胞相比，PC3 PDGF-D细胞中PDGF-DmRNA显著增加(图1A)，而β-此外，我们在PC3 PDGF-D细胞中观察到PDGF-D全长形式和活性形式显著增加(图1B)而甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）蛋白的表达没有变化。免疫荧光染色结果表明，PDGF-D主要位于PC3 PDGF-D细胞的细胞质中(图1C). 有趣的是，我们发现PDGF-D过度表达的PC3细胞显示出细长/不规则的纤维母细胞形态(图1D，下部面板）。相反，PC3-Neo细胞呈圆形，典型的上皮鹅卵石样外观(图1D，上部面板）。这些表型变化表明PDGF-D可以诱导PC3细胞的EMT。

在单独的窗口中打开

图1

PDGF-D的过度表达在PC3细胞中诱导上皮-间充质转化样表型。（A） 以下为：实时逆转录聚合酶链反应用于量化PC3-Neo和PC3-PDGF-D中PDGF-DmRNA的表达。β-肌动蛋白被用作内部对照，以校正RNA负载的潜在变化。（B） ：Western blot分析显示，在PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞中，CM和细胞裂解物（甘油醛-3-磷酸脱氢酶Western blot被用作蛋白质负荷控制）中PDGF-D的全长和活性形式。（C） ：PDGF-D免疫荧光染色结果表明，PDGF-D-主要定位于PDGF-D－转染细胞的细胞质中，而在PC3-Neo细胞中PDGF-D染色较少。原始放大倍数，×200。（D） 以下为：显示了细胞的照片。PC3 Neo细胞呈圆形上皮细胞形状（上面板）。PDGF-D转染细胞显示成纤维细胞型表型（下表）。原始放大倍数，×200。缩写：CM，条件培养基；PDGF-D，血小板衍生生长因子-D。

上皮和间充质表型标记的变化

为了进一步证实PDGF-D是否真的能在PC3细胞中诱导EMT，我们测定了E-cadherin、ZO-1和β-catenin免疫荧光染色。PC3 PDGF-D细胞获得了拉长的形状，这与E-cadherin在细胞-细胞连接处的丢失或重新定位一致(图2A). 同时，ZO-1从紧密连接处中断(图2B)、和β-在PC3 PDGF-D细胞中，连环蛋白从细胞膜重新分布到核室(图2C). 此外，在PDGF-D过度表达诱导的EMT过程中，间充质标志物的表达和分布模式发生了改变。免疫染色结果表明，PC3 PDGF-D细胞波形蛋白和巢蛋白的表达水平增加(图2D，2E). 在PC3 PDGF-D细胞中也观察到F-actin重组和扩散模式(图2F)与EMT表型相关，因此与获得癌干样细胞或“干细胞”特征一致。

在单独的窗口中打开

图2

PDGF-D调节上皮和间充质标记物的表达和位置。对培养72小时的PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞进行E-cadherin表达的免疫染色（A），ZO-1型（B）,β-连环蛋白（C），波形蛋白（D），或嵌套（E）或用Alexa Fluor 594阴茎倍体蛋白染色以检测F-actin（F）用4,6-二氨基-2-苯基吲哚作为DNA显示细胞核，如材料和方法中所述。箭头表示与PC3 Neo细胞相比，随着上皮-间充质转化（EMT）表型的获得，PC3 PDGF-D细胞中上皮和间充质标记物的表达或位置发生变化。箭头表示上皮或间充质标记物在无EMT的PC3 PDGF-D细胞中的表达或位置。原始放大倍数，×200。缩写：PDGF-D，血小板衍生生长因子-D。

PC3细胞PDGF-D过度表达下调PDGFR-β表达式

PDGF-D已被证明通过激活其同源受体PDGFR来调节许多细胞过程-β因此，我们分析了PDGFR的水平-βmRNA使用实时RT-PCR。我们发现PDGFR-β与PC3 Neo相比，PC3 PDGF-D细胞中的mRNA表达下调(图3A)，与蛋白质印迹分析结果一致，表明PDGFR的表达-β与PC3-Neo细胞相比，PC3-PDGF-D细胞中的蛋白质减少(图3B)而GAPDH蛋白的表达没有变化（用作蛋白质负荷控制）。进一步检测PDGFR的表达水平-β在PDGF-D过度表达的PC3细胞中，我们有免疫染色的PC3-Neo细胞和抗PDGFR的PC3-PDGF-D细胞-β抗体并发现PDGFR的表达-βPC3 Neo细胞高于PC3 PDGF-D细胞(图3C). 确定PDGF-D的过度表达是否是PDGFR降低的原因-β表达，我们用PDGF-D siRNA敲低PC3 PDGF-D细胞中PDGF-D-的表达。如所示图3D和3EPDGF-D表达下调显著增加PDGFR的表达-βmRNA和蛋白，GAPDH蛋白的表达没有变化（用作蛋白负荷控制）。这些结果清楚地表明，延长PDGF-D刺激导致PDGFR降低-β在PC3 PDGF-D细胞中表达，PDGF-D-的敲除导致PDGFR的恢复-β在PC3 PDGF-D细胞中表达。

在单独的窗口中打开

图3

PC3细胞中PDGF-D的过度表达降低PDGFR的表达-β.（A） ：实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）用于量化PDGFR-βPC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞的mRNA表达。β-肌动蛋白用于内部Con，以纠正RNA负载的潜在变化。（B） ：Western blot结果显示PDGFR的表达-β第8代和第16代PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞中的蛋白质。GAPDH用于蛋白质负载Con。（C） ：对培养72小时的PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞进行免疫染色，以检测PDGFR的表达-β以4,6-二氨基-2-苯基吲哚为DNA显示细胞核。原始放大倍数，×200。（D） ：实时RT-PCR结果显示PDGFR的表达-β用PDGF-D或Con-siRNA转染PC3 PDGF-DmRNA。用GAPDH对Con进行校正，以纠正RNA负载的潜在变化。（E） 以下为：用PDGF-D或Con-siRNA转染PC3 PDGF-D-细胞并培养48小时。制备细胞裂解物，对等量的蛋白质进行凝胶电泳，并使用PDGF-D和PDGFR的一级抗体进行Western blot分析-βGAPDH用于蛋白质负载Con。n个= 4. *,第页与Con Neo相比<.01；#，第页与Con PD相比<.01。缩写：Con，control；PD，血小板衍生生长因子-D；PDGF-D、血小板衍生生长因子-D；血小板衍生生长因子受体PDGFR；小干扰RNA。

PDGF-D过度表达诱导的EMT中mTOR通路的激活

我们的研究结果表明，PC3细胞受到PDGF-D过度表达诱导的EMT，EMT表型的细胞增殖增加[31]. mTOR是许多刺激物（如生长因子和营养素）的传感器和集成器，也参与细胞生长和增殖的控制。为了确定mTOR通路是否参与PDGF-D过度表达诱导的EMT，我们评估了磷酸化mTOR及其下游靶点4E-BP1的水平。PC3 PDGF-D细胞显示mTOR激活增加，同时E-钙粘蛋白丢失，波形蛋白和巢蛋白增加(图4A). 此外，我们发现β-在PDGF-D过表达细胞中，catenin显著下调(图4B)GAPDH蛋白的表达没有变化（用作蛋白质负荷控制）。为了进一步证实PDGF-D在PC3细胞中过度表达所诱导的EMT中mTOR的活性，我们分别使用特定的siRNA敲除了mTOR或raptor的表达。如所示图3CmTOR或猛禽特异性siRNA可有效降低这两种蛋白的表达，而GAPDH蛋白的表达无任何变化（用作蛋白质负荷控制）。mTOR的敲除与E-cadherin表达的伴随增加有关，而猛禽表达的敲除降低了PDGF-D细胞中的波形蛋白水平，表明mTOR激活与PDGF-D-过度表达诱导的EMT表型的获得有关。

在单独的窗口中打开

图4

mTOR通路有助于调节PD细胞上皮-间质转化的分子标记。（A） ：将第9-30代PC3-Neo和PD细胞培养在含有5%胎牛血清的RPMI培养基中72小时。制备细胞裂解物，对等量的蛋白质进行凝胶电泳，并使用针对E-cadherin、vimentin、nestin、phospho-mTOR（Ser^2,448)和磷酸化-4E-BP1（Thr³⁷/瑟⁴⁶).β-肌动蛋白作为Con的负载物。（B） ：如上所述培养细胞。Western blot分析显示β-PC3-Neo和PD细胞中的catenin。GAPDH用于蛋白质负载Con。（C） ：用mTOR或Rap特异性siRNA转染PC3 Neo和PD（第9代），并培养48小时。分别使用抗mTOR、Rap、E-cadherin和vimentin的抗体进行Western blot分析。GAPDH用于蛋白质装载。缩写：Con，control；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；mTOR，雷帕霉素的哺乳动物靶点；Neo，PC3 Neo；p-4E-BP1，磷酸化4E（e1F4E）结合蛋白；PD、PC3血小板衍生生长因子-D；血小板衍生生长因子-D；p-mTOR，雷帕霉素的磷酸化哺乳动物靶点；说唱，猛禽；小干扰RNA。

PDGF-D增加PC3细胞的粘附和侵袭

大量观察结果支持EMT在肿瘤侵袭和转移中发挥核心作用的观点[1]. 在本研究中，我们发现PDGF-D可以诱导PC3细胞产生EMT；因此，我们假设PDGF-D过度表达可能导致PC3细胞的粘附和侵袭增加。为了证明这一假设，我们进行了粘附和侵袭检测。我们发现，与PC3-Neo对照细胞相比，PDGF-D的过度表达显著促进了PC3细胞通过Matrigel（BD Biosciences）的侵袭(图5A). 为了进一步证实mTOR通路是否与PC3 PDGF-D细胞侵袭性增加有关，我们用上述siRNA敲低了mTOR或raptor的表达。如前所示，用mTOR或raptor siRNA转染PC3 PDGF-D细胞导致mTOR和raptor表达显著降低(图4C)发现这些细胞侵袭性较小(图5B、5C). 这些结果表明，mTOR激活与PDGF-D过度表达的PC3细胞侵袭性增加有关，这与EMT特征一致。此外，PDGF-D的过度表达在培养30分钟内显著增加了细胞的粘附，表明PDGF-D-过度表达的PC3细胞具有更强的粘附能力(图5D).

在单独的窗口中打开

图5

mTOR通路有助于增加PDGF-D过表达细胞的粘附和侵袭。采用BD-BioCoat肿瘤侵袭检测系统检测mTOR通路对PC3-PDGF-D细胞侵袭的影响。浸润细胞用4μg/ml钙化蛋白AM。（A） ：与PC3 Neo细胞相比，PC3 PDGF-D细胞的侵袭性显著增加。右侧面板显示了入侵细胞的相对荧光值。这些值表示侵入细胞的相对数量。（B） ：敲低mTOR或raptor的表达显著抑制PC3 PDGF-D细胞的侵袭。（C） ：入侵细胞的相对荧光值代表入侵细胞的比较数量。（D） ：PDGF-D过度表达显著增强了细胞的粘附性。n个= 4. *,第页<.01与Con.缩写词相比：Con，control；mTOR，雷帕霉素的哺乳动物靶点；血小板衍生生长因子-D；小干扰RNA。

NF公司-κB及其下游靶点Bcl-2参与PDGF-D过度表达诱导的EMT

为了进一步探索PDGF-D过表达促进EMT诱导，导致PC3细胞侵袭增加的机制，我们测量了NF-κB表达和DNA结合活性。Western blot分析结果表明，NF的表达-κ与对照细胞相比，PDGF-D过表达PC3细胞的细胞裂解液中B（p65蛋白）上调(图6A)GAPDH蛋白的表达没有变化（用作蛋白质负荷控制）。此外，活化的NF-κ核室中的B也增加，这与NF增加有关-κB DNA结合活性(图6B)其中Rb-蛋白质印迹显示相同的核蛋白负载量。因为Bcl-2是NF的下游靶基因之一-κB，已知有助于诱导EMT和增加癌细胞侵袭[22]，我们测试了NF的激活-κB可导致PDGF-D过度表达PC3细胞中Bcl-2水平升高。我们发现，与PC3 Neo细胞相比，PC3 PDGF-D细胞中Bcl-2的表达显著上调(图6A). 这些结果表明PDGF-D的过度表达导致NF的激活-κB、 从而上调其靶基因的表达，尤其是Bcl-2，这似乎是EMT诱导的部分原因。

在单独的窗口中打开

图6

血小板衍生生长因子D诱导NF活化-κB和上调其下游靶点Bcl-2的表达，这与上皮-间充质转化有关。（A） ：Western blot分析显示NF的表达-κB来自细胞裂解物和细胞核，Bcl-2在Neo和PD细胞中表达。GAPDH和Rb用于蛋白质负载Cons，显示来自总细胞裂解物和核蛋白的蛋白质负载量分别相等。（B） ：电泳迁移率变化分析结果显示NF增加-κ与Neo细胞相比，PD细胞中的B DNA结合活性。（C） ：用Bcl-2过表达质粒转染PC3细胞可降低E-cadherin的表达。（D） ：用Bcl-2 siRNA转染PD细胞可下调波形蛋白的表达。缩写：Con，control；尼奥，PC3尼奥；NF公司-κB、 核因子-κB类；PD、PC3血小板衍生生长因子-D；小干扰RNA。

为了进一步确定Bcl-2是否参与EMT的诱导，我们用Bcl-2表达质粒或空载体转染亲代PC3细胞，并用Bcl-2-siRNA转染抑制PDGF-D过度表达PC3细胞中Bcl-2的表达。我们发现Bcl-2的过度表达显著降低了亲代PC3细胞中E-cadherin的水平(图6C)而Bcl-2的敲除抑制了PDGF-D过度表达细胞中波形蛋白的表达(图6D). E-钙粘蛋白和波形蛋白分别是上皮细胞和间充质细胞的关键标志物。因此，这些结果表明，Bcl-2可能在PC3前列腺癌细胞PDGF-D过度表达诱导的EMT中起部分作用。

PDGF-D过度表达增加SCID小鼠肿瘤生长率

PDGF-D的过度表达导致PC3细胞中EMT的诱导并促进体外侵袭，因此，它可能导致体内肿瘤生长速度的增加。因此，我们利用实验性骨转移动物模型测试了PC3 PDGF-D细胞诱导的肿瘤的生长速度是否比PC3 Neo细胞更高[30]. 我们发现，注射PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞对肿瘤潜伏期几乎没有影响（细胞植入后20天，减去植入的骨体积即可检测到可测量的肿瘤体积），但其生长动力学存在显著差异。PC3 Neo细胞的生长动力学与早期发表的相似[32]; 相对于PC3-Neo组，PC3-PDGF-D组在第20天表现出类似的生长（Neo，61.65±50.33毫米^三与PDGF-D相比，61.8±41.12毫米^三)然后在第26、29和35天测量PC3 PDGF-D细胞的肿瘤生长速度非常快，达到8倍（Neo，113.83±86.6 mm^三与PDGF-D相比，952.05±354.63 mm^三)，10倍（Neo，151.88±111.96毫米^三与PDGF-D相比，1578.85±599.33 mm^三)，和12倍（Neo，207.28±78.74毫米^三与PDGF-D相比，2497.31±957.44 mm^三)分别为(图7A、7B). 这些结果表明PDGF-D的过度表达有助于促进肿瘤生长，因此，部分原因是由于获得了EMT（癌症干细胞或干细胞）表型；这些结果与我们的细胞粘附和侵袭检测结果一致(图5).

在单独的窗口中打开

图7

PDGF-D增加肿瘤生长率。（A） ：显示了动物实验的时间表。（B） ：PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞（1×10⁵)骨内注射。每周用卡尺测量两次评估各组肿瘤体积。将PC3 PDGF-D的数据与PC3 Neo组从第20天（肿瘤细胞植入后第20天）开始的数据进行比较，直到动物被处死（肿瘤细胞移植后第35天）。n个= 8. *,第页< .001. 缩写：Hu，human；PDGF-D，血小板衍生生长因子-D。

讨论

大多数恶性肿瘤的进展与上皮分化的丧失和向间充质表型的转变有关，并伴有细胞运动性和侵袭性的增加。这一过程被称为EMT，因此可能类似于癌症干细胞或干细胞，其特征是上皮细胞分子标记物下调，细胞间连接丢失，导致细胞间粘附减少，和间充质分子的增加[4]. 在本研究中，我们发现用PDGF-D表达质粒转染PC3细胞后，细胞形态发生了与EMT一致的变化。此外，免疫染色结果显示E-cadherin和ZO-1的下调和重新定位以及β-PC3 PDGF-D细胞中从细胞膜到核室的连环蛋白。同时，PDGF-D过度表达的细胞表现出波形蛋白和巢蛋白的上调表达以及F-actin重组的诱导，所有这些都符合EMT特征。

尽管PC3细胞系是一种高度恶性的前列腺癌细胞系，但大多数前列腺癌的EMT研究都使用了PC3和DU145细胞[三]. 这些细胞株表现出细胞-细胞粘附连接的分子标记物的表达，如E-cadherin，并伴有上皮样形态，这与原发性上皮性肿瘤细胞的特征相一致。越来越多的证据表明，肿瘤进展与EMT的发生有关，EMT使肿瘤细胞获得浸润周围组织和远处转移的能力[2,33,34]. 有趣的是，播散的间充质肿瘤细胞在转移部位经历了逆向转变（即间充质到上皮的转变[MET]），以允许肿瘤在次级部位定植[35,36]. 患者原发部位的前列腺癌细胞极有可能经历EMT，并且在到达转移部位时也可能获得MET特征（例如骨和脑，PC3和DU145细胞最初分别来自于骨和脑），这也可能与获得不完全上皮表型或混合表型有关，通常称为融合细胞表型[1,三]. 因此，我们在研究中选择PC3细胞来研究PDGF-D过度表达在EMT诱导中的作用，因为已知PDGF-D通过调节多种肿瘤细胞系和肿瘤中的细胞增殖、侵袭和血管生成与肿瘤进展相关[13]. 最近的一项研究表明，PDGF-A在TGF诱导EMT中起着关键作用-β在肝癌细胞中[6,7]. 有趣的是，PDGF-B还被证明通过调节p68 RNA解旋酶的磷酸化来诱导EMT，该磷酸化可促进核转位β-连环蛋白[9].β-连环蛋白是细胞粘附连接的一种成分，将E-cadherin与α-连环蛋白形成E-cadherin-β-连环蛋白-α-与肌动蛋白细胞骨架相连的粘附连接处的连环蛋白复合体[37]. 下调β-已知连环蛋白介导E-钙粘蛋白的分离-β-连环蛋白-α-膜上的连环蛋白复合物，已被发现与EMT有关[38]. 最近的一项研究表明β-EMT需要PDGF-B介导的连环蛋白[9]. 在我们的研究中，PDGF-D的过度表达降低了β-连环蛋白与诱导的核易位β-根据我们的结果，我们建议β-catenin在PDGF-D诱导的EMT中起重要作用。然而，可能是由于PDGF-D在数代中过度表达而导致PC3细胞长期暴露，或在连续传代过程中选择某些克隆，都会导致PDGF-D-过度表达PC3前列腺癌细胞中观察到EMT，尽管这是极不可能的，因为PC3 Neo细胞在类似的传代中没有表现出任何变化。这些激动人心的结果进一步表明，未来必须进行更多的机械研究；这些研究正在我们的实验室进行。

PDGFR公司-β是PDGF-D的同源受体。在本研究中，我们发现PDGF-D-过度表达显著下调PDGFR的表达-β与PC3 Neo细胞相比，PC3 PDGF-D细胞中的mRNA和蛋白质与已发表的结果一致，该结果表明NIH/3T3细胞中PDGF-D的过度表达下调了PDGFR-α和PDGFR-β表达及其激活。尽管观察到生长因子转染剂中的受体磷酸化降低，但下游有丝分裂信号通路仍被激活，导致生长因子转转染剂（PDGF-D转染的NIH/3T3细胞）的增殖高于相应的对照组[10]. 早期的研究清楚地表明，细胞长期接触激动剂导致其受体下调，部分原因是受体的mRNA水平降低[39–42]这些发现与我们目前的结果一致。然而，有人提出了一个问题，即PDGF-D如何在其受体转录水平较低的情况下维持EMT事件。研究表明PDGFR的表达-β与细胞的生长状态有关。PDGFR表达增加-β可能与G的生长停滞状态有关₀相反，增殖细胞和癌基因转化细胞系在血清剥夺后未发生生长停滞，表达构成性低水平的PDGFR-β[43,44]. 其他研究表明，细胞形态和细胞骨架元件与PDGFR的调节有关-βp21ras转化细胞的活性[45]. 这些发现表明PDGF信号通路的下游靶点调节PDGFR-β通过反馈机制发挥作用。最近的研究也表明，mTOR通路的激活可以下调PDGFR的表达-β转录水平的mRNA[46,47]. 有趣的是，mTOR复合物2（mTORC2）的一种新成分PRR5可以调节PDGFR的表达-βmRNA及其下游信号转导和mTORC2已被证明与肌动蛋白细胞骨架重组有关[48]. 在我们的研究中，PDGF-D的过度表达导致mTOR通路的过度激活，伴随着细胞形态和肌动蛋白细胞骨架重组的变化，这很可能与PDGFR的下调有关-βmRNA。更重要的是，PDGF-D过表达的PC3细胞即使在与其他研究人员在p21ras转化细胞中观察到的类似的血清剥夺条件下也显示出快速的生长速度[43,49]. 在我们的研究中，我们发现PDGF-D的过度表达诱导了mTOR的激活，其特征是4E-BP和S6K的磷酸化增加[31]从而抑制PDGFR-βmRNA表达通过负反馈调节。另一方面，S6K的激活通过在Ser^2,448[50,51]这与我们的结果一致，即猛禽的击倒降低了mTOR在Ser^2,448(图4C). 这种正反馈回路可能是PDGF-D过表达PC3细胞在低水平受体转录下维持EMT事件的机制之一。目前正在进行其他研究，以探讨mTOR如何与其他信号通路相互作用，控制PDGF-D过度表达PC3细胞中的EMT事件。在本研究中，尽管PDGFR水平降低-β在PDGF-D过度表达的PC3细胞的mRNA和蛋白中，我们发现与对照细胞相比，PDGF-D-过度表达PC3细胞具有更高的增殖率，PDGF-D介导下游信号mTOR通路的激活，这表明PC3细胞持续暴露于PDGF-D导致PDGF D介导其下游信号的激活，这有助于EMT表型。

有趣的是，最近的研究也表明，许多生长因子，如血管内皮生长因子、FGF、EGF和PDGF，具有脑内信号转导机制[52,53]这可能是PDGF-D过度表达导致EMT的机制之一，如我们的研究所示。我们的结果首次表明，PDGF-D可以在PC3细胞中诱导EMT，并且额外的机制研究表明EMT与mTOR的激活有关。正如我们研究中mTOR和4E-BP1磷酸化增强所记录的那样，mTOR通路的激活与E-钙粘蛋白的丢失以及波形蛋白和巢蛋白的增加相关，这与细胞粘附和侵袭增加有关，符合EMT特征的获得。有趣的是，mTOR或猛禽的敲低显著抑制了PC3 PDGF-D细胞的侵袭，这表明PDGF-D-诱导的mTOR活化与EMT在机制上相关，并且mTOR的失活可能导致EMT的逆转。然而，在这项研究中，用siRNA敲除mTOR后，E-cadherin蛋白的表达增加，但波形蛋白的表达没有减少，而用siRNA击倒猛禽后，波形蛋白蛋白的表达减少，但E-cadherin蛋白的表达并没有显著增加，尽管略有增加。以下观察结果可以部分解释这些结果。Sarbassov等人发现果蝇属S6K和猛禽（dS6K和draptor）双链RNA（dsRNA）显著增加p-dAkt，这是由于消除了dS6K对p-dAkt的负反馈抑制[54]. 然而，尽管dS6K磷酸化的降低程度与draptor dsRNA相同，但dTOR dsRNA未能增加dAkt磷酸化，反而减少了少量。在人类细胞系中也得到了类似的结果。越来越多的证据也表明Akt的激活与EMT有关。Irie等人发现，在胰岛素样生长因子-I受体（IGF-IR）刺激的细胞中敲低Akt1促进了EMT并增强了细胞迁移，这表明Akt1抑制了IGF-IR刺激的细胞中的EMT[55]. 因此，敲除猛禽导致Akt磷酸化增加，这反过来又通过抑制mTOR过度激活条件下的波形蛋白表达来抑制EMT，类似于IGF-IR刺激细胞的条件，而敲除mTOR并没有增加p-Akt，而是降低了p-Akt，因此波形蛋白的表达没有受到抑制。已发表的数据以及我们的结果清楚地表明，这些基因在EMT过程中具有复杂的调控。特定siRNA的mTOR或猛禽击倒实验与PDGF-D过度表达细胞中E-cadherin表达的显著增加和波形蛋白表达的减少相关，表明EMT的表型逆转，尽管PC3 PDGF-D细胞中mTOR或raptor基因敲除的稳定细胞株可能会有更深入的机制研究，因此，有必要进一步研究PC3 PDGF-D细胞EMT转化为MET的可能性。

结果表明，mTOR的激活与EMT相关，这就提出了一个问题，即mTOR激活如何调节上皮和间充质分子标记的表达和位置，以及mTOR是否与其他因素相互作用来调节EMT。为了回答这个问题，我们确定了NF的表达-κB和NF的DNA结合活性-κPC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞中的B。PDGF-D显著增加NF的表达-κB及其DNA结合活性。最近的几项研究表明，NF的激活-κB通过调节转录因子（如蜗牛、ZEB1和ZEB2）的表达与EMT过程发生机械联系，导致E-cadherin的表达减少[23,24]. Bachelder等人证明，糖原合成酶激酶-3（GSK-3）的活性和功能对于通过维持E-cadherin的表达来维持上皮结构至关重要，并且还确定GSK-3是NF的抑制剂-κB激活[23]. 此外，研究表明，S6K在mTOR依赖性反馈抑制Akt的条件下使GSK-3失活，这是由mTOR过度激活引起的。总的来说，这些报告以及我们目前的数据清楚地表明，PDGF-D在PC3细胞中诱导的EMT是通过激活mTOR发生的，导致mTOR依赖性的Akt反馈抑制（数据未显示）。在这些条件下，激活mTOR的直接下游靶点S6K可以抑制GSK-3的活性，而GSK-3活性又可能与NF的激活有关-κB、 以前的研究结果表明NF在一定程度上支持了这一观点-κB在EMT过程中起着核心作用[21].

即使NF的激活-κB与EMT相关，尚不清楚NF的下游基因是什么-κB在机械上与EMT相关。因此，我们测试了NF的作用-κEMT过程中的B下游基因。我们发现，与PC3-Neo细胞相比，PDGF-D过度表达的PC3细胞中Bcl-2的表达水平显著增加。我们还发现，亲代PC3细胞中Bcl-2的过度表达抑制了E-cadherin的表达，而Bcl-2表达的下调导致PC3 PDGF-D细胞中波形蛋白表达的下调，这表明Bcl-2蛋白表达的调节可能在PDGF-D-诱导的EMT中起重要作用。然而，敲低Bcl-2表达并没有增加EMT患者PC3 PDGF-D细胞中E-cadherin的表达，这表明Bcl-2在调节上皮细胞和间充质细胞中E-cad和vimentin的表达方面具有不同的功能。Bcl-2与侵袭和转移有关，可能与Bcl-2调节波形蛋白表达有关，但可能与EMT患者PC3 PDGF-D细胞中E-cadherin的表达无关。最近的研究表明，聚ADP-核糖聚合酶-1（PARP-1）可以上调波形蛋白的表达[56,57]已知Bcl-2抑制PARP裂解并增加PARP-1水平。因此，Bcl-2的敲除可以通过增加PARP的裂解来降低波形蛋白的表达。在我们的研究中，我们发现在PDGF-D过度表达的PC3细胞中，Bcl-2和PARP-1的表达水平显著增加，这与PDGF-D-过度表达PC3细胞与PC3-Neo细胞相比，凋亡细胞死亡水平较低一致（未公布的数据）。Bcl-2表达下调导致PC3 PDGF-D细胞中波形蛋白表达下调，这被认为部分是由于Bcl-2调节PARP所致，因此，该途径可能与EMT表型获得过程中E-cadherin的调节没有直接联系。然而，我们的结果是令人振奋的，并且清楚地表明，需要进一步深入研究来阐明Bcl-2的复杂调控及其与EMT期间E-cadherin和vimentin调控的关联。

结论

在这项研究中，我们的结果首次提供了强有力的证据，表明PDGF-D的过度表达可以诱导EMT，因此，它与体外侵袭性增加和体内肿瘤生长速度增加有关。PDGF-D诱导的EMT在机制上与mTOR和NF的激活有关-κB信号传导以及Bcl-2的过度表达。根据我们的研究结果，我们认为通过新的方法使前列腺癌中PDGF-D信号的失活可能是在不久的将来预防和/或治疗前列腺癌进展的重要手段。

致谢

脚注

参考文献