超增强子干扰对肿瘤癌基因的选择性抑制

超增强因子与多发性骨髓瘤关键基因相关

对约8000个增强子区域的进一步分析表明，308个增强器的MED1信号显著大于所有其他增强子和启动子(图2A和S2A和表S2). 这308个超级增强子在大小和介体水平上与典型增强子不同(图2B). 值得注意的是，约40%的增强子结合介体和BRD4占据了这308个超增强子。典型增强剂的中位数为1.3 kb，而超级增强剂的中位数为19.4 kb。因此，这些超级增强子比典型增强子大15倍，并且根据ChIP-seq信号，被18倍的介体和16倍的BRD4占据。在这些大区域中观察到类似的高水平H3K27Ac(图2B). 显示介体占据谱两端的超增强子的基因轨迹示例(图2A)如所示图2C发现最大的超级增强器与IGLL5型该基因编码在这些细胞中高水平表达的免疫球蛋白lambda肽。

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图2

多发性骨髓瘤中发现的超增强因子

（A） MM1.S中所有增强器的MED1 ChIP-seq信号总量，以增强器区域中每百万读次数为单位。增强器通过增加MED1 ChIP-seqsignal进行排名。

（B） 典型增强子和超增强子中全球MED1（红线）和BRD4（蓝线）占据率的后基因表示。x轴显示增强子（左）或超增强子区域（右）的开始和结束，其两侧为相邻序列的±5 kb。x轴上的增强和超级增强区域相对缩放。y轴以rpm/bp为单位显示平均信号。

（C） 典型增强子上游MED1（顶部）和BRD4（底部）ChIP-seq占据率的基因轨迹排名前1，超级增强器下游IGLL5型，典型的增强子上游SMARCA4系统和超级增强器重叠CCND2号机组TSS基因。x轴显示基因组位置，含有超增强子的区域用灰色方框表示。y轴以rpm/bp为单位显示ChIP-seq占用信号。

（D） 左：具有近端典型增强子（白色）或近端超增强子的基因的表达值方框图（粉红色）。y轴以Log2任意单位显示表达式值。右：具有近端典型增强子（白色）或近端超增强子的基因的细胞类型特异性值方框图（紫色）。y轴显示Z基因的Jensen Shannon（JS）差异统计的得分，较高的值对应于更具细胞类型特异性的表达模式。表达水平之间的变化显著（双尾Welch t检验，p<2×10⁻¹⁶)以及细胞类型特异性水平之间的变化（双尾Welch t检验，p=1×10−14）。

（E） 条形图描绘了含有MM1.S细胞中典型增强子和超级增强子的克隆片段的报告构建体的萤光素酶活性。将三个超增强子IGLL5、DUSP5和SUB1以及三个典型增强子PDHX、SERPINB8和TOP1的2kb片段分别克隆到荧光素酶基因下游的报告质粒中，在MED1占有率方面排名分别为1、129、227、2352、4203和4794MYC公司发起人。荧光素酶活性表示为折叠空载体。误差条代表三次实验的SD。

另请参见图S2和数据S1。

接下来，我们试图确定最有可能与超增强子相关的完整的MM1.S基因集。增强子倾向于与相邻基因循环并关联，以激活其转录(Göndör和Ohlsson，2009年;Lelli等人，2012年;Ong和Corces，2011年;斯皮茨和弗隆，2012年). 大多数这些相互作用发生在增强子的～50 kb距离内(Chepelev等人，2012年). 使用一个简单的邻近规则，我们将所有转录活性基因（TSS）分配给50 kb窗口内的超增强子，这是一种识别胚胎干细胞中大量真增强子/启动子相互作用的方法(Dixon等人，2012年). 这确定了681个与超增强子相关的基因(表S3)其中307个具有超增强子，与基因的一部分重叠，如图所示CCND2号机组在里面图2C.

与具有典型增强子的基因相比，超增强子相关基因的表达水平普遍较高，并且倾向于在MM1.S细胞中特异表达(图2D). 为了测试与典型增强子相比，超增强子组分是否具有更强的活性，我们将具有代表性的超增强器或类似大小的典型增强器片段克隆到荧光素酶报告基因构建物中，并将其转染到MM1.S细胞中。与相似大小的典型增强子相比，超增强子克隆序列片段产生的荧光素酶活性高2至3倍(图2E和扩展实验程序）。这些结果与超增强剂有助于激活调节和增强MM1.S癌细胞状态的关键基因的高水平转录的概念一致。

超增强子相关基因包括大多数以前被证明在MM生物学中具有重要作用的基因，包括MYC、IRF4、PRDM1/BLIMP-1、和XBP1型(图3A).MYC公司是MM致癌的关键驱动因素(Chng等人，2011年;Dib等人，2008年;Holien等人，2012年;Shou等人，2000年)和MM1.SMYC公司该位点包含一个染色体重排MYC公司在免疫球蛋白H增强子，在MM1.S细胞中具有超增强子的资格。这个IRF4型该基因编码一种在MM中经常被解除调控的关键浆细胞转录因子(Shaffer等人，2008年).PRDM1/BLIMP-1编码一种转录因子，该转录因子被认为是浆细胞发育的主要调节因子，在小鼠模型中是浆细胞肿瘤形成所必需的(Shapiro-Shelef等人，2003年;Turner等人，1994年).XBP1型编码控制浆细胞分化的CREB-ATF家族的碱性区亮氨酸拉链（bZIP）转录因子(Reimold等人，2001年).XBP1型在人类MM中经常过度表达，并能在小鼠模型中推动MM的发展(Carrasco等人，2007年;Claudio等人，2002年).

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图3

超增强因子与多发性骨髓瘤关键基因相关

（A和B）MED1和BRD4 ChIP-seq在MM生物学中具有重要作用的基因（A）或癌症中具有重要功能的基因（B）附近超增强子的基因轨迹。超级增强子被描绘在基因轨道上的灰色方框中。x轴显示基因组位置，含有超增强子的区域用灰色方框表示。y轴以rpm/bp为单位显示ChIP-seq占用信号。

超增强子与许多其他基因相关，这些基因在更普遍的癌症发病机制中起着重要作用(图3B). 细胞周期蛋白D2(CCND2号机组)在许多人类癌症中被解除管制，包括MM(Bergsagel等人，2005年;Musgrove等人，2011年). PIM1激酶与许多不同癌症的生物学有关(Shah等人，2008年).MCL1公司和BCL-xL公司BCL-2是凋亡调节因子家族的成员，在癌症中经常被解除调控，促进细胞生存和化疗耐药(Beroukhim等人，2010年). 我们的结论是，超增强子经常与MM和其他人类癌症生物学中显著存在的基因相关。

抑制BRD4导致BRD4全基因组移位

BRD4与染色质相关蛋白相互作用，如转录因子、介体复合物和乙酰化组蛋白(Dawson等人，2011年;Dey等人，2003年;Jang等人，2005年;Jiang等人，1998年;吴和蒋，2007;Wu等人，2013年). 以前的研究表明，用JQ1处理MM1.S细胞会导致BRD4水平降低免疫球蛋白H驱动的增强器MYC公司表达式(Delmore等人，2011年)但尚不清楚这种治疗是否会导致与基因组相关的BRD4水平的普遍降低。我们发现，用500 nM JQ1处理MM1.S细胞6小时，可使BRD4全基因组水平降低约70%(图4A和4B). 通过对单个基因轨迹的检测，BRD4占用率的降低是显而易见的(图4C)并通过增强子和TSS平均效应的全球分析(图4D). JQ1治疗导致增强子处BRD4信号降低约60%，启动子处BRD信号降低约90%(图4D). BRD4的减少在超级增强子（如与IgH-MYC和CCND2号机组(图4E)BRD4的损失已接近尾声。我们的结论是，BET溴代多巴胺对BRD4的抑制导致MM1.S细胞基因组中增强子和启动子的BRD4水平降低。

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图4

抑制BRD4导致BRD4全基因组缺失

（A） 显示DMSO（顶部）或500 nM JQ1（底部）处理后21号染色体35 Mb右臂BRD4 ChIP-seq占据的轨迹。21号染色体的象形图显示在基因轨迹上方，相关区域用蓝色突出显示。基因轨迹的x轴显示基因组位置，y轴显示BRD4 ChIP-seq信号，单位为rpm/bp。

（B） 方框图显示了DMSO（左）或500nM JQ1（右）处理后BRD4富集区的BRD4-ChIP-seq信号的分布。在DMSO处理的MM1.S细胞中定义了BRD4富集区。y轴以rpm/bp为单位显示BRD4 ChIP-seq信号。JQ1后BRD4富集区BRD4入住率的损失非常显著（p值<1×10⁻¹⁶，韦尔奇t检验）。

（C） BRD4 ChIP-seq在其增强子（左）和启动子（右）的占有率的基因轨迹SMARCA4系统DMSO（顶部）或500 nM JQ1（底部）处理6小时后，在MM1.S细胞中。x轴显示基因组位置，含增强子的区域用白色方框表示。y轴以rpm/bp为单位显示ChIP-seq占用信号。

（D） 二甲基亚砜（实线）或500 nM JQ1（虚线）处理后全球BRD4在增强子和启动子上占据的后基因表现。x轴显示了位于增强子区域中心（左侧）或活性基因TSS两侧的±2.5 kb区域。y轴显示平均背景减去ChIP-seq信号，单位为rpm/bp。

（E） DMSO（顶部）或500 nM JQ1（底部）处理后，超增强子BRD4结合的基因轨迹。x轴显示基因组位置，含有超增强子的区域用灰色方框表示。y轴以rpm/bp为单位显示ChIP-seq占用信号。

超增强相关基因的转录对BRD4抑制高度敏感

增强子是通过多种转录因子和辅活化因子的协同结合形成的(凯里，1998年;Carey等人，1990年;Giese等人，1995年;Kim和Maniatis，1997年;塔诺斯和马尼提斯，1995年). 由于这种结合行为，当增强子结合因子水平降低时，由许多协同相互作用因子结合的增强子比由较少因子结合的增强子失去活性的速度更快(Giniger和Ptashne，1988年;格里格斯和约翰斯顿，1991年). 超级增强器的存在MYC公司与MM相关的其他关键基因使我们考虑到这样一个假设，即与典型增强子相比，超增强子对BRD4水平降低更敏感，并且当BRD4被抑制时，与超增强器相关的基因可能比具有平均增强子的基因经历更大的转录减少(图5A).

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图5

BRD4在超级增强剂中的占有率对溴代胺的抑制高度敏感

（A） 增强子相关因子在超增强子中的协同作用如何导致更高的转录输出和对因子浓度的敏感性增加的示意性示例。

（B） 测量不同浓度的JQ1全基因组对BRD4占用率的影响。描述实验过程的示意图。

（C） 短期JQ1处理（6小时）对MM1.S细胞活力影响不大。用JQ1（5、50、500或5000 nM）或载体（DMSO，0.05%）治疗6、24、48和72小时后，通过ATP水平（CellTiterGlo）测量MM1.S细胞的JQ1敏感性。误差条表示三次重复实验的SD。

（D） JQ1或DMSO处理6小时后相对MYC水平的Western blot。

（E） JQ1或DMSO处理6小时后相对BRD4水平的Western blot。JQ1或DMSO处理6小时后免疫沉淀的BRD4的相对水平的ChIP蛋白质印迹。

（F） 线形图显示了在不同JQ1浓度下，典型增强剂（灰线）或超级增强剂（红线）处理6小时后BRD4的剩余占用率。y轴显示了BRD4剩余占用率与DMSO的比例。x轴显示了不同的JQ1浓度（DMSO[无]、5 nM、50 nM和500 nM）。误差条表示平均值的95%置信区间（95%置信区间）。

（G） 不同浓度JQ1处理后BRD4 ChIP-seq占有率的基因轨迹IgH-MYC-相关的超级增强器（左）和SMARCA4系统-相关的典型增强子（右）。x轴显示基因组位置，灰色方框表示超增强区域。y轴以rpm/bp为单位显示ChIP-seq占用信号。每个浓度的JQ1处理后BRD4的剩余百分比标注在基因轨迹的右侧。

为了验证这一假设，我们首先检查了不同浓度的JQ1对BRD4基因组占用率的影响(图5B). 在这些不同浓度下处理6小时后，JQ1对MM1.S细胞的存活率几乎没有影响，而在以后的时间点，JQ2具有显著的抗增殖作用(图5C). 正如预期的那样，MM1.S细胞暴露于50 nM或更大剂量的JQ1 6小时后，MYC蛋白水平显著降低(图6D) (Delmore等人，2011年). 相反，JQ1没有影响细胞内BRD4蛋白的总水平，也没有显著降低ChIP效率(图5E). 当在暴露于不断增加的JQ1浓度的细胞中检测全基因组BRD4的占有率时，很明显，超增强子显示出比典型增强子区域更大的BRD4占有率损失(图5F). 例如免疫球蛋白H在用5 nM或50 nM JQ1处理的细胞中，与典型的增强子区域（例如：SMARCA4系统(图5G). 最终，几乎所有BRD4入住率都在免疫球蛋白H用500 nM JQ1处理后的超级增强子（与DMSO对照相比减少97%），而在SMARCA4系统不太明显（与DMSO控制相比减少了71%）(图5G).

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图6

JQ1导致超增强癌基因的转录失衡

（A） 显示日志的方框图₂用500 nM JQ1处理细胞的一段时间内（左），或用不同数量的JQ1（右）处理细胞的6小时浓度过程中，JQ1治疗细胞与对照细胞中所有活性转录基因的基因表达变化。y轴显示Log₂与未经处理的对照细胞（左图）或用二甲基亚砜处理6小时的对照细胞相比，基因表达的变化（右图）。

（B和C）线形图，显示与典型增强子相关的基因（灰线）或与超增强子关联的基因（红线）在JQ1治疗后与对照细胞相比，基因表达的Log2变化具有时间（B）或剂量（C）依赖性。y轴显示了JQ1处理与未处理对照细胞基因表达的Log2变化。x轴显示了500 nM JQ1处理时间（B）或JQ1 6小时处理浓度（C）。误差条表示平均值的95%置信区间（95%置信区间）。

（D） 显示日志的图表₂JQ1处理后基因表达随时间的变化，基因在MM1.S细胞中的表达排名前10%。每一行代表一个基因MYC公司和IRF4型用红色绘制的基因。y轴显示Log₂JQ1处理与未处理对照细胞的基因表达变化。x轴显示500 nM JQ1处理时间。

（E） 显示不同浓度JQ1处理后荧光素酶报告基因构建物荧光素素酶活性的折线图IGLL5型超级增强器（红线）或PDHX公司典型增强器（灰色线）。y轴表示任意单位的相对荧光素酶活性。x轴显示JQ1浓度。误差线为SEM。

（F） 条形图显示启动子、典型增强子和超增强子处MED1（顶部，红色）或CDK9（底部，绿色）的损失百分比。误差线代表95%置信区间。

（G） 500 nM JQ1处理6小时后MM1.S细胞中所有转录活性基因伸长基因体区域的RNA Pol II密度损失图。基因的顺序是以对数为单位的RNA Pol II伸长减少₂折叠损失。大于0.5 Log的基因₂伸长RNA Pol II的折叠变化以绿色（损失）或红色（增益）阴影显示。RNA Pol II的丢失量表示为选择的基因。

（H） 显示日志的条形图₂具有典型增强子（左，灰色）的基因或具有超增强子的基因（右，红色）在500 nM JQ1处理6小时后，延长基因体区域中RNA Pol II密度的倍数变化。误差条表示平均值的95%置信区间（95%置信区间）。

二甲基亚砜（黑色）或500 nM JQ1处理（红色）后超增强子近端RNA Pol II ChIP-seq占用的（I和J）基因轨迹MYC公司基因（I）和IRF4型基因（J）。y轴以rpm/bp为单位显示ChIP-seq占用信号。

另请参见图S3.

接下来，我们研究了当BRD4被抑制时，与超增强子相关的基因是否会比具有平均增强子的基因经历更大的转录减少。正如预期的那样，用500 nM JQ1处理MM1.S细胞后，随着时间的推移，全球信使RNA（mRNA）水平逐渐降低(图6A和S3A系列). 同样，增加JQ1浓度的治疗导致全球mRNA水平的逐渐降低(图6A和S3B型). 超增强相关基因的mRNA选择性缺失发生在两个时间段(图6B)和集中依赖方式(图6C). 尤其是，MYC公司和IRF4型mRNA水平比其他表达水平相似的mRNAs更快耗尽(图6D). 来自超级增强子相关基因的转录物水平比来自具有多种典型增强子结合BRD4的基因的转录物水平受到的影响更大(图S3C和S3D). 因此，BET溴结构域抑制优先影响超级增强子驱动的基因的转录。

为了进一步测试超增强剂对BRD4抑制的特殊敏感性的模型，我们用含有超增强剂和典型增强剂片段的荧光素酶报告体转染MM1.S细胞，并检测了不同JQ1浓度对荧光素酶活性的影响。用JQ1处理后，转染有超增强报告基因的MM1.S细胞的荧光素酶活性比转染有典型增强子报告基因的细胞降低得更多(图6E). 有趣的是，观察到的超增强子结构的荧光素酶活性的剂量-反应曲线与预期的由多个因素共同结合的增强子的剂量-响应曲线一致(图5A) (Giniger和Ptashne，1988年;格里格斯和约翰斯顿，1991年). 这些结果也与超增强子负责基因转录对BRD4抑制的特殊敏感性的模型相一致。

BRD4抑制与转录延伸

在活性基因中，增强子和核心启动子非常接近，因此与增强子相关的因子可以作用于TSS附近的转录装置，从而影响启动或延伸。已知BRD4与介体和P-TEFb相互作用，并参与RNA Pol II对转录延伸的控制(Conaway和Conaway，2011年;Dawson等人，2011年;Jang等人，2005年;Krueger等人，2010年;Rahman等人，2011年;Yang等人，2005年). 这表明，来自超增强子的BRD4优先丢失可能会影响这些位点的介体和P-TEFb水平，此外，来自超增强相关基因的mRNA水平降低可能是由于对转录延伸的影响。

为了测试这些预测，我们对MM1.S细胞中的介体成分MED1和P-TEFb复合物CDK9的催化亚单位进行了ChIP-seq，用DMSO或500 nM JQ1处理6小时。在对照细胞中，如预期的那样，在整个MM基因组的活性基因的增强子和启动子中发现了MED1与CDK9(图1A、1B、和第3e条). 在用JQ1处理的细胞中，MED1和CDK9的水平主要在增强子处观察到降低，在超增强子中损失最大(图6F). 由于许多超增强子跨越包围或重叠TSS的相邻区域，我们分析了超增强器TSS近端或TSS远端区域的MED1和CDK9缺失，再次观察到MED1与CDK9的缺失主要发生在TSS远端(图S3F). 我们的结论是，抑制BRD4基因组结合导致TSS远端基因组区域的介体和P-TEFb水平显著降低，其中最大的降低发生在超增强子。

为了确定BRD4水平的降低是否导致转录伸长的变化，我们在用500 nM JQ1处理MM1.S细胞前后，通过RNA Pol II的ChIP-seq来量化转录伸长的改变。然后，我们计算了所有转录活性基因在基因体区域中RNA Pol II占据的倍数损失，发现超过一半的这些基因在JQ1处理后表现出RNA Pol II密度的降低(图6G). 重要的是，与典型增强子相关的基因相比，与超增强子有关的基因在其延长的基因体区域中显示出更大的RNA Pol II减少(图6H和S3G系列). 对单个基因轨迹的检查显示，超级增强子相关基因存在明显的延伸缺陷，如MYC公司和IRF4型，使用MYC公司(图6I和6J). 因此，JQ1对MYC公司和其他超增强子相关基因可以解释，至少部分可以解释为超增强器对BRD4水平降低的敏感性，这导致了对暂停释放和转录延长的显著影响。

ChIP-Seq公司

ChIP的实施如Lin等人（2012）扩展实验程序中提供了更多详细信息。使用的抗体如下：总RNA Pol II（Rpb1 N末端），Santa Cruz sc-899批号K0111；MED1，Bethyl Labs A300-793A地块A300-793A-2；BRD4，Bethyl实验室A301-985A批次A301-985A-1；CDK9，Santa Cruz Biotechnology sc-484，批号D1612。MM1.S中H3K4Me3和H3K27Ac以及U-87 MG和H2171中MED1和H3K27Ac的ChIP-seq数据集之前已发布(Lin等人，2012年).

荧光素酶报告分析

从人类基因组DNA中扩增出一个最小的Myc启动子，并克隆到pGL3基本载体（Promega）的SacI和HindIII位点。增强子片段同样从人类基因组DNA中扩增，并克隆到pGL3-pMyc载体的BamHI和SalI位点。所有克隆引物均列于表S6使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将构建物转染到MM1.S细胞。pRL-SV40质粒（Promega）作为标准化对照进行共转染。培养细胞24小时，并使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）测量荧光素酶活性。对于JQ1浓度过程，转染24小时后，将细胞重新悬浮在含有不同浓度JQ1的新鲜培养基中，并在收获前再培养6小时。在Wallac EnVision（Perkin Elmer）平板阅读器上使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）进行发光测量。

细胞活性测定

使用CellTiterGlo分析试剂盒（Promega，G7571）测量细胞活力。将MM1.S细胞重新悬浮在含有JQ1（5 nM、50 nM、500 nM和1000 nM）或载剂（DMSO，0.05%）的新鲜培养基中，然后以10000个细胞/孔的体积在96 well板中镀100μl。在培养6、24、48和72小时后，通过添加CellTiter Glo试剂和Tecan Safire上的发光测量来测量存活率²读板器。

西方印迹法

使用标准方案进行蛋白质印迹。使用的抗体如下：c-Myc（表观物，类别：1472-1）、BRD4（表观物质，类别：5716-1）或β-肌动蛋白（西格玛，克隆AC-15，A5441）。

我们感谢Zi Peng Fan对生物信息学的支持；Michael R.McKeown为细胞活力检测提供帮助；Jun Qi提供JQ1；Tom Volkert、Jennifer Love、Sumeet Gupta和Jeong-Ah Kwon参加Whitehead Genome Technologies Core for Solexa测序；以及Young、Bradner和Vakoc实验室的成员进行有益的讨论。这项工作得到了瑞典研究委员会博士后奖学金VR-B0086301（J.L.）、Damon-Runyon癌症研究基金会（J.E.B.）、Burroughs-Welcome CAMS奖和NCI癌症中心支持拨款发展基金CA45508（C.R.V.）以及国家卫生研究院拨款HG002668（R.a.Y.）和CA146445（R.a.Y.，T.I.L.）的支持。R.A.Y.和J.E.B.是创始人，J.L.和D.A.O.已成为员工，C.R.V.是Syros Pharmaceuticals的科学顾问。