大鼠心肌细胞线粒体分裂的电镜研究^*

摘要

介绍

线粒体提供肌肉细胞收缩所需的ATP是公认的真理。虽然心肌细胞不分裂，但线粒体的半衰期相对较短，为5.6(Gross，1971年)至6.2天(Aschenbrenner等人，1970年)对于心肌组织，骨骼肌组织大约一周(Terjung，1979年)。为了维持细胞功能，线粒体的数量必须保持在接近恒定的水平。肌肉线粒体的补充似乎是通过细胞器分裂实现的。该通讯描述了心肌细胞中线粒体分裂产生的两条形态学途径。

材料和方法

本研究中使用的动物均来自美国国家老龄化研究院（印第安纳波利斯州哈兰·斯普拉格-道利公司），分别为成年（6个月龄）和老年（31个月龄，Fischer 344 X Brown Norway杂交大鼠，以及成年（6月龄）与老年（24个月龄。这些动物研究得到了凯斯西储大学医学院和路易斯·斯托克斯克利夫兰退伍军人事务医疗中心动物护理和使用委员会的批准。允许老鼠进食和饮水随意，并保持12小时的光照：暗循环。他们被斩首处死，并取出左心室标本。左心室样本立即浸入三醛-DMSO混合物中固定卡尔特·坦德勒（1971）在蒸馏水中冲洗后，将组织块固定在亚铁氰化物还原的四氧化锇中(卡诺夫斯基，1971年)。在蒸馏水中再次漂洗后，将其浸泡在酸化的乙酸腊酯中过夜(Tandler，1990年)。在蒸馏水中进行另一次漂洗后，在升高浓度的乙醇中脱水，通过环氧丙烷，并嵌入聚/床树脂中。薄片用酸化的乙酸铀酰连续染色(坦德勒，1990年)然后是佐藤的三铅染色，改性为Hanaichi等人（1986年）并在JEOL 1200EX电子显微镜下进行检查。

如前所述，制备分离的肌下膜（SSM）和纤维间线粒体（IFM）颗粒Palmer等人（1977年）Chen等人（2007）。这些最初是以八种强度固定的卡诺夫斯基定影液（1965）; 从这一点开始，如上所述，以与固体组织相同的方式处理微丸。

结果

与几乎所有被研究的哺乳动物一样，大鼠心脏中丰富的线粒体在肌原纤维之间平行排列，也在肌膜下方成行或成簇排列。这些细胞器中绝大多数为扁球形，有许多横向的嵴。心肌细胞中这种线粒体的丰富性保证了它们紧密贴附，但有利细胞器的双层膜仍然容易辨认。我们没有发现自噬液泡中存在线粒体的例子。成年大鼠和老年大鼠的心肌细胞没有明显的定性或定量差异，因此我们在此描述的线粒体没有确定来源。一些罕见的心肌线粒体揭示了一个膜分区的形成，它将一个细胞器分成两个不同的隔室(图1)。这两种细胞器都存在于肌下膜（SSM）中(图2)和纤维间（IFM）(图3)位置。隔板与边界膜的直接连续性在插图中以高分辨率显示图2外膜的侵入最终可能导致线粒体分裂。嵴有时会在隔板的相反侧略微重新定向，但不假定铜利嗪处理小鼠心脏线粒体分裂时所见的正交关系(Tandler和Hoppel，1972年).

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图1

纤维间线粒体的几个聚集点。箭头表示分裂的线粒体。24月龄Fischer 344大鼠。比例尺=1.0µm。

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图2

一只24个月大的Fischer 344大鼠的一对带中间分隔物（箭头）的肌下膜线粒体。从侧面可以看到隔墙两侧的嵴。比例尺=0.2µm。插入.中央分隔带与边界膜的连接点。请注意，外层膜跨越此连接。左边是一个传统的嵴。明确了所有膜的单元膜结构。24月龄Fischer 344大鼠。比例尺=0.2µm。

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图3

纤维间线粒体，具有纵向中央分隔（箭头）。六个月大的Fischer 344大鼠。比例尺=0.2µm

心肌细胞中一种不太常见的线粒体分裂类型涉及“捏”现象。在这种情况下，特定纤维间线粒体对侧的外膜深入侵入细胞器(图4，​,5).5)。如果侵入的反足膜最终接触，就会发生裂变。肌浆网（SR）的成分与侵袭性线粒体膜的位置之间存在一致的关系(图5)。未观察到缺乏SR的纤维间线粒体收缩。

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图4

正在被挤压的纤维间线粒体。注意与膜侵入有关的SR元素（箭头）。六个月大的Fischer 344大鼠。比例尺=0.2µm

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图5

几乎完成裂变过程的纤维间线粒体；两个潜在的子细胞器仍由细长的峡部连接。SR的一个元素已经穿透了收缩的末端。六个月大的Fischer 344大鼠。比例尺=0.2µm

从心肌中分离出的线粒体是典型的外观。这些球形细胞器中散布着极少数分裂的线粒体(图6和插图）。这种线粒体在高倍镜下显示图7和​和8。8隔板与边界膜之间的直接连续性非常明显。图8图示一个分离的线粒体，其分裂过程接近完成。

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图6

IFM颗粒的观察显微照片。箭头表示分裂的线粒体。该细胞器在插图中以高倍放大显示。虽然一些相邻的线粒体表面上似乎有隔板，但只有插图中显示的细胞器有符合我们对这种形态标准的隔板。六个月大的Fischer 344大鼠。比例尺=1.0µm。插入图6中分裂的线粒体。这种细胞器的双室结构因其两半的密度不同而更加突出，部分原因是其两侧嵴的方向不同。比例尺=1.0µm。

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图7

显示中间分隔的独立IFM。外层膜（箭头所示）没有延伸到隔板中。六个月大的杂交鼠。比例尺=0.2µm

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图8

一个孤立的线粒体，处于比上图所示更高级的分裂阶段。外膜的持续向内生长将导致两个子细胞器的分离。六个月大的杂交鼠。比例尺=0.2µm

我们试图确定线粒体分裂的频率就地心肌细胞。使用中显示的字段图1作为一个起点，我们仔细地扫描了该区域两侧的五个场，共有十个场，但没有发现线粒体分裂的另一个明显例子。这个练习重复了好几次，结果都一样。由于分离的线粒体颗粒以浓缩的形式含有这些细胞器，我们对十个场的序列进行了相同的程序，其中一个场的两侧各有五个场，在其中观察到分裂的线粒体，同样没有发现分裂线粒体的进一步例子。在分离的心肌线粒体颗粒中，细胞器的计数被简化了。在这种制备中，我们在2000多个线粒体中发现了一个分裂的线粒体。这无疑是低估了，因为只有当分裂的线粒体接近正常切片时，才能在薄片中识别出分裂线粒体。与垂直线仅有几度的倾斜确保了真正的隔墙会被误认为是普通的山脊。因为在放大镜下，一些孤立的线粒体似乎是分裂的，所以我们总是在高倍镜下检查这种可能分裂的细胞器，以确定这些细胞器是否确实在分裂过程中。在大多数情况下，这种假定的分裂线粒体并没有表现出真正的分裂（cf，图6).

讨论

我们检测的未经治疗的成年大鼠的心肌细胞显示出两种类型的线粒体形态，这两种形态已被证明是分裂的典范。第一种方法采用分区形式。这种外观的线粒体最初在半个多世纪前被描述为肝细胞(福塞特，1955年)但尚不能确定这种形态是否与分裂或融合或两者一致。直到一项关于恢复巨大线粒体的研究发表后，这一过程的方向才明确(Tandler等人，1969年)。在本实验中，由于饮食中核黄素缺乏，肝线粒体变得巨大（大于肝细胞核）(Tandler等人，1968年)服用了缺失的维生素。大线粒体迅速恢复到正常大小（48小时内），方法是在其底部形成带隔板的芽，然后外膜长入所述隔板。

在正常、非周边环境中，分区直接参与线粒体分裂拉森（1970）他调查了蝴蝶船长的肥胖身体，伊氏Calpodes ethlius在这种昆虫变态的倒数第二阶段接近尾声时，脂肪体的线粒体（类似于哺乳动物的肝脏）几乎被自噬所消灭。在成年早期，线粒体种群通过线粒体分裂而恢复。在这一群体迅速发展的短时间内，可以观察到大量线粒体处于分区形成的各个阶段。

就心脏线粒体而言，Tandler和Hoppel（1972）描述了用铜螯合剂铜氮酮处理的小鼠心脏的类似分裂模式，这导致线粒体数量显著增加梅德罗斯和詹宁斯（2002）在小鼠心脏中，分裂的线粒体呈现出一种特殊的嵴排列，在许多情况下，嵴在隔板的一侧呈侧面，在另一侧呈正面。这种正交排列的意义尚不清楚。

上述用铜试剂对小鼠的治疗有额外的效果。肝线粒体变得非常大(铃木，1969年)一些在尺寸上超过了原子核。只要从饮食中去掉铜氮酮，这些巨型线粒体就可以在令人惊讶的短时间内恢复到正常大小（伴随着线粒体数量的增加）(Tandler和Hoppel，1973年)。在恢复早期，扩大的线粒体变成多形性，然后开始通过中间衰减（现在称为收缩的一种形式）分裂。

有趣的是，在减少ariboflavinosis诱导的巨大肝线粒体的过程中，只涉及到分裂形成，而减少cuprizone诱导的肝大线粒体只涉及到挤压。换句话说，细胞器视觉的两种方式从未重叠。相反，在我们的老年大鼠中，这两种类型的线粒体分裂都出现在单个心肌细胞中，尽管分区形成似乎是SSM中唯一的分裂模式，两种方法都发生在IFM中，尽管在该部位主要是挤压。无论存在什么核控制机制(斯卡普拉，1997年)为了调节心脏细胞中线粒体的数量，我们在本研究中了解到的两种裂变方法同时运行。

我们在大鼠心肌中观察到的分裂线粒体与喂食铜的小鼠心肌细胞中的线粒体在一个方面有所不同，即隔膜两侧的嵴彼此不垂直，尽管在分离的分裂线粒体中，两个亚室中的密度可能不同。心肌中线粒体分裂的分区对线粒体分级的严格性具有抵抗力，如图所示图6——8这种孤立细胞器的轻微膨胀，以及基质密度的损失，使隔板和边界膜之间的关系非常清楚。

可以肯定的是，分裂的线粒体可能会在无意中被解释为代表和谐细胞器的融合。上述研究表明，当巨大线粒体的尺寸急剧缩小或线粒体数量激增时，分裂的线粒体大量存在。如果分割代表融合，那么巨大的线粒体将占据巨大的比例，线粒体的数量将严重减少，与实际情况正好相反。

基于我们对线粒体分配的量化尝试，可以得出结论，在任何特定时刻，只有极少数的心肌线粒体通过分区进行分裂，或者这个过程非常快[某些组织培养细胞系的研究表明，线粒体每小时经历5次裂变：融合：分裂事件(Twig等人，2008年)]因此，在薄片中以分裂模式捕获心肌细胞线粒体的机会极为罕见。

我们在大鼠身上的一个一致发现是SR和夹捏过程之间的联系，这一过程被强烈认为是线粒体分裂的关键步骤(Yoon和McNiven，2001年)。SR的主要功能是释放和隔离钙，钙是肌肉收缩的触发因素（由弗兰齐尼·阿姆斯特朗，1999年)。但SR可能具有其他尚未描述的功能(Michalak和Opas，2009年).Volpe等人（1992年）研究表明，肌肉纤维SR中存在粗面内质网（RER）标记物。研究发现，在某些细胞类型中，动力蛋白样蛋白与哺乳动物细胞的线粒体分裂过程密切相关(Smirnova等人，2001年)与内质网相关(Yoon等人，1998年)。SR的RER成分可能合成动力蛋白或动力蛋白样蛋白，并且SR将其导向特定受体(Otera和Mihara，2011年)线粒体外膜上的一种并列结构，可由线粒体融合蛋白2维持(德布里托和斯科拉诺，2008年)。线粒体分裂抑制剂-1治疗小鼠可导致心肌细胞线粒体延长，可能是通过中和Drp1（一种动力相关蛋白）所致(Ong等人，2010年)。正如在酵母中所指出的，Drp1可以在线粒体周围形成一条带，并通过收缩切断细胞器(米尔斯等人，2007年;Detmer和Chan，2007年)。其次，SR可能将钙传导到线粒体外膜上的特定点(披萨和披萨，2007年)导致Drp1的补充，导致细胞器分裂(Breckenridge等人，2003年)。此外，SR可作为新发育线粒体膜成分（蛋白质、磷脂等）的管道(万斯，1990年;Kornmann等人，2009年)，因为表面积与体积的比值决定了即使是典型的纤维间线粒体也会受到挤压（如图3)最终将需要显著增加新的膜来覆盖两个子细胞器。

最近有报道称，ER参与线粒体分裂Friedman等人（2011年）这些作者在处理酵母细胞和培养的Cos细胞（猴肾成纤维细胞）时，发现ER（未确定为类型[粗面或光滑内质网？]）和线粒体之间存在相似性，线粒体显示一定程度的收缩，推测线粒体处于分裂模式。这种收缩相当宽，没有像我们展示的那样清晰的切口；我们的显微照片就地心脏组织中，SR元素被深深插入到几乎横切线粒体的清晰的切口中。EM重建和荧光显微镜Friedman等人（2011年）清楚地表明，内质网带状结构与线粒体收缩密切相关，表明单细胞分裂，并支持我们的论点，即这种关系是至关重要的。尽管有关于这种关系发生频率的信息是很有意思的，但我们在新兴市场层面的研究并不容易提供定量方法。可以这么说了每一个我们观察到的线粒体有任何程度的挤压，SR靠近膜侵入。这种ER-mitochondria关系是如何通过划分形成的方式应用于划分的，还没有得到解决。

虽然人们对线粒体分裂的分子机制了解很多Chan（2006），由Liesa等人（2009年），和依据Lackner和Nunnari（2009年）]在真核生物中，仍有许多蛋白质参与线粒体分裂，其在这一过程中的确切作用仍有待阐明。虽然已经确定细胞核调节线粒体数量（由拉帕波特，2003)，决定线粒体分裂中哪种形态途径被激活的核控制机制尚不清楚，研究人员似乎很少研究。

致谢

脚注

引用的文献