P53 Family Members Modulate the Expression of PRODH, but Not PRODH2, via Intronic p53 Response Elements

Ivan Raimondi; Yari Ciribilli; Paola Monti; Alessandra Bisio; Loredano Pollegioni; Gilberto Fronza; Alberto Inga; Paola Campomenosi

doi:10.1371/journal.pone.0069152

公共科学图书馆一号。2013; 8（7）：e69152。

2013年7月8日在线发布。数字对象标识：10.1371/journal.pone.0069152

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PMID：23861960

P53家族成员调节PRODH公司，但不是项目DH2，通过插入式p53反应元件

伊万·雷蒙迪,¹ 亚里·西里比利,² 保拉·蒙蒂,^三亚历山德拉·比西奥,² 洛雷达诺·波列基奥尼,^1,⁴ 吉尔伯托·弗伦扎,^三阿尔贝托·英加,²和保拉·坎波梅诺西^1,^4,^*

克劳斯·罗默，编辑器

作者信息文章注释版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料: 表S1：本研究中用作引物的寡核苷酸。
（DOCX）
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表S2：通过“delitto perfetto”方法用于创建PRODH和PRODH2酵母报告菌株的寡核苷酸。
（DOCX）
电话：0069152.s002.docx（18千）
指南：0A50D4C6-231A-47DD-B034-4F00BD0FE621
表S3：细胞系分析摘要项目DH2p53在目前和以往研究中的诱导作用。
电话：0069152.s003.docx（18千）
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信息S1：Michael A.Resnick的信件，授权引用未公开的数据作为个人通信。
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摘要

先前研究表明，肿瘤抑制因子p53显著上调PRODH公司编码脯氨酸脱氢酶（PRODH）酶的基因，催化脯氨酸降解的第一步。此外，降解蛋白质（如胶原蛋白）分解代谢产物4-羟基-L-脯氨酸的PRODH2最近被描述为p53靶点。在这里，我们证实了p53依赖性诱导内源性PRODH公司对不同组织学来源的细胞系的遗传毒性损伤作出反应。我们确定TAp73β或TAp63β的过表达足以诱导PRODH公司p53-null细胞的表达PRODH公司在一些细胞系中，表达与基因毒性药物对内源性p73的调节类似。p53、p63和p73依赖性转录激活与特定的内含子反应元件（REs）相关，这些元件由生物信息学工具预测，并通过基于酵母的转录激活分析进行实验验证。p53占用率测量在HCT116和MCF7人类细胞系中得到验证。相反地，项目DH2对p63和p73都没有反应，充其量可以被认为是弱p53靶点。事实上，基因毒性应激对PRODH2转录物的最低诱导水平仅见于四种p53野生型细胞系中的一种。一致地，所有预测的p53 REs项目DH2与p53 RE共识的匹配性较差，在功能检测中仅对p53表现出非常弱的反应性。综合起来，我们的结果强调了PRODH公司，但不是项目DH2，表达受p53家族成员控制，特别是p53和p73。这支持了p53家族蛋白质与代谢途径之间的深层联系，因为PRODH在正常和病理（肿瘤）条件下调节脯氨酸和谷氨酸水平及其衍生物α-酮-谷氨酸（α-KG）的平衡。

介绍

p53蛋白发挥其肿瘤抑制功能，主要作为转录因子，控制大量且不断增加的靶基因的表达，以应对各种应激[1–三]. 众所周知的结果是细胞周期阻滞、DNA修复、凋亡，但最近也描述了p53参与诱导自噬和调节代谢[4,5].

历史上，p53代表p53家族的创始成员，p63和p73也属于该家族。这些蛋白质在DNA结合域中具有最高水平的同源性，并且通常在目标基因的启动子中识别相同的RE。然而，不同家族成员诱导后转录基因的模式并不完全重叠[6]它们的生物功能也不一样，例如它们在胚胎发育中的不同作用[7].

更复杂的是，不同的p53家族成员也可以通过不同亚型的不同反式激活效率以及“p53”RE在各自调控区域的存在所创建的复杂网络相互影响对方的功能和反式激活活动[8,9]. 显然，在p53家族内部以及p53家族和其他转录因子之间存在一个复杂的转录激活网络，以调节靶基因[10,11]. 典型的p53 RE由两个由0-13碱基间隔物（n）分隔的十碳半位组成：RRRCWWGYYY-（n）-RRRRCWWgYYY（R=嘌呤；W=a/T；Y=嘧啶）[12]. 此外，已经鉴定出非经典结合位点，包括半个位点和四分之三个位点，扩大了可能受p53调节的潜在下游靶基因的范围[13].

这强调了理解通过定位和表征靶基因中的RE如何产生反式激活特异性的重要性。基因内的调控区域是一个复杂的研究领域。因此，它们在序列和位置方面的彻底表征可能有助于评估转录因子的协调调节，以及细胞类型和细胞环境（应激类型、动力学）对基因表达的依赖性，最终有助于定义基因功能[11,14].

几年前Polyak和同事发现PIG6接口，也称为PRODH/POX公司，在阿霉素治疗后p53诱导的凋亡基因中[15]. 然而，从未对该基因中的p53 REs进行过系统的搜索和验证。因此，PRODH公司在大多数已发表的评论中，未被视为已证实的p53靶点[1,2]. 自发现以来，越来越多的证据表明脯氨酸脱氢酶（由PRODH公司该基因可能在抑制肿瘤发生中发挥作用，表明其通过ROS诱导作为凋亡效应器发挥作用[16]. 最近，还描述了依赖PRODH的自噬诱导[17]. PRODH的生化功能（EC 1.5.99.8）是将脯氨酸氧化为Δ'-吡咯烷-5-羧酸（P5C），P5C脱氢酶将其转化为谷氨酸（EC 1.5.1.12）。值得注意的是，编码P5C脱氢酶的基因，ALDH4型，据报道是p53的靶点[18]这表明脯氨酸到谷氨酸的转化在调节p53功能中的重要性。

最近，一些作者发现4-羟基-L-脯氨酸（OH-脯氨酸）脱氢酶（EC 1.1.1.104）也由项目DH2基因，由p53诱导[19]然而，这一结果并没有得到其他人的确认[20]. 与脯氨酸一样，OH-脯氨酸是OH-脯蛋白脱氢酶的底物，存在于一些细胞、细胞外和饮食蛋白质中，是底物的丰富来源。虽然脯氨酸的下游代谢产物可以影响细胞代谢的几个方面，但OH-脯氨酸衍生物化合物可以用来产生ATP或ROS，但不具有再生或调节功能[19].

本研究的目的是鉴定和验证在PRODH公司和项目DH2并研究其对其他p53家族成员的反应性。这里我们显示了四个内含子p53 REs，位于PRODH公司基因是被检测的RE中最活跃的。有趣的是，其中一个基因被所有p53家族成员有效地激活。相反项目DH2酵母功能检测显示，即使在p53水平较高的情况下，基因反应也很差，对p63和p73不起作用。此外，项目DH2仅在我们测试的一个p53野生型细胞系中，在基因毒性应激后，表达微弱，这与文献中的异质性结果一致[19,20].

材料和方法

试剂

阿霉素（DOXO）和5-氟尿嘧啶（5FU）来自Sigma Aldrich（意大利米兰）；Nutlin-3A购自Alexis生化公司（Enzo Life Sciences，Exeter，UK）。所有寡核苷酸均来自Eurofins MWG Operon公司（德国埃伯斯堡）。细菌试剂（Bactoagar、酵母提取物、蛋白胨）来自DIFCO（BD Biosciences，Milan，Italy），所有其他试剂来自Sigma Aldrich（Milan，意大利）。

细胞系和治疗

人乳腺癌衍生的MCF7和MDA-MB-231细胞系从InterLab细胞系收集库ICLC（意大利热那亚）获得；结肠腺癌HCT116（p53^+/+)细胞系及其p53^−/−衍生产品是B.Vogelstein（美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯金梅尔癌症中心）赠送的礼物[21]. LoVo结肠腺癌细胞是M.Broggini（意大利米兰Mario Negri国际农科院）赠送的礼物[22]; 横纹肌肉瘤细胞系由A.Rosolen博士（意大利帕多瓦大学肿瘤儿科诊所）捐赠[23]; 肝癌衍生的Mahlavu和HepG2细胞系是M.L.Neri博士（意大利费拉拉大学）慷慨捐赠的[24]和A.Provenzani（意大利特伦托大学）[25]分别是。最后，从约翰·霍普金斯大学（美国马里兰州巴尔的摩）Sidransky实验室获得HaCat永生化角质形成细胞、JHU-011和JHU-029头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系[26–28]. 细胞保存在补充有10%FCS、1%谷氨酰胺和抗生素（100单位/ml青霉素加100µg/ml链霉素）的DMEM或RPMI中，并定期检查以排除支原体的存在。

学习PRODH公司为了响应内源性p53诱导或稳定，或内源性p63和p73调节，将细胞接种在80%的汇合处，并用指定浓度的基因毒剂或Nutlin-3A处理16小时。用于HCT116 p53的瞬时转染实验^-/-，7 x 10⁵转染前24小时将细胞接种在6孔板中，在转染当天达到约70%的融合率。根据制造商的说明，使用2µg质粒DNA/well和TransIT-LT1转染试剂（Mirus，Milan，Italy）转染细胞。人p53由pC53-SN3质粒表达[29]p63β和p73βcDNA从pCDNA3.1中表达[11]. 在每次转染中，使用无插入物的pCDNA3.1载体（空载体）作为阴性对照。所有哺乳动物构造均从XL1蓝色中提取大肠杆菌根据制造商的方案，使用无内毒素PureYield质粒midi-prep试剂盒的细胞（意大利米兰Promega）。在所有实验中，转染24小时后采集细胞，进行胰蛋白酶处理并收集用于提取RNA。

抗体和免疫印迹

通过在含有5mM Na的PBS中从100mm平板上机械刮取细胞来获得可溶性蛋白质提取物₂EDTA，然后在添加蛋白酶抑制剂（PMSF、苯甲脒、抑肽酶和亮氨酸蛋白酶）的RIPA缓冲液中进行细胞计数和再悬浮。在4°C下旋转和离心培养1小时以去除不溶性部分后，使用Bradford试剂评估蛋白质的浓度，并使用牛血清白蛋白获得标准曲线。根据要进行免疫检测的蛋白质，使用20至150µg提取物进行SDS–PAGE。免疫印迹分析使用i-Blot半干系统和硝化纤维素膜（InVitrogen，Life Technologies，Milan，Italy）进行，并使用ECL Select化学发光底物（GE Health Care，Milan）进行检测。必要时，用标准方法剥离印迹，并用所示抗体进行再验证。小鼠单克隆DO-1抗p53抗体（sc-126）和4A4抗p63抗体（sc-8431）来自Santa Cruz Biotechnology（Heidelberg，Germany），而小鼠单克隆ER-15抗p73抗体（OP 109）来自Calbiochem-Millipore。使用来自Sigma（意大利米兰）的兔抗β-肌动蛋白（A2066）或来自Santa Cruz的3F3-G2小鼠单克隆抗β-微管蛋白（sc-53140）进行标准化。

分析PRODH公司和项目DH2转录水平

量化PRODH公司和项目DH2mRNA在处理或转染后，收集细胞并用PBS清洗一次。根据制造商的说明，使用RNeasy Kit（意大利米兰齐根）提取总RNA。对于实时定量PCR（qPCR），通过使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒（意大利米兰弗尔门塔斯）或iScript逆转录Supermix For qPCR（意大利米兰Biorad）从2µg RNA生成cDNA。qPCR使用KAPA Probe Fast Universal 2X qPCR Master Mix在RotorGene 3000热循环器（意大利安科纳科贝特生命科学公司）或StepOne热循环器上进行( Resnova公司 意大利罗马）和Taqman分析（意大利米兰AB）或Sso Advanced Sybr Green Supermix（意大利米兰Biorad）。引物报告于表S1使用ΔΔCt方法获得相对mRNA定量，其中甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH公司)或β2-微球蛋白（B2-M）基因作为内部控制。P21基因,诺克斯,彪马或COL18A1系列通过特异性治疗或转染对p53家族成员的调节作用作为对照。

酵母报告菌株和培养基的构建

九种不同酿酒酵母在生物信息学工具（见下文）发现的p53 RE的控制下，构建了报告菌株，其中包含萤火虫荧光素酶基因PRODH公司和项目DH2基因。为了在荧光素酶报告基因上游插入假定的p53 RE，采用“delitto perfetto”方法体内使用了诱变[30]，从可用的主报告菌株yLFM-ICORE开始。主菌株包含整合在酵母基因组下游的荧光素酶cDNA，该启动子来自CYC1（日历年1）基因。反选择ICORE盒位于最小启动子的5'处，通过含有所需RE序列的寡核苷酸（两侧有适当的同源区域）赋予位点高靶向效率(表S2) [30]. 通过菌落PCR和直接测序检查重组酵母菌株，以正确定位插入的RE（BMR Genomics，Padua，意大利）。

酵母细胞在YPDA培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖和添加200 mg/L腺嘌呤）中生长。为了进行平板培养，在YPDA培养基中添加2%的杆菌胶，同时使用缺乏色氨酸或亮氨酸但含有腺嘌呤（200 mg/L）和葡萄糖作为碳源的选择性最小平板来分离带有p53家族蛋白表达载体的转化克隆。必要时向平板中添加5-氟代甲酸（FOA）和基因素（G418）[30].

构建p53家族成员在酿酒酵母

为了在酵母中表达p53家族成员，pTSG-(TRP1号机组)或pLSG-(LEU2级)基于构建物，分别含有p73β和p63βcDNA（TA亚型）镀锌1,10诱导型启动子[13,31]. 该启动子可以通过改变培养基中半乳糖的浓度来调节研究中蛋白质的表达。野生型p53 cDNA也可以使用pLS89表达载体进行类似表达(TRP1号机组) [31]. 空白载体pRS-314或pRS-315用作对照；这些向量分别包含TRP1号机组（如pTSG-）或LEU2级（pLSG-）酵母选择性标记。

酵母中的荧光素酶分析

为了测量p53家族成员对推测的p53 REs的反式激活能力PRODH公司和项目DH2基因，上述表达载体通过醋酸锂法转化为yLFM-RE菌株。转化后，酵母菌株生长在缺乏色氨酸或亮氨酸但含有腺嘌呤（200 mg/L）和葡萄糖作为碳源的最小培养基上，以保持抑制p53家族成员的表达。在30°C下培养2-3天后，将转化体划线到相同类型的培养板上，并再培养一天。对于每个报告菌株，从空载体pRS314-或pRS315-transformed菌落中测量基础荧光素酶活性。作为阳性对照，携带来自第21页使用基因（p21-5’：GAACATGTCC-CACATGTTG）。之前已经描述过这种菌株[32].

转化菌落在100µL的选择性培养基中生长，该选择性培养基以棉籽糖为唯一碳源，在30°C的透明96-well板中培养16-24小时。使用不同浓度的半乳糖（0.008%和1%）来诱导p53家族成员的低水平或高水平表达。外径₆₀₀使用多标签板阅读器（意大利米兰帝肯Infinite M200-Pro）在多孔板中直接测量以归一化细胞密度。将10µL细胞悬浮液转移到白色384平板（BrandTech Scientific Inc.，Essex，CT，USA）中，并与等体积的PLB缓冲液2X（Passive Lysis buffer，Promega）混合。在室温下摇晃15分钟后萤火虫添加荧光素酶底物（Bright-Glo-luciferase Reporter Assay，Promega）。测定荧光素酶活性，并将结果表示为与空载体相比的诱导倍数。

HCT116和MCF7细胞系染色质免疫沉淀实验

如前所述进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析[33]，使用EZ Magna ChIP工具包（Upstate Biotechnology，Millipore，Lake Placid，NY，USA）。简言之，MCF7或HCT116 p53^+/+和p53^-/-细胞被镀到150毫米的培养皿上，让其生长一天，然后用1.5µM阿霉素处理16小时或不处理。然后用1%甲醛在37°C下交联细胞10分钟，然后用125 mM甘氨酸处理5分钟。样品按照制造商的说明进行处理。然后使用条件对细胞裂解液进行超声处理，使我们能够评估不同RE的不同贡献。使用配备多片式喇叭的Misonix 4000仪器进行超声处理（Misonix，Qsonica LLC，Newtown，CT，USA）。使用12个周期的20秒脉冲以80%的振幅对样品进行超声处理，其间停顿40秒，并在2%琼脂糖凝胶上检查剪切染色质片段的准确性。ChIP分析中使用了p53特异性单克隆抗体DO-1（意大利米兰圣克鲁斯生物技术公司）和磁性蛋白G珠。在MCF7中，使用小鼠IgG（Santa Cruz Biotechnology）作为背景，而HCT116 p53中的DO-1结合^-/-细胞系被认为是HCT116 p53基因占据的背景^+/+细胞。一旦恢复交联，使用引物对免疫沉淀和纯化的染色质进行PCR扩增，以扩增PRODH公司启动子和内含子，位于CCNB1公司基因，不包含任何p53 RE（无结合位点，NBS：阴性对照）P21基因基因（阳性对照）（见表S1本研究中使用的寡核苷酸引物列表）。此外，qPCR用于量化与未经处理的样品相比，DOXO处理后的现场占用率的变化。按照制造商的程序，使用2µL的每个样品和Power SYBR®Green PCR Master Mix（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）进行qPCR反应。结果显示为输入DNA的百分比。

生物信息学分析

人类的序列PRODH公司和项目DH2从NCBI中检索到参考mRNA（分别为NM_016335.4和NM_021232.1）(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucotide网站)，通过UCSC Blat算法获得基因组组织http://genome.ucsc.edu/然后使用UCSC的功能“基因分拣器”检索启动子区域的延伸。

要在中搜索p53 REPRODH公司和项目DH2基因，参考了以下位点：

•TESS公司(http://www.cbil.upenn.edu/tesss网站.);
•p53MH算法(http://linkage.rockefeller.edu/ot/p53MH.htm.) [34];
•p53家族TaG(http://p53famtag.ba.itb.cnr.it/index.php.) [35];
•TFBIND公司(http://tfbind.hgc.jp/) [36].

结果

1:基因毒性应激或p53稳定后PRODH水平增加

为了确认这一点PRODH公司通过p53可由基因毒性应激诱导，我们用DOXO或5-FU处理不同来源（结肠、乳腺、肝脏）的细胞系，已知这些细胞系含有野生型p53。PRODH公司DOXO或5-FU很容易诱导除HCT116 p53外的所有受试细胞株的转录^-/-细胞，证实诱导确实依赖于p53(图1）DOXO的诱导作用在HepG2细胞系中尤为明显。PRODH公司HCT116 p53的表达也呈剂量依赖性增加^+/+用p53稳定剂Nutlin-3A处理细胞(图1）.

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图1

基因毒性应激和p53稳定导致p53依赖性增加PRODH公司转录水平。

HCT116 p53型^+/+，HCT116 p53^-/-，MCF7、HepG2和LoVo细胞系用基因毒性化合物阿霉素（DOXO，0.5，1或未指示的1.5µM）、5-氟尿嘧啶（5FU，375µM）或p53稳定剂Nutlin-3A（Nutlin，5或10µM）处理16小时，然后进行总RNA提取、cDNA制备和实时q-PCR。已建立的p53靶基因P21基因显示用于比较（较亮的条）。条形图表示处理后获得的诱导平均次数与未经处理的细胞样本与三个生物复制品的标准偏差一起绘制。在未经处理的细胞系中获得的值设置为1，并在图中显示为水平折线。

作为PRODH公司诱导发生在由于基因毒性应激或p53稳定剂治疗导致的p53水平升高时，我们认为这确实是p53依赖性的。

2:PRODH公司该基因包含许多假定的p53 REs

将四种生物信息学工具（p53MH、p53FamTag、Tess、TFBIND）与人工搜索相结合，用于识别p53特异性或一般性转录因子结合位点，以扫描PRODH公司基因。根据参考序列NM_016335.4，根据与转录起始位点（TSS）的距离，鉴定并命名了9个推测的p53 RE(表1）.

表1

p53中的响应元素PRODH公司基因。

	姓名	位置（来自TSS的bp）	HS 1不匹配	HS 2不匹配	垫片（bp）	顺序
1	-3.1	发起人，-3158	1	2	5	c（c）克A类C类T型T型克T型C类C类 TCAAT公司克A类c（c）C类A类c（c）克C类T型C类
2	-0.9	发起人，-917	-	1英寸¼站点，3英寸HS	7, 5	中国民航局 AGgCT公司CCACTAT公司GGGCTTGTCT公司TCGTG公司tGACTTcTgT公司 *
三	+1.7	国际号码2，+1694	2	1	-	*GGGCAAGgaCGGGCATGCTa*
4	+2.8	积分2，+2816	5个HS中的每个HS为2、2、2和3		分别为3,0,0,3个基点	ttACAAGCCC公司标签GctCATGCCTAGGCATGgTgGctCATGCCT通用技术协议附件TAGCaC °
5	+4.7	积分2，+4727	三	-	三	克t吨c（c）C类T型T型克T型T型克 CCA公司克克克C类A类T型克C类C类T型
6	+6.4	国际3，+6453	1	2	8	GGtCTTGCTC公司TGTTGCCC公司AGGCTAGagT公司
7	+6.8	国际3，+6817	-	2	-	*AGGCTTGCCTcAGCATGTCg*
8	+14.3	国际8，+14269	2	1	2	AGcCATGgTT公司科科斯群岛AGcCAAGCCC公司
9	+15.8	国际9，+15832	-¼站点	1	5	TGTTT公司GTTAG公司AAGCATGTCa公司

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HS：半站点

^*[38]中描述的相同RE。

°由5个半位点形成的簇：3个中心半位点包含一个CATG核心，并由0bp间隔区分隔，而两个外半位点由中心3个半位点由3bp间隔区分隔。所有5个半衰期位点都包含至少2个错配，尽管它们从未涉及共识的核心。

粗体名称：选择RE进行实验验证

粗体/下划线：属于所示RE的底座；斜体：垫片；微小：RE中的不匹配

根据以下参数的评估，选择了六个RE进行验证：与共识相关的不匹配的数量和位置，两个十倍体位点之间存在间隔序列，以及基因中的位置(表1）三个假定的RE被排除在进一步的分析之外：+6.4，这两个十聚体中都有一个8 bp的间隔区和不匹配，在这两种情况下都涉及核心基序附近的一个碱基+14.3，它有一个2 bp的间隔物，并且在两个十倍体中，同样在靠近核心的位置不匹配；+15.8，由一个四分之三的位点组成，其中四分之一位点与半位点之间用一个5 bp的间隔物隔开。因为我们之前观察到，不匹配和间隔棒长度的存在显著降低了RE的功能性[37]考虑到与TSS的距离，这些RE没有进一步调查。在所选的RE中，有两个位于PRODH公司基因，位于TSS的-3.1和-0.9 kb位置；后者已经被描述过了[38]并进行了调查，尽管它没有完全满足所选参数。其他RE分别位于内含子2（+1.7、+2.8和+4.7 kb）和3（+6.8 kb）。后一个RE为+6.8，属于之前在ChIP测序实验中确定的基因组区域，但没有进一步描述[39]. 在那篇论文中，尽管根据最近的基因组组装和PRODH公司本研究中使用的mRNA版本NM_016335.4位于内含子3中。

启动子中的两个RE只包含一个半位点，有一个（-3.1）或没有（-0.9）错配(图2A）。-3.1 RE中存在另一个具有两个错配的半位点，其中一个涉及CWWG核心序列中的一个碱基，通过5 bp间隔物与第一个半位点分离；在-0.9 RE中，存在一个四分之一位点有一个失配和一个半位点有三个失配（也可以将其视为四分之一位有一个错配），分别由第一个半位点用7和5 bp间隔物隔开(图2A）在内含子RE中，两个（+1.7和+6.8）没有间隔，而+4.7有一个3 bp的间隔；+4.7和+6.8 RE有一个一致的半位点和第二个半位点，在CWWG核心基序之外有两个不匹配，而+1.7在每个半位点有一个或两个不匹配对(图2A）TFbind软件将+2.8 RE鉴定为由两个半位点（GctCATGCCT-AGGCATGgTg）组成的完整位点。仔细分析附近的序列后，发现该RE被其他半位点包围，从而构成了一个共有5个半位点的簇，其中3个中央含有CATG核心，没有bp间隔物，而两个外部半位点通过3 bp间隔物与中央3个RE分离(图2A）+2.8 RE中的5个半位点中的每一个都包含至少2个错配，没有涉及共识的CWWG核心基序。有趣的是，+6.8是p53SCAN算法在包含PRODH公司基因[40].

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图2

这个PRODH公司该基因包含几个假定的p53 RE，其中一些被酵母中的p53家族成员差异反式激活。

A类.描述六个p53 REs的染色体位置和序列的方案PRODH公司选择用于进一步分析的基因。图中显示了不同位置的RE序列（小写=与共识不匹配；斜体=半衰期间隔）B。中的REPRODH公司在酵母反式激活试验中，用不同的p53家族成员（p53、p63β和p73β）在不同的半乳糖诱导水平（0.008%，亮条和1%，暗条）下检测基因。作为阳性对照，携带p53 RE之一的酵母菌株存在于P21基因包括P21-5'基因。横线表示通过指定的p53家族表达构建在每个RE上获得的诱导倍数，该倍数超过了使用相对空向量（阴性对照）（设置为1，并用每个图形上的虚线表示）作为阴性对照获得的值。所示实验来自至少三个生物复制。

3:p53家族成员与PRODH公司酵母中的REs

六种酵母报告菌株，对应于PRODH公司基因（-3.1；-0.9；+1.7；+2.8；+4.7；+6.8，图2A），使用“delitto perfetto”方法构建[30,41]. 然后应用一种成熟的酵母反式激活试验分析荧光素酶报告基因对p53、p63β或p73β蛋白表达的诱导作用。以一株携带P21-5'RE的等基因酵母菌株作为阳性对照[32]. 结果显示为作为阴性对照的空载体的平均诱导倍数。使用半乳糖诱导启动子调节p53家族成员的表达镀锌1,10利用两种不同的半乳糖浓度诱导不同水平的转录因子。p53以剂量依赖性的方式诱导了四个内含子RE（+1.7、+2.8、+4.7和+6.8），并且在较高的诱导水平（1%半乳糖）下表现出强烈的反应(图2B）在中等诱导（0.008%半乳糖）下，+2.8、+4.7和+6.8已经显示出荧光素酶活性比背景增加至少35倍。总的来说，内含子RE的p53依赖性诱导水平与阳性对照菌株（携带P21-5’RE）的诱导水平相当，此前已证明该菌株由酵母中的p53家族成员强烈诱导[32]. 相反，启动子中的REs（-3.1和-0.9）在基础水平上没有（-3.1）或极弱（2.5倍，-0.9）的诱导作用，即使在1%半乳糖的情况下，也表明对p53缺乏反应性(图2B）此外，其他p53家族成员也能弱地反式某些RE的私有荧光素酶报告基因表达，但仅在1%半乳糖下。更具体地说，p63β表达后+1.7、+2.8的反式激活非常弱，而p73β表达后+6.8的RE反式激活（5到10倍）(图2B）在低半乳糖诱导p63β和p73β时，在任何PRODH公司可再生能源(图2B）.

4:p73事务处理PRODH公司在哺乳动物细胞中

确定p63和p73是否能够驱动内源性PRODH公司哺乳动物细胞中p53、p63β、p73β表达结构的基因瞬时转染到HCT116 p53中^-/-细胞。用空载体转染的细胞代表阴性对照，其值被任意设置为1，以计算用p53家族成员表达结构获得的诱导倍数。p63β和p73β表达细胞对PRODH的诱导作用为3倍，而p53表达细胞则为7倍(图3A）因此，p53家族的所有成员都有可能将内源性PRODH公司哺乳动物细胞中的基因。确定是否PRODH公司是我们研究的整个p53家族的生理目标PRODH公司在p53突变或无效但表达内源性p63或p73的细胞系中，由遗传毒性应激诱导的调节引起的表达。选择两种细胞株MDA-MB-231和Rh30来研究p73对PRODH公司表达式。MDA-MB-231是一种乳腺癌衍生细胞系，表达p53 p.R280K突变。根据生理性p53靶点的表达和重建系统的功能测定，这种突变被认为是功能丧失(网址：http://p53.fr/) [42]. 据报道，这些细胞表达TAp73β，但不表达p63[43]. DOXO治疗导致PRODH公司基因水平与P21基因和NOXA公司，用作阳性对照(图3B）。横纹肌肉瘤衍生的Rh30细胞系也用于研究PRODH公司表达式。该细胞系表达p53 p.R280S突变，也被描述为功能丧失等位基因(网址：http://p53.fr/). 据报道，这些细胞表达TAp73β[43].PRODH公司DOXO处理诱导的表达水平甚至高于NOXA公司(图3B）。我们无法看到P21基因在这个细胞系的测试条件下。

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图3

至少有两个p53家族成员控制PRODH公司在哺乳动物细胞中。

A类.分析PRODH公司异位表达p53家族成员p53、p63β、p73β后的转录水平。p53、p63β、p73β表达构建物转染HCT116 p53^-/-单元格和PRODH公司用qPCR检测转录诱导，并与空载体进行比较，作为参考，用虚线表示。B类–D类.分析PRODH公司通过qPCR在使用DOXO处理的指示细胞系中表达，并与未处理的对照组进行比较。显示了用于归一化的相关蛋白质和β-肌动蛋白或β-微管蛋白的蛋白质印迹。与对照组相比，考虑到β-肌动蛋白或β-微管蛋白的正常化后，DOXO处理样品中相关蛋白的变化在western blots上报告；对于面板D，两种TAp63亚型均进行了量化，箭头表示TAp63α亚型及其量化。B类Rh30和MDA-MB-231细胞系，表达突变型p53和TAp73β；C类具有突变（HaCat）或缺失（JHU-029，JHU-011）p53和ΔNp63α表达的细胞系（HaCat，JHU-029，JHU-011）；D类表达突变型p53和TAp63亚型的Mahlavu肝癌细胞系。所显示的所有实验都代表了至少三个生物重复。

另外三种细胞系被用来探索PRODH公司内源性p63的反应性：来源于永生化角质形成细胞的HaCat细胞，以及来源于头颈部鳞状细胞癌的两种细胞系，即JHU-029和JHU-011。HaCat是两个p53突变的复合杂合子[H179Y和R282W，前者保留残余反式激活功能，而后者是功能丧失等位基因(网址：http://p53.fr/)]. 这些细胞大量表达ΔNp63α。根据western blot分析，JHU-029和JHU-011细胞分别含有移码和无义p53等位基因，不表达p53蛋白(图3C）两种细胞株均表达ΔNp63α；JHU-029也表达p73。虽然ΔNp63α不是最具反式激活活性的p63亚型，但它通常在成人组织和肿瘤中表达，特别是在鳞状上皮细胞中，鳞状上皮对特定靶基因的调节至关重要[44]. 在所有三种细胞系中，观察到DOXO处理后p63蛋白水平降低。mRNA表达分析没有发现PRODH公司HaCat细胞中的基因表达。已报道的ΔNp63α靶基因COL18A1系列[45]相反，被抑制，与ΔNp63α蛋白水平的降低一致。P21基因似乎受到轻微诱导，这可能与ΔNp63α介导的阻遏减少有关[46]DOXO治疗后p63蛋白水平下降。PRODH公司在JHU-029和JHU-011细胞系中受到不同的调节：在JHU 029中轻度诱导，但在JHU 011中受到抑制，这与p63蛋白的减少一致(图3C）.确认以前的报告[28],P21基因在JHU-029和JHU-011中均可诱导，这可能是p73依赖性的。COL18A1系列相反，在两种细胞系中都受到抑制，与p63蛋白水平的降低平行。总之，我们的结果支持p73介导的PRODH公司而用表达ΔNp63α的细胞系获得的数据则不那么确切和独特。

最后，PRODH公司分析DOXO治疗后Mahlavu肝癌细胞系的表达。Mahlavu细胞表达p53 p.R249S突变，根据重建系统中的功能分析，该突变保持极低的残留活性(网址：http://p53.fr/). 据报道，这些细胞组成性表达TAp63α。重要的是，用DNA损伤剂治疗后，所有TAp63亚型均被诱导，尽管只有有限数量的靶点随后被激活，优先导致G2/M期阻滞[47]. 在我们的实验中，基于western blotting，TAp63α和TAp63β均在Mahlavu细胞中表达，且两者仅受DOXO轻微诱导(图3D）.同时P21基因如前所述，该细胞系在DOXO后被诱导[47]，也是NOXA公司，我们无法看到任何诱导PRODH公司或彪马(图3D）这种差异目标表达可能是由于该细胞系中表达的特异性p53突变体的残余选择性活性，也可能是细胞类型或细胞系特异性的。在对内源性p63介导的细胞株得出任何明确结论之前，应该测试更多表达TAp63的细胞株，这些细胞株可能来源于其他细胞类型PRODH公司交易激励。

5.+6.8 RE显示最高的p53结合体内

研究p53与PRODH公司基因体内，HCT116 p53^+/+细胞系及其p53敲除衍生物（HCT116 p53^-/-)，用DOXO处理或不处理（模拟），细胞提取物进行ChIP分析。

数据表明，+2.8和+6.8 REs是HCT116 p53中与p53结合最有效的序列^+/+在DOXO治疗后，与模拟条件下的p53免疫沉淀物质和DOXO处理的HCT116 p53相比，分别表现出2倍或更高的富集度^-/-单元格(图4A）为了确定DOXO治疗后每个RE处p53富集的特异性，我们还应用了一个截止值，选择不含p53 RE的基因组区域p53结合的最高值（β-actin和CCNB1公司基因，表示为无结合位点，NBS）(图4A）鉴于NBS位点结合p53的水平较高，尽管DOXO后结合p53富集，但与同一位点的其他条件相比，+1.7和+4.7 REs不能被视为阳性(图4A）.

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图4

相对p53占用水平PRODH公司含有p53 REs的位点。

ChIP-qPCR实验在以下位置进行：A类.HCT116 p53型^+/+细胞系及其同源衍生物HCT116 p53^-/-（阴性对照），用DOXO治疗或不治疗。虚线表示HCT116 p53中DOXO治疗后与非结合位点（NBS）结合的p53水平^+/+细胞；B类MCF7细胞系，用DOXO处理或不处理。作为特异性抗体结合的对照，还进行了IgG免疫沉淀。虚线表示输入物中IgG免疫沉淀物质的富集，代表NBS阴性对照获得的最高值。图中显示了p53与REs周围基因组区域的结合PRODH公司基因，以及与不包含p53 RE（NBS）的基因组区域的结合，用作阴性对照，以及与包含第21-5页'RE（阳性对照）。所示数据代表两个独立实验，所得值表示为输入百分比。

验证p53是否绑定到PRODH公司调控元件是对DNA损伤的一般生理反应，我们在表达野生型p53的乳腺癌细胞MCF7中重复了ChIP实验。为了控制p53结合的特异性，使用了IgG，并比较了DO-1或IgG在应激（DOXO）或模拟条件下与特定REs或NBS的结合。与相同条件下的IgG免疫沉淀对照组和模拟条件下的DO-1免疫沉淀相比，DOXO治疗后，PRODH-3.1、+2.8、+4.7（尽管对照条件下的背景也很高）、+6.8和-0.9 REs在p53免疫沉淀物质中富集。p53与PRODH公司当应用基于IgG与NBS结合的截止值时，也证实了RE。

总之，我们的结果表明HCT116 p53中有两个（+2.8和+6.8^+/+)或更多（在MCF7中为-3.1、-0.9、+2.8、+4.7、+6.8）在PRODH公司基因确实是绑定的体内通过p53和这种结合在DNA损伤时增加。

6:p53，但不是p63和p73，来自项目DH2酵母中的REs

在项目DH2基因，其中三个位于启动子中，而两个位于内含子9中，距离TSS超过10 kb（NM_021232.1参考中的第一个核苷酸项目DH2mRNA）(表2）后两个RE仅包含一个半位点(表2）; 由于这个原因以及与TSS的距离，他们被排除在进一步的分析之外。在启动子中确定的三个RE中(表2和图5A），其中两个有一个3bp的间隔区，两个半位点中至少有四个不匹配，不涉及核心序列（-1.3和-0.5），第三个（-0.27）有一个6bp的间隔期，两个半点中有一个或两个不匹配(表2和图5A）.

表2

p53中的响应元素项目DH2基因。

	姓名	位置（来自TSS的bp）	HS 1不匹配	HS 2不匹配	垫片（bp）	顺序
1	-1.3	发起人，-1281	2	2	三	c（c）A类克C类A类T型克T型T型克 GGA公司克克A类C类A类A类克T型一克
2	-0.5	发起人，-0534	2	三	三	A类c（c）t吨C类T型A类克C类C类T型 GGG公司 c（c）A类A类C类A类A类克一克T型
三	-0.27	发起人，-0267	1	2	6	克t吨A类C类A类T型克T型T型T型 CCTGCT公司克t吨c（c）C类A类T型克T型T型T型
4	+10.5	内含子9，+10519	2	不适用	不适用	cAGCAAGCC公司
	5	+10.7	内含子9，+10685	不适用	不适用	*AAGCAAGTCC公司*

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HS：半衰期

粗体：选择RE进行实验验证

粗体/下划线：作为所示RE一部分的底座；斜体：间隔符；微小：RE中的不匹配

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图5

这个项目DH2该基因包含三个假定的p53 RE，其中两个仅在酵母中被p53激活。

A类.描述p53 REs的染色体位置和序列的方案项目DH2基因，选择用于酵母反式激活分析。B类.中的RE项目DH2在酵母反式激活试验中，用不同的p53家族成员（p53、p63β和p73β）在不同的半乳糖诱导水平（0.008%，亮条和1%，暗条）下检测基因。作为阳性对照，携带第21-5页‘RE包括在内。横线表示指定的p53家族表达结构对每个RE的诱导倍数，该倍数大于用相对空向量（阴性对照）获得的值（设置为1，并用每个图形上的虚线表示）。所有实验都来自至少三个生物复制。

在染色体定位荧光素酶报告子上游携带-1.3、-0.5和-0.27 REs的酵母菌株，或者与前面描述的相同基因PRODH公司构建了RE菌株。同样，一个携带第21-5页‘RE作为阳性对照。在三种PRODH2菌株中，p53的高水平表达仅略微增加了报告者的活性，其中-0.27是最有效的反式激活（9倍诱导）(图5B）使用-1.3 RE时，荧光素酶活性比空白载体（用作阴性对照）增加了4倍，但使用-0.5 RE时，仅增加了2倍。p63和p73的表达并未导致荧光素酶活性的任何可检测诱导(图5B）综合来看，结果表明项目DH2基因对p53和p63或p73无反应。

7:p53弱反式激活项目DH2哺乳动物细胞中的基因

验证是否项目DH2通过p53可被基因毒性应激诱导，我们用DOXO或5-FU处理了已知含有野生型p53的不同细胞系，如前所述，用于诱导PRODH公司与文献一致，这些基因毒性治疗导致项目DH2LoVo细胞中的转录物，但我们无法计算折叠诱导，因为基础水平低于我们qPCR的检测限(图6A）在HCT116 p53中^+/+和MCF7细胞系，未检测到基础水平，也未观察到诱导(图6A）最后，当发现HepG2肝癌细胞系具有可检测的基础水平项目DH2，用DOXO治疗，未诱导项目DH2观察到基因(图6B）同时，尽管有效地诱导了P21基因转录本，用作阳性对照。

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图6

p53弱诱导项目DH2在一些细胞系中表达。

A类.DOXO诱导项目DH2在四个含有内源性野生型p53的细胞系中分析了该基因，即HCT116（p53^+/+)、MCF7、LoVo和HepG2。B类.级别项目DH2（暗条）和P21基因用qPCR检测DOXO处理的HepG2细胞中的（较轻条，阳性对照）转录物。在未经处理的细胞系中获得的值被标准化为1（折线）。所有实验均一式三份。

综合起来，并与通过PRODH公司,项目DH2应被视为人类细胞中表达水平低、p53反应性有限的弱p53靶点。

讨论

在目前的研究中，在PRODH公司和项目DH2描述了基因及其功能的实验分析。事实上，这些基因以前被描述为p53靶点[15,19,38]，尽管未对RE进行描述。它们编码参与细胞中类似但不相同的代谢过程的蛋白质。事实上，它们的催化活性直接作用于非常相似的共同来源底物（膳食蛋白质或胶原蛋白降解），相互之间的交叉反应性有限[48]. 此外，这两种蛋白都能通过活性氧的产生诱导细胞凋亡[16,19].

尽管PRODH作为p53促凋亡效应器已被长期知晓[15]，关于调节相应基因p53反应性的调控元件的信息非常有限。这可以解释为什么PRODH公司不包括在129个基因列表中，这些基因对四个标准中的至少三个标准都有反应，即p53 RE的存在、野生型p53上调、功能检测中鉴定的RE的反应性以及p53对RE的物理结合，都被归类为p53调节基因[2,49].

这里，我们扩展了PRODH公司对p53的反应超过了基因毒性诱导，表明在Nutlin-3A治疗后，p53稳定也能强烈诱导p53反应(图1）我们还通过酵母反式激活试验表明，p53对所有内含子RE都具有反式激活潜能，这些内含子RE在PRODH公司基因(图2B）与启动子中的RE相比，内含子RE至少有两个完整的半位点，核心序列中没有错配(表1）最终，p53依赖的交易激活程度PRODH公司基因可能是由于每个功能RE的贡献之和。此外，根据p53水平，人们可能期望根据其亲和力将p53滴定到RE中，从而产生不同水平的PRODH公司诱导，可能影响其活性[17,50,51]. 最后，我们发现一些已鉴定的RE直接与p53结合体内.

在本研究之前，文献中唯一可用的数据报告了推测的p53结合位点PRODH公司弱p53依赖性反式激活与p53结合相关的启动子[38]. 在p53缺失的细胞系中，观察到的基于异位p53过表达的反式激活非常低，在最初的48小时内不到2倍，转染后72小时仅达到3.5倍[38]. 考虑到TSS的当前基因组注释和位置，该结合位点以前位于-1.161 bp，对应于-0.9kb RE（当前工作），在两个细胞系的反式激活分析中显示为不活跃，在ChIP分析中与p53结合不良。推定的RE含有一个具有刚性、低亲和力CTTG核心基序的共有半位点[52,53]和一个额外的半位点，由一个5 bp的间隔物隔开，该间隔物在关键位置也包含两个不匹配。基于之前关于顺式-p53诱导的反式激活的元素需求，我们可以预测这个RE表现为一个具有极低反式激活潜力的单一半位点[37,54]. Maxwell和Kochevar观察到的极低放射性[38]确实与报告的单个p53半位点的反应性相一致[37,55]. 在我们使用的基于酵母的检测中，异位p53表达由一个诱导启动子控制，在不同表达水平下获得的结果强烈表明，推测的RE在PRODH公司启动子区域充其量功能很弱（参见图2面板A）。总之，PRODH公司p53的调节似乎主要是由于我们发现的其他REs(图2B和图4）在这些基因中，+6.8是p53家族所有成员最有效的反式激活RE，并且嵌入在基因组区域中，该区域在多个全基因组p53 ChIP分析中有很好的代表性[39,40]（D.Menendez和M.Resnick，个人沟通）。最近有报道称，经过各种处理后，MCF7细胞系中含有+6.8 RE和+2.8 RE的基因组区域与p53结合[56]. 我们发现，在DOXO处理的MCF7和HCT116 p53中，同样的区域在p53免疫沉淀物质中富集^+/+细胞系。然而，在我们的实验设置中，在已鉴定的REs中，其他REs与MCF7细胞系中的p53结合。这些结果与酵母功能测定结果基本一致，证实了数据的可靠性。

关于项目DH2，我们的结果不能最终证明其对p53的反应性：事实上，实验结果表明，它充其量是一个非常弱的p53靶基因。这一结论基于对酵母中已鉴定的p53 REs的功能分析（比较图2和和5）5)以及p53基因毒性应激依赖诱导不同细胞系内源性基因表达的定量研究(图6）。后一分析受到了以下因素的限制：项目DH2在大多数被检测的细胞系中表达（即HCT116、MCF7、LoVo）。然而，在HepG2细胞系中，可以清楚地检测到基础水平，没有诱导项目DH2通过激活p53观察。最近，由Phang领导的小组项目DH2p53对RKO和LoVo细胞株的诱导作用，尽管仅在RKO结肠癌细胞株中观察到基本表达[19]. 与他们的发现一致，在LoVo细胞系中，我们可以确认没有基本表达，但它是在基因毒性应激下诱导的，然而这是在qPCR检测的极限。Shinmen等人[20]无法检测到的任何感应项目DH2在U87胶质母细胞瘤衍生细胞系中通过Nutlin转染或稳定p53后，与我们在HepG2细胞中观察到的情况类似。从所有这些观察结果来看项目DH2p53的基础表达及其诱导是细胞系依赖性的(表S3和图6）p53对某些靶点的转录可能受到这些细胞系中其他转录辅助因子的存在的影响[20].

有趣的是，Nikulenkov等人发现，在5FU和Nutlin3A治疗后，p53与项目DH2基因组区[56]. 绑定级别大大低于PRODH公司或其他p53共同靶点。基因组区域在两个处理中存在差异，并绘制了约6.8 kb和15.5 kb的上游项目DH2TSS分别位于我们分析中考虑的基因组范围之外的一个区域，起始于TSS上游5kb处。然而，没有证据表明这些区域实际上控制了项目DH2。在我们的分析中，我们没有发现项目DH2基因毒性损伤对MCF7细胞系的诱导作用(图6）.

总之，虽然PRODH和PRODH2的协同表达可以通过蛋白质的存在来证明，如胶原蛋白，它们分别富含脯氨酸和OH-脯氨酸，是这两种酶的底物，但情况似乎并非如此[57]. 事实上，PRODH有广泛的表达模式，可以通过P5C产生谷氨酸和α-KG促进细胞代谢，而化合物又参与细胞内的许多代谢反应和途径。

关于PRODH和PRODH2缺乏协调的p53依赖性表达，可以考虑一些因素。首先，值得注意的是，脯氨酸到谷氨酸途径中PRODH反应的下游步骤是由P5C脱氢酶催化的，其基因(ALDH4型)被报道为p53靶点[18]. 其次，其他p53转录靶点，如TIGAR[58,59]，可以调节α-KG水平。这表明后一种化合物在p53介导的反应中的重要作用，但仅部分阐明，并强调了PRODH在p53控制的代谢途径中的作用[4].

最后，在这项工作中，我们还解决了PRODH公司p53家族其他成员的基因。事实上，我们发现p63β和p73β的异位表达也可以诱导PRODH公司尽管与p53相比处于较低水平(图2A）我们还发现，DOXO在两种细胞系（Rh30和MDA-MB-231）中诱导内源性TAp73β导致PRODH公司成绩单(图2B）而p63的数据则不那么清晰，这可能是因为p53家族成员的内源性表达和他们的相声。事实上，我们选择了三种细胞系来分析p63对PRODH公司反式激活（JHU-011；JHU-029；HaCat）主要表达ΔNp63α亚型。这种亚型已被证明能够反式或抑制不同的p53应答基因亚群以及一组特殊基因[7,44]p63亚型通常在成人组织、肿瘤和肿瘤衍生细胞系中表达吗[44]. 有趣的是，携带+6.8 RE的酵母菌株中ΔNp63α亚型的表达能够在反式激活试验中驱动荧光素酶活性（未发表的结果）。最后，我们发现在Mahlavu肝癌细胞系中PRODH公司DOXO治疗后表达减弱。在该细胞系中，仅发现DOXO轻微诱导表达的亚型为TAp63α和TAp63β(图3D），其中第一个不交易PRODH公司酵母分析中的RE（未公布的结果）。我们对这一观察结果没有解释，除了不同亚型之间的相互作用可能会影响它们的反式激活能力。更多表达TAp63的细胞株需要进行检测，然后才能得出关于转录激活的任何结论PRODH公司通过内源性p63。

据我们所知，没有关于p73转录调控能力的数据PRODH公司表达式，而PRODH公司之前发现其中一个基因在四环素诱导的TAp63γ亚型表达时表达了4倍以上[60]. 与p53相关的诱导水平降低并不意外，因为其他几个p53靶点显示对p63和p73的反应性降低。此外，除其他外，p63和p73对典型的p53 RE表现出不同的DNA结合亲和力和反式激活潜能，这可能部分取决于四聚体组装和构象稳定性，最近通过比较与DNA结合的p63和p73的晶体结构发现[61–64]. 值得注意的是，由p63反式激活的三个RE（即+1.7、+2.8和+6.8）和对p73作出响应的RE（+6.8）都至少有两个没有间隔物的半位点，这与之前的研究一致，这些研究表明p63和p73对相邻的半位点RE都有显著的偏好[14,63,65]. +6.8kb RE不仅被p53识别，而且被p63和p73识别的效率最高。这可能是因为这个RE没有间隔子，并且在一个半位点中存在的错配影响共识的第一个和最后一个碱基，这与建立直接的蛋白质：：DNA相互作用无关，也不排除p53的高亲和力结合[49,66–68]. 然而，由于哺乳动物细胞p63和p73的相互作用是平等的PRODH公司基因瞬时转染实验中，诱导似乎与酵母检测中测得的相对反式激活电位没有严格相关。值得注意的是，除p53外，p73最近也参与新陈代谢和自噬的调节，并被证明受mTOR调节[43,69,70]. 雷帕霉素诱导脯氨酸脱氢酶[71]，人们很容易猜测，这可能至少部分通过p73实现。

总之，这项工作表明PRODH公司是至少两个p53家族成员的靶点，为p53蛋白在代谢途径中的深入参与提供了新的线索。事实上，根据最近描述的谷氨酰胺和脯氨酸之间的联系，p53在这些非必需氨基酸及其衍生物α-KG的代谢和拮抗c-Myc中发挥着更为深远的作用，最近发现c-Myc可以下调这种作用PRODH公司作为对代谢重编程和诱导细胞增殖的重要贡献[72–75].

支持信息

表S1

本研究中用作引物的寡核苷酸。

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表S2

寡核苷酸用于通过“delitto perfetto”方法创建PRODH和PRODH2酵母报告菌株。

（DOCX）

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表S3

细胞系分析摘要项目DH2p53在目前和以往研究中的诱导作用。

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信息S1

Michael A.Resnick的信件，授权引用未公开的数据作为个人通信。

（文件）

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致谢

我们感谢丹尼尔·梅内德斯（Daniel Menendez）和迈克尔·雷斯尼克（Michael A.Resnick）分享他们关于ChIP-seq实验的结果，并感谢胰岛素大学生物化学实验室成员的支持。我们还感谢帕多瓦大学的Angelo Rosolen博士和Angelica Zin博士，费拉拉大学和Sidransky实验室的Luca Maria Neri博士和Carolina Simioni博士慷慨捐赠表达p73或p63的细胞系。最后，我们要感谢拉斐拉·辛奎蒂博士和西尔维娅·帕隆贝拉博士提供的宝贵技术援助。

资金筹措表

这项工作得到了“FAR”（Fondi di Ateneo per la Ricerca）资金的部分支持，该资金用于Paola Campomenosi AIRC（Associazione Italiana per la Ricersa sul Cancro，www.AIRC.it）IG#9086、Alberto Inga AIRC IG#5506、Gilberto Fronza。Raimondi博士是Varese Insubria大学分子和细胞生物学博士课程的博士生。他收到了CIB（Consorzio Interuniversitario Bioteconologie，http://www.cibiotech.it网站/)Yari Ciribilli在田纳西州Cibio逗留期间的住宿费用由Marie-Curie-Autonomous-Province-of-Ternto（PAT）联合基金资助（#40101712）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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文章来自PLOS ONE系列由以下人员提供多环芳烃