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单元格。作者手稿；PMC 2013年10月25日提供。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2013年4月25日；153(3): 601–613.
数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2013.03.028
预防性维修识别码：项目经理3673534
NIHMSID公司：NIHMS474458标准
PMID：23622244

维生素D受体/SMAD基因通路与肝纤维化反应

宁鼎,1 露丝·T·余,1 Nanthakumar Subramaniam公司,三 玛拉·谢尔曼,1 卡罗琳·威尔逊,三 雷努卡·拉奥,三 马蒂亚斯·勒布朗,1 萨利·库尔特,三 何明孝,1 克里斯托弗·斯科特,三 苏·L·刘,4 安妮特·阿特金斯,1 格兰特·巴里什,1 珍妮·冈顿,4 克里斯托弗·利德尔,三 迈克尔·唐斯,1和罗纳德·埃文斯1,2
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补充资料

总结

肝纤维化是一种可逆的创伤愈合反应，涉及肝星状细胞（HSC）TGFβ1的激活。在这里，我们发现维生素D受体（VDR）配体抑制HSC活化并消除肝纤维化，而Vdr公司敲除小鼠自发发生肝纤维化。从机制上讲，我们描述了TGFβ1原纤维化损伤诱导HSC中基因组范围VDR结合位点（VDR顺反子）的显著重新分布。TGFβ1诱导的VDR池蛋白与SMAD3结合位点广泛重叠，在大量原纤维细胞基因上发现了许多顺式调节元件。添加VDR配体减少了共同调控基因的SMAD3占用，揭示了调控肝纤维化的交叉VDR/SMAD基因组电路。这些结果确定了VDR作为内分泌检查点调节肝脏伤口愈合反应的作用，并建议VDR配体作为肝纤维化的潜在治疗方法。

简介

肝纤维化是由细胞外基质（ECM）的过度积累以及由此导致的柔韧性和肝功能丧失所定义的，是急性或慢性肝损伤引发的创伤愈合反应的结果(巴特勒和布伦纳，2005年;Hernandez-Gea和Friedman，2011年;Lee和Friedman，2011年). 工业化国家导致肝损伤导致纤维化的主要原因包括慢性肝炎病毒（HBV/HCV）感染、酗酒以及非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的增加(弗里德曼，1999,2003;弗里德曼和班萨尔，2006年;Siegmund等人，2005年). 持续性损伤时，原纤维胶原逐渐沉积，最终导致实质结节被胶原带包围，这是肝硬化的组织学特征(巴特勒和布伦纳，2005年;弗里德曼，2003).

慢性肝病和肝硬化是全球主要的健康问题(巴特勒和布伦纳，2005年). 在澳大利亚和英国，慢性肝病是第个心脏病、癌症、中风和胸部疾病之后最常见的死亡原因(威廉姆斯，2006). 在美国，他们排名第八第个最常见的死亡原因(Kim等人，2002年). 目前，FDA尚未批准对慢性肝病进行抗纤维化治疗(科恩·纳夫塔利和弗里德曼，2011年)在肝脏疾病的根本原因无法改善的情况下，治疗选择仅限于解决随之出现的并发症，如门脉高压、肝细胞癌和肝衰竭。因此，需要进一步了解调节肝脏纤维化反应的分子机制，以确定成功抗纤维化治疗的新靶点。

肝纤维化的中心参与者是非实质细胞（NPC），如肝星状细胞（HSC）(巴特勒和布伦纳，2005年;Bouwens等人，1992年)，是ECM的主要生产商(弗里德曼，2008年;Friedman等人，1985年;Reynaert等人，2002年). 在健康肝脏中，HSC是维甲酸（维生素A）储存细胞，位于窦内皮和肝细胞之间的Diss空间(弗里德曼，2008年). 损伤后，旁分泌刺激导致HSC发生显著的表型变化（在一个称为激活的过程中），从而表现出增殖、收缩和维甲酸存储的丢失，并伴随着趋化因子、细胞因子和病理性细胞外基质成分的分泌(弗里德曼，2008年;Geerts，2001年). 虽然调节这一过程的确切机制尚未阐明，但转化生长因子β1（TGFβ1）信号传导被认为是负责ECM合成的最有效的促纤维化途径之一(Breitkopf等人，2006年;稻崎骏和冈崎骏，2007年).

TGFβ是一种多功能细胞因子，对细胞分裂、分化、迁移、黏附、组织和死亡具有深远影响。TGFβ有三种主要亚型（TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3），TGFβl是参与肝纤维化的主要亚型(稻崎骏和冈崎骏，2007年). 肝损伤后，来自旁分泌源和自分泌源的TGFβ1与HSC细胞表面的I型和II型丝氨酸/苏氨酸受体激酶结合(稻崎骏和冈崎骏，2007年). 随后，其下游效应器SMAD2和SMAD3被磷酸化并释放到胞浆中，在胞浆中与SMAD4形成复合物。然后，这种SMAD复合物可以易位到细胞核中，识别基因组上的SMAD结合元件（SBE），并直接调节靶基因(Feng和Derynk，2005年;马萨格等人，2005年). 因此，破译HSC中TGFβ-SMAD转录网络并了解其如何由细胞外和细胞内因子控制是开发有效抗纤维化策略的关键。

维生素D受体（VDR）是核激素受体（NHR）超家族的成员，是钙稳态和骨骼健康的关键调节器(Bouillon等人，2008年;Goltzman等人，2004年). 该受体的内源性激活物是维生素D（1,25（OH）的生物活性形式2天三)和胆汁酸，如石胆酸（LCA）及其衍生物（LCA-醋酸盐、LCA-甲酸盐、3-酮-LCA）(Makishima等人，2002年;Nagpal等人，2005年). 有趣的是，在NHR超家族中，VDR在结构和功能上最接近的亲属包括法尼类X受体（FXR）、构成性雄甾烷受体（CAR）和孕烷X受体（PXR），它们都是肝内胆汁酸稳态和外源性解毒的调节器(Bookout等人，2006年;Bouillon等人，2008年). 然而，由于维生素D在肝脏中的低水平表达，维生素D在肝功能中的生理作用早已被忽视(Bookout等人，2006年; Han等人，2010年）。尽管如此，在HSC中发现了稳健的VDR表达，这使我们认为它可能是肝纤维化的调节剂(Gascon-Barre等人，2003年).

在这里，我们证明，在标准的小鼠肝损伤模型中，可以通过服用合成的VDR激动剂钙泊三醇来改善肝纤维化，钙泊三酚可以减少胶原沉积和纤维化基因表达。我们也证明了这一点Vdr公司敲除小鼠发生自发性肝纤维化，证明该受体在正常肝内稳态中发挥作用。机制研究表明，VDR信号的激活可拮抗HSC中大量TGFβ/SMAD依赖的原纤维化基因转录反应。VDR和SMAD3全基因组结合位点的定位显示，这些转录因子在原纤维化基因顺调控元件上的重叠DNA占有率。有趣的是，TGFβ-SMAD信号转导增强了这些基因组位点对配体VDR的可及性，进而拮抗SMAD3的募集。这种动态VDR/SMAD基因组反馈电路代表了一种以前未被认识的调节肝纤维化的机制。

结果

VDR预防肝纤维化

与以前的结果一致(Abramovitch等人，2011年;Gascon-Barre等人，2003年)我们发现Vdr在HSC中表达，但在全肝或纯化肝细胞中均未检测到(图S1 A、B和C). 此外，通过1,25（OH）对CYP24A1表达的配体诱导，HSC表达的VDR具有完全的功能2天三或其低钙类似物钙泊三醇（Cal）(Nagpal等人，2005年) (图S2A)在原代HSC和LX-2细胞中，一个成熟的TGFβ1反应人HSC细胞系(Xu等人，2005年) (图S1D&E).

探讨VDR信号是否可以抑制纤维化基因表达并对抗肝纤维化形成体内，四氯化碳（CCl）诱导肝纤维化4)是一种广泛使用的肝毒性药物，在野生型C57BL/6J小鼠中每周3次腹腔注射0.5ml/kg。四周前，CCl4-治疗后的小鼠表现出广泛的肝桥接纤维化，胶原大量沉积，而CCl4/天狼星红染色定量、肝羟脯氨酸含量和组织学纤维化评分显示，钙泊三醇治疗小鼠的纤维化显著减轻(图1A–D). 钙泊三醇治疗对血清钙浓度没有显著影响(图S2B). 检查关键纤维化标记基因，如第1a1列,Tgfb1型和倾倒1钙泊三醇下调50-70%(图1E-G). 有趣的是，当小鼠在CCl前用钙泊三醇预处理5周时4/钙泊三醇-co治疗后，肝脏的纤维生成反应几乎完全消失(图S2C-F)这表明VDR激动剂不仅具有减轻纤维化的能力，而且具有预防肝纤维化的潜力体内.

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系统给予钙三醇减轻CCl4治疗小鼠肝纤维化，同时基因消减Vdr公司自发性肝纤维化的结果

（A） 4周龄C57BL/6J小鼠的肝脏（载体（DMSO）（n=3）、四氯化碳（CCl4，0.5ml/kg i.p.，n=6）、钙泊三醇（Cal，20μg/kg经口灌胃，n=3）和CCl4加钙泊三酚（n=6）），天狼星红（左侧）和H&E（右侧）染色。比例尺，200μm。通过（B）天狼星红染色、（C）羟脯氨酸含量和（D）H&E染色（Ishak评分）量化纤维化。星号表示具有统计学意义的差异（Student’s unparied t test，**p<0.01，***p<0.001）。（E） –（G）RT-qPCR测量Col1a1、Tgfβ1和Timp1的肝脏基因表达水平。数据表示平均值±SEM。星号表示具有统计学意义的差异（Student的非配对t检验，**p<0.01，***p<0.001）。（H） 天狼星红（顶部）和H&E（底部）染色的肝脏切片Vdr公司+/+（n=3），Vdr公司+/-（n=4）和Vdr公司−/−（n=4只中的2只）小鼠在处死前6个月保持钙和磷酸盐补充营救饮食（2%钙、1.25%磷、20%乳糖）。箭头表示豆状体周纤维化(Vdr公司+/负极小鼠）和炎症细胞浸润(Vdr公司−/−小鼠）。比例尺，50μm。（一） 通过羟脯氨酸含量和（J）Col1a1 mRNA表达，使用来自Vdr公司−/−天狼星红染色显示纤维化程度最低的小鼠（参考结果）。数据表示平均值±SEM。星号表示统计学上的显著差异（Student的非配对t检验，*p<0.05）。另请参见图S1和S2.

这让我们研究VDR缺乏是否会影响肝纤维化。确实，6个月大Vdr公司−/−小鼠表现出自发性肝损伤/纤维化表型，四分之二的小鼠发展为肝硬化，胶原沉积增加(图1H（右/上）与肝细胞坏死和门管区周围坏死性炎症灶相关(图1H，右/下，箭头）。由于使用肝切片的天狼星红染色观察到肝纤维化的程度存在一些差异，因此在两组患者中测量肝羟脯氨酸含量Vdr公司−/−纤维化程度最低的小鼠（非肝硬化小鼠），其纤维化程度仍显著高于野生型或野生型小鼠Vdr公司+/负极老鼠(图1I). 此外，Vdr公司+/负极在没有炎症反应的情况下，小鼠表现出多发性豆状体周纤维化灶(图1H，中央/顶部，箭头），在维持相同钙和磷酸盐补充饮食的对照野生型小鼠中未观察到病理学(图1H，左）。组织学检查结果通过肝羟脯氨酸含量的定量以及关键纤维化标记基因Col1a1的检测得到证实(图1I&J). 这些数据表明Vdr公司等位基因是维持正常肝脏结构所必需的，当完全消除时，除了纤维生成的失调外，还会导致局部炎症反应失去控制。

VDR信号抑制TGFβ诱导的前纤维蛋白基因

表达谱分析用于探讨VDR信号在TGFβ1和TGFβ1+1,25（OH）中的潜在影响2天三-治疗的原代大鼠HSC。特别是1,25（OH）2天三处理减弱了培养诱导的HSC激活，因此处理细胞的转录组与新分离的静止细胞的转录体非常相似(图2A)和1,25（OH）的联合处理2天三与转化生长因子β1一起导致大量转化生长因子α1诱导基因的显著抑制(表S1). 在这些基因中，我们注意到39个对肝纤维化起核心作用的基因，包括胶原蛋白(巴特勒和布伦纳，2005年;Tsukada等人，2006年)，Tgf超家族成员(稻崎骏和冈崎骏，2007年)，基质金属蛋白酶家族成员（Mmps）(亚瑟，2000;韩，2006)、金属蛋白酶组织抑制剂（Timps）(亚瑟，2000;Yoshiji等人，2002年)，整合素(Patsenker和Stickel，2011年)赖氨酰氧化酶家族成员(Barry-Hamilton等人，2011年;卡根和李，2003年;Vadasz等人，2005年) (图2B).

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VDR信号转导抑制TGFβ诱导的前纤维蛋白基因

（A） 热图比较了新分离的大鼠HSC（静止HSC，Q-HSC）、活化HSC（A-HSC，塑料上培养3天）和存在10nM 1,25（OH）2D3（A-HSCs+1,25（羟基）2D3）的细胞培养物中519个差异表达基因。使用log2转换的微阵列表达数据对行和列进行欧几里德聚类，每个治疗组n=2。（B） TGFβ1（1ng/ml）和TGFβ1+1,25（OH）2D3（100nM）处理24小时的原代大鼠HSC中参与纤维化的基因折叠变化的热图，每个治疗组2个。（C） 对照组（siCNTL）或VDR-特异性（siVDR）siRNA转染的LX-2细胞中的纤维化基因表达用载体（DMSO）、钙泊三醇（Cal，100nM）、TGFβ1（1ng/ml）或TGFβ1+Cal处理16小时。数据表示至少三个独立实验（一式三份）的平均值±SEM。星号表示具有统计学意义的差异（Student的非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01）。

接下来，我们证实，在原代小鼠HSC和LX-2细胞中，钙泊三醇能有效抑制纤维化基因的表达，这表明VDR激动剂的抗TGFβ特性可能在哺乳动物物种中保持不变（数据未显示）。最后，通过在LX-2细胞中使用RNAi，我们发现VDR的丢失可以消除钙泊三醇介导的TGFβ1诱导基因表达的抑制(图2C)共同揭示VDR调节抗TGFβ/纤维化网络在体外.

在HSC中定义VDR和SMAD3 Cistromes

这些观察结果提出的一个主要问题是VDR是否是抗纤维化基因网络的直接或间接调节因子。由于SMAD2和SMAD3是TGFβ1诱导的HSC促纤维化基因表达所必需的(图S3A)VDR激活对TGFβ1诱导的SMAD3磷酸化和随后的核移位没有显著影响(图S3B)，我们建议直接监管VDR。为了探索这种可能性，我们使用染色质免疫沉淀结合高通量测序（ChIP-Seq）分析了与钙泊三醇和TGFβ1共同培养的LX-2细胞中VDR和SMAD3的全基因组结合位点。由此产生的顺反子确定了24984个VDR和23581个SMAD3高置信结合位点（FDR<0.0001）(图3A&E). 与其他转录因子的全球结合模式一致（Barish等人，2010；Biddie等人，2011年;Heinz等人，2010年;Trompouki等人，2011年)，大多数VDR和SMAD3结合位点定位于遥远的基因间和内含子区域，而只有16-21%位于基因启动子(图3A&E). 从VDR和SMAD3结合位点列表中，我们确认了一些已知维生素D诱导基因的功能性维生素D反应元件（VDRE），如CYP24A1公司(图3B),SPP1型,BGLAP公司(图S4A和B)和用于TGFβ信号转导靶基因的SMAD-结合元件（SBE），包括标识1(图3F),SMAD7系列和转化生长因子βI(图S4C&D). 基因注释分析根据与最近转录起始位点的接近程度指定峰值，并在单个VDR和SMAD3顺反子内分别产生11031和9210个假定靶基因。对这些注释基因的基因本体（GO）分析表明，VDR和SMAD3靶基因最常见的分类功能是代谢（47%）和细胞信号（34%）(图3C&G).

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肝星状细胞中的VDR和SMAD3 Cistromes

（A） 和（E）饼图，说明经16小时钙泊三醇（100nM）预处理后4小时处理的LX-2细胞（钙泊三酚（100nM）和TGFβ1（1ng/ml）中VDR和SMAD3结合位点的基因组位置，FDR<0.0001）。启动子区域，来自TSS的<2kb；基因间区域，不是启动子、内含子或外显子。（B） 和（F）代表性ChIP-Seq分别读取与CYP24A1和ID1基因对齐的VDR和SMAD3。（C） 和（G）用VDR和SMAD3结合位点注释的基因的基因本体（GO）分类。（D） 和（H）从头开始对VDR和SMAD3峰值100bp内的序列进行模体分析（FDR<0.0001）。另请参见图S3和S4.

最后，我们研究了VDR和SMAD3的最丰富的结合基序。在这些序列特征中，带有3bp间隔区（DR3）共有序列的直接六聚体重复序列是VDR位点上最丰富的基序，解释了74%的VDR结合峰(图3D，顶部），而一致的SBE序列（GTCT基序）占SMAD3结合峰的83%(图3H，顶部）。有趣的是，我们的分析表明，GTCT和DR3型模体也分别在VDR和SMAD3结合位点的核小体距离内共同富集，这表明VDR和SMAD3通过交叉的顺反子进行通信(图3D&H，底部）。

VDR/SMAD3基因串扰对抗TGFβ信号转导

为了解决这种可能性，我们使用生物信息学分析，通过计算VDR和SMAD3结合位点的数量来量化池交叉的程度。共有10436个基因组位点被共占(图4A)，并且共占模式是全基因组的，如通过热图量化SMAD3结合峰周围的VDR位点所示(图4B). 如果这种基因组交叉介导VDR/SMAD3串扰，VDR和SMAD3可以同时与其共占位点相互作用。序列ChIP（ChIP-re-ChIP）实验证实，VDR和SMAD3至少暂时可以共占相同的基因组位点(图4C).

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VDR/SMAD3基因串扰对抗TGFβ信号转导

（A） Venn图描绘了在如图1所示处理的LX-2细胞中VDR和SMAD3基因组结合位点的重叠图3（B）强度图，显示ChIP碎片密度的层次聚类，作为与统计显著SMAD3结合峰中心距离的函数（23532个峰，FDR=0.0001）。VDR位置0附近的强度（蓝色）表示VDR/SMAD3位点重叠，SMAD3（红色）作为阳性对照。（C） 在VDR和SMAD3共结合位点通过qPCR分析处理的LX-2细胞的ChIP-re-ChIP。占用率是相对于输入染色质表示的。（D） VDR和SMAD3共占基因丰富的常见人类表型。（E） TGFβ1/VDR协同调控的原发性纤维化基因的数量包含VDR和SMAD3共占的基因组位点。（F） 在由TGFβ1和VDR共同调控的促纤维化基因中观察到的VDR/SMAD3共占位点的数量。LX-2细胞按图3数据表示至少三个独立实验的平均值±SEM，一式三份。星号表示具有统计学意义的差异（Student t检验，*p<0.05，**p<0.01）。另请参见补充表2&图S5.

其次，如果抗TGFβ信号转导由VDR/SMAD基因组交叉点介导，那么HSC中的促纤维化基因应在联合结合调控元件中过度表达。事实上，GO分析表明人类表型显示VDR和SMAD3共占位点的“异常瘢痕”反应显著增加（67%）(图4D)引导我们检测VDR/SMAD3与早期确定的39个促纤维化基因的潜在共现性(图2B). 在该子集中，发现34个包含VDR/SMAD3共占站点(图4E). 此外，许多这些基因被发现包含多个VDR/SMAD3共占位点(图4F&表S2). 最后，我们在荧光素酶报告质粒上构建了VDR/SMAD3共结合位点第1列结果表明，这些基因组元件至少可以部分重述钙泊三醇和转化生长因子β1的相反作用，表明这些顺式元件起到促成纤维细胞基因表达的作用(图S5A).

VDR/SMAD基因组拮抗

对共占基因组区域中VDR和SMAD3之间空间关系的信息分析证实，它们各自的响应元件在一个核小体窗口内共定位（≥200个碱基对）(图S5B)，进一步支持近端DNA结合引起基因组拮抗的可能性（Barish等人，2010；Hua等人，2009年).

VDR/SMAD基因组拮抗作用的存在可以通过将VDR和SMAD3的平均ChIP-Seq信号强度绘制到它们共同占据位点的中心来可视化。这表明，在钙泊三醇存在的情况下，TGFβ诱导的SMAD3募集在全球范围内受到约1.5倍的损害，而VDR与这些位点的结合在全球范围增强了近10倍(图5A和B). 此外，通过检测其对含有VDR/SMAD共占调控元件（如第1列测序轨迹的可视化显示，钙泊三醇促进了所有三个主要VDR/SMAD3共结合位点的VDR占用第1列基因(图5C，中间2首曲目）。相反，经钙泊三醇治疗后，TGFβ诱导的SMAD3结合通常沿基因减弱(图5C，前2首曲目，并由ChIP-qPCR独立验证，图5D&F). 在其他促纤维化基因的调控区，如第12列,TGFB1型,TGFB2型,TIMP1公司,TIMP2公司和LOXL2型(图S6A–F). 此外，RNAi介导的VDR和SMAD2/3的缺失分别逆转了钙泊三醇依赖性SMAD3募集损失和TGFβ1诱导的VDR与共占调控元件结合，表明VDR和SM AD需要介导这种基因组拮抗(图5E和G).

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VDR与SMAD的基因组对抗

（A） 和（B）相对于LX-2细胞中VDR/SMAD3共占位点中心的VDR和SMAD3 ChIP-Seq信号强度图（TGFβ1（1ng/ml）±钙泊三醇（100nM）4小时）。（C） 代表性ChIP-Seq读数与第1列用于处理的LX-2细胞（载体（DMSO）、钙三醇（Cal，100nM）、TGFβ1（1ng/ml）或TGFβ1+钙三醇）中的VDR和SMAD3。三个共有场地被指定为1、2和3。（D） 和（F）ChIP-qPCR第1列在上述处理的LX-2细胞中，由VDR和SMAD3共同结合的调节区#1。（E） 和（G）ChIP-qPCR第1列控制区#1（siCNTL）、VDR-specific（siVDR）或SMAD3-特异性（siSMAD3）siRNA转染的LX-2细胞如上处理。占用率是相对于输入染色质表示的。数据表示至少三个独立实验（一式三份）的平均值±SEM。星号表示具有统计学意义的差异（Student t检验，*p<0.05，**p<0.01）。另请参见图S6和S7.

自从组蛋白修饰辅因子（如CBP和p300）的招募和组蛋白H3的超乙酰化被确定为TGFβ信号激活的标志性事件以来(马萨格等人，2005年)，我们询问VDR/SMAD基因组拮抗剂是否可以通过干扰此表观遗传途径来抑制TGFβ信号传导。因此，我们检测了用钙泊三醇或TGFβ1或两者处理的细胞中组蛋白H3乙酰化状态以及CBP和p300向VDR/SMAD共占位点的募集。ChIP-qPCR证实TGFβ1在VDR/SMAD共占调控区诱导p300和CBP的募集以及组蛋白H3的高乙酰化第1列在钙泊三醇和转化生长因子β1共同作用的细胞中，这种作用消失(图S7A)这表明VDR/SMAD基因组拮抗通过破坏辅活化因子募集和组蛋白高乙酰化来限制TGFβ的激活。

配体依赖性辅阻遏物募集或“转阻遏”被认为是核受体如PPARγ和LXR负调控炎症基因表达的主要机制(格拉斯和赛霍，2010年). 为了测试转阻遏是否有助于拮抗作用，我们检测了共阻遏物的潜在诱导募集，包括NCoR、SMRT、HDAC3、CoREST、LSD1和G9a到VDR/SMAD3共占据的促纤维化基因的调节区，如第1列和第12列对钙泊三醇和TGFβ1的反应。然而，无法检测到这些共抑制剂与这些位点结合的改变(图S7B)这表明，这些位点转录激活复合物的丢失并不是由于辅阻遏物招募增加所致。

TGFβ揭开信号相关VDR Cistrome的面纱

在建立VDR/SMAD3基因组拮抗作用的同时，我们注意到TGFβ/SMAD信号似乎增强了配体VDR向血管内皮细胞顺调控区的募集第1列(图5F&G). 为了确定是否在促纤维化基因的其他VDR结合位点观察到这种效应，我们分析了存在和不存在TGFβ1的VDR顺反义体±钙泊三醇。对结合数据的检查表明，TGFβ1促进所有促纤维化基因的连接但非连接VDR与顺式调控区的结合(图5B&S6A–F系列，降低4个轨道）。

接下来，我们比较了存在或不存在TGFβ1时钙泊三醇诱导的VDR全局结合模式。6281个结合位点组成从头开始在缺乏TGFβ1的情况下，VDR池色素沉着，在存在TGFβ1的情况下，诱导了一种由24984个位点组成的新池色素沉着(图6A). 有趣的是，只有3537个位点被两个顺反子共有，85%（21447个位点）的TGFβ诱导的配体VDR结合位点是唯一的(图6A)这表明TGFβ导致配体VDR全基因组结合位置的显著改变。

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TGFβ揭开信号依赖型VDR Citrome的面纱

（A） 维恩图显示处理的LX-2细胞中重叠的VDR池（FDR<0.0001）。（B） （A）中描述的VDR ChIP-Seq峰值位置图，相对于LX-2细胞中SMAD3结合位点中心，分为VDR Cal/TGFβ1+Cal（3537重叠）、VDR Cal（仅2744钙泊三醇）或VDR TGFβ1+Ca（仅21447钙泊三酚+TGFβ1）。（C） 与所示处理的LX-2细胞中VDR/SMAD3共占位点中心相关的VDR ChIP-Seq信号强度图。（D） 上述处理的LX-2细胞的核和全细胞提取物（NE，WCE）中VDR的Western blot。TFIIH（p89）用作负荷控制。（E） 含VDRE的VDR ChIP-Seq峰重叠时，仅钙泊三醇、钙泊三酚+TGFβ1或钙泊三醇/钙泊三ol+TGFα1的百分比。（F） 组蛋白H3 ChIP-Seq信号强度相对于所示处理的LX-2细胞中VDR/SMAD3共占位点中心的图。

两个VDR池的比较研究表明，TGFβ1+钙泊三醇位点（而非钙泊三酚单位点）在SMAD3结合位点高度富集(图6B). 此外，转化生长因子β信号转导增强了VDR与这些基因组位点的结合(图6C)这种效应不太可能是由于VDR表达的改变(图6D). 接下来，我们分析了VDR基因座不同亚群的DNA序列，发现70%以上包含从头开始VDR监管站点(图6E)这表明VDR直接作用于DNA，而不是依赖于SMAD的系留。有趣的是，我们观察到TGFβ诱导VDR-SMAD3共结合位点的核小体显著耗竭(图6F)表明TGFβ-SMAD信号可能通过增强局部染色质重塑和由此产生的可及性，促进VDR与其邻近位点的结合。

VDR与SMAD之间的基因组电路

我们的研究结果表明VDR和TGFβ-SMAD信号之间存在动态关系：也许，TGFβ诱导SMAD与染色质结合创造了一个新的基因组景观，现在可以利用配体VDR来实现暂时延迟的SMAD抑制。为了探索这种时空关系，我们测定了SMAD3和VDR募集到纤维化基因（例如第1列)在钙泊三醇或TGFβ1或两者的存在下。具体地说，采用ChIP-qPCR监测VDR和SMAD3与血管内皮细胞顺调控区的结合第1列在多个时间点（0、1、2、4、6、16小时）。值得注意的是，TGFβ1在治疗4小时后最大限度地促进了配体VDR和SMAD3与该位点的结合，随后在16小时后逐渐降低到基础水平(图7A和B)，证实TGFβ1在促进VDR向染色质募集中的作用。有趣的是，钙泊三醇的存在显著改变了SMAD3在TGFβ1刺激下的结合曲线，仅在TGF？1治疗1小时后就观察到SMAD3的最大结合。4小时后，SMAD3招募显著减少70%(图7B). 此外，在钙泊三醇和转化生长因子β1存在的情况下，VDR和SMAD3结合正常化至其基础水平，表明VDR和SMAD3的占有率呈负相关(图7C)表明TGFβ诱导的染色质可及性产生了一种基因组结构，有助于VDR逆转SMAD激活。总之，VDR/SMAD基因组电路为VDR通过拮抗HSC中TGFβ信号传导阻断纤维化提供了一种基于染色质的机制。

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VDR/SMAD基因组电路

（A） 和（B）VDR和SMAD3在第1列通过ChIP-qPCR测定经处理的LX-2细胞（载体（DMSO）、钙泊三醇（100nM）、TGFβ1（1ng/ml）、TGF-β1（1mg/ml）+钙泊三酚（100nM））中的调节区#1。在进行时间进程分析之前，用钙泊三醇（100nM）预处理LX-2细胞16小时，并表达相对于输入染色质的占有率。数据表示至少三个独立实验的平均值±SEM，一式三份。星号表示与相应时间点的钙泊三醇诱导的VDR占用率或TGFβ1诱导的SMAD3占用率相比，在统计学上存在显著差异（Student的非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01）。（C） TGFβ1+钙泊三醇诱导的VDR和SMAD3结合的时间进程，分别归一化为钙泊三酚单独或TGFβ1单独。数据表示至少三个独立实验（一式三份）的平均值±SEM。（D） 模型描述了控制HSC原发性反应的拟用VDR/SMAD基因组电路。

讨论

20世纪90年代初，HSC作为ECM沉积在正常和纤维化肝脏中的主要效应细胞的建立是理解肝纤维化发病机制的一个里程碑式发现(弗里德曼，1993). 自那时以来，研究发现HSC中的多种细胞信号分子、激素、细胞膜受体和转录因子可促进肝纤维化(Hernandez-Gea和Friedman，2011年). 然而，积极预防这种病理过程的因素和信号级联尚不清楚。在此，我们证明在实验动物模型中，VDR的药理激活可减缓肝纤维化的进展，而VDR表达的基因消除可导致肝纤维化的自发发展，因此，VDR可能位于内分泌检查点，对肝脏的创伤愈合反应进行负向调节。从机制上讲，我们描绘了一个以前未被识别和暂时控制的基因组电路，该电路由VDR和SMAD转录因子的相反作用组成，能够抑制HSC中纤维生成反应的强度并控制肝脏中的纤维生成。具体来说，为了应对肝损伤，TGFβ1激活HSC可诱导促纤维化基因表达通过SMAD向细胞核移位和染色质重塑。通过增加邻近维生素D反应元件（VDRE）的可及性，SMAD激活有助于VDR招募到以前隐秘的基因组位点。配体VDR随后拮抗SMAD在染色质上的驻留，并破坏组蛋白H3的乙酰化，最终抑制原纤维蛋白基因的表达(图7D). 值得注意的是，近10500个TGFβ1诱导的SMAD和VDR结合位点的近端位置确定了全球染色质结构，并表明整合的VDR/SMAD基因组电路作为肝纤维化反应的主调节器发挥作用。

抑制TGFβ信号传导的染色质基础的鉴定将直接关注SMAD依赖性转录作为调节靶点。这是相关的，因为TGFβ-SMAD信号在后生动物生物学的几乎每个方面都发挥着重要作用，其失调可能导致多种人类疾病，从自身免疫到纤维化和癌症(Hernandez-Gea和Friedman，2011年;Li和Flavell，2008年;马萨格，2008年). 我们发现VDR和SMAD之间存在基因组拮抗作用，这不仅使VDR成为第一个在染色质界面上减弱TGFβ-SMAD信号的DNA-结合转录因子，而且还为更一般的“转录串扰”概念增加了特异性（顺反子层）。

TGFβ-SMAD激活使配体结合的VDR随后募集以抑制SMAD靶点的观察揭示了两种内源性信号通路可以相互交叉调节活动的方式。因此，这种基因组中继允许SMAD的阳性激活随后被VDR抑制，从而构成一个自我调节的基因组电路，这与之前报道的转录因子之间以互斥方式的基因组串扰有很大区别（Barish等人，2010；Hua等人，2009年). 似乎合乎逻辑的是，该电路可能赋予HSC在正常和纤维化肝脏中协调ECM合成的能力。

除了TGFβ-SMD途径外，纤维化在临床上几乎总是伴随着持续的炎症(Hernandez-Gea和Friedman，2011年;Lee和Friedman，2011年). 因此，VDR信号的广泛抗炎作用可能有助于其在肝脏中的抗纤维化特性。在这方面，已有文献证明VDR在炎症反应中心的几种细胞类型中表达(Barish等人，2005年;Griffin等人，2001年;von Essen等人，2010年)维生素D缺乏和VDR本身的多态性以及参与维生素D代谢的基因都与炎症疾病的风险和严重程度有关(Agmon-Levin等人，2012年;Janssens等人，2011年;Munger等人，2006年;Ramagopalan等人，2011年). 然而，VDR信号的抗炎作用在肝纤维化形成中的作用尚不清楚。一方面，炎症反应失调与肝纤维化的自发发展Vdr公司−/−小鼠表明VDR信号可能通过抗炎机制控制肝纤维原(图1H，右侧）。另一方面，这种观点被适度的豆状核周围肝纤维化表型削弱，在Vdr公司+/负极老鼠(图1H，中间）。此外，炎症和纤维化之间的因果关系尚未完全确定，炎症在肝纤维化形成过程中的主要促纤维化作用似乎是使HSC对TGFβ-SMAD活化敏感(Seki等人，2007年;Seki和Schnabl，2012年). 因此，VDR信号的抗炎特性不太可能在其抗纤维化功能中发挥主要作用。

我们的研究进一步阐明了VDR信号在肝脏病理生理学中的一种未被认可的功能。由于其异常低的表达，VDR受到的关注远低于其高表达同源分支成员，包括FXR、PXR和CAR，它们几乎影响肝功能的各个方面，包括脂质和葡萄糖代谢、药物配置、胆固醇流出和胆汁酸稳态(Bookout等人，2006年;Chawla等人，2001年). 然而，最近的研究表明，低维生素D水平与慢性肝病患者肝纤维化增加有关(Abramovitch等人，2011年;Lim和Chalasani，2012年;Petta等人，2010年;Terrier等人，2011年)维生素D可以抑制大鼠肝纤维化(Abramovitch等人，2011年)提示肝脏VDR具有潜在的生理作用。然而，VDR是否以及如何直接或间接调节肝纤维化仍悬而未决。我们发现VDR促进HSC静止并控制TGFβ信号转导，这表明维生素D可以通过一种新的机制发挥其抗纤维化作用。值得注意的是，我们对抑制纤维化的VDR信号通路的描述也与最近的研究一致，这些研究表明VDR的多态性与肝纤维化的进展和肝硬化的演变有关(Baur等人，2011年;田中等人，2009年).

发达国家高达45%的死亡可归因于纤维化疾病，但目前批准用于临床的抗纤维化药物很少(韦恩，2008). 尽管旨在中和TGFβ的治疗显示出广泛的抗纤维化活性(Rosenbloom等人，2010年)不必要地阻断非病变组织中的TGFβ，从而损害了其益处。我们对VDR/SMAD基因组电路的发现，通过限制TGFβ对VDR阳性细胞的抑制，而不是干扰全身信号传导，阐明了一种潜在的更安全的抗纤维化策略。

总之，我们的工作描述了一个包含VDR和SMAD转录因子的交叉基因组电路，该转录因子控制肝纤维化的发生。这一发现大大扩展了我们对两种不同的信号依赖转录因子如何相互作用以建立细胞特性和功能的理解。通过使用遗传和诱导模型，我们对TGFβ1信号转导的全球反应程序是如何建立和调控的提供了新的见解。此外，这些研究将VDR确立为治疗肝纤维化的潜在药物靶点，并提供了VDR依赖性基因表达调控的新范式。鉴于VDR和TGFβ的普遍表达模式，VDR/SMAD基因组电路可能适用于许多其他细胞类型，并可能影响广泛人类疾病的发病机制。

实验程序

原代HSC的分离和培养

HSC是从10周龄雄性C57BL/6J小鼠和Wistar大鼠中通过原位蛋白酶、胶原酶灌注和单步组织学梯度分离出来的(Hendriks等人，1985年;Knook等人，1982年). 在终点分析之前，将分离的HSC在含有20%FBS（Hyclone）的DMEM（Mediatech）中培养40小时。

免疫沉淀和Western Blot

整个细胞裂解物通过RIPA缓冲液裂解获得，而核提取物的分离如前所述(丁等人，2008). 使用抗SMAD2/3抗体（Santa Cruz，sc-133098）在LX-2细胞的核提取物中免疫沉淀总SMAD3，然后使用抗SMAD 3（Cell Signaling，9523）和抗pSMAD3（Cel Signaling，9520）特异性抗体进行SDS-PAGE和western blot检测。

细胞培养、荧光素酶测定和RT-qPCR

LX-2细胞是纽约州纽约市西奈山医学院斯科特·弗里德曼教授慷慨赠送的礼物，按照前面所述进行培养(Xu等人，2005年). TGFβ1（研发系统），1,25（OH）2天三和钙泊三醇（Tocris）的使用浓度分别为1ng/ml、100nM和100nM，除非另有说明。对于荧光素酶分析，按照制造商的说明使用Fugene 6（Roche）进行DNA转染。DNA转染24小时后，在荧光素酶/β-半乳糖苷酶检测（Promega）之前，用载体、钙泊三醇或TGFβ1或两者再处理细胞24小时。对于RT-qPCR，在TRIzol提取后纯化总RNA，并用DNaseI（Invitrogen）处理。使用iScript RT Supermix（Biorad）进行cDNA合成。使用SYBR Green试剂（Biorad）进行技术性三倍定量PCR。采用相对标准曲线法进行定量（Biorad）。通过归一化Gapdh（小鼠）或U36B4（人类）数量计算表达水平。引物序列列于表S3.

siRNA的转染

使用RNAiMax转染试剂（Invitrogen）以20nM的指示siRNA的浓度进行转染（在SMAD2/3的情况下，将10nM的每个siRNA组合用于转染）。在末端检测之前，转染细胞在不受干扰的情况下培养至少48小时。

CCl公司4肝损伤与纤维化模型

8周龄雄性C57BL/6J小鼠IP注射0.5ml/kg体重CCl4（在Sigma的玉米油中为1:50 v/v）或车辆（在玉米油中的DMSO）每周三次，持续四周。钙三醇（20μg/kg体重）每周经口灌胃给药5次，从第一次服用CCl后20天开始4。在最终CCl后72小时终止实验动物4采集注射物、全肝和血清进行组织学、细胞学、生化和分子分析。

Vdr公司击倒小鼠

靶向消融C57BL/6J杂合小鼠Vdr公司(Li等人，1997年)从杰克逊实验室（库存编号006133）获得。野生型控件，Vdr+/负极和Vdr−/−小鼠被饲养在Vdr公司−/−救援饮食(Amling等人，1999年)含21%的钙、0.67%的磷和20%的乳糖，每克饮食中补充4.4单位的维生素D，为期6个月，然后再进行祭祀。收集肝脏进行上述分析。

纤维化评分和量化肝胶原和羟脯氨酸含量

福尔马林固定肝脏的5μm切片按照标准H&E和天狼星红方法进行染色，并由一位对实验条件一无所知的病理学家进行审查。使用Ishak改良组织学活性指数（HAI）评分系统对纤维化进行评分。在10个非接触的天狼星红染色切片上，使用Image J软件对纤维化进行量化。所有图像均使用安装在奥林巴斯显微镜上的高分辨率徕卡DFC420数码相机获得，该显微镜配备有×4/0.13、×10/0.30、×20/0.50和x40/0.75 UplanFL N平面物镜，并使用徕卡应用套件进行处理。使用Biovision（K555-100）的商业比色法测量肝脏羟脯氨酸含量。

ChIP和ChIP-Re-ChIP

用钙泊三醇（100nM）预处理LX-2细胞16小时，然后再培养钙泊三酚（100nM）或TGFβ1（1ng/ml）或两者再培养4小时。然后采集细胞进行ChIP分析。ChIP的实验程序如前所述（Barish等人，2010年）。简言之，固定后，用Diagenode Biorruptor分离、裂解并剪切LX-2细胞的细胞核，得到200-1000个碱基对的DNA片段，然后使用以下抗体进行免疫沉淀：正常兔IgG（Santa Cruz，sc-2027）、VDR（Santa Cruz，sc-1008）、SMAD3（Abcam，ab28379）和组蛋白H3（Abcam，ab1791）。对于ChIP-Re-ChIP，在第一次ChIP之后，使用10mM DTT从小球中洗脱免疫未经刺激的DNA-蛋白复合物，然后稀释100倍，再进行第二次ChIP。

ChIP-seq数据分析

该程序如前所述（Barish等人，2010年）。简而言之，使用Illumina Pipeline Suite v1.7将短DNA读取与人类hg18参考基因组（NCBI构建36.1）对齐。使用Bowtie对准器对读取进行对准，允许读取中出现多达2个不匹配。只有与基因组唯一对应的标签才被考虑用于进一步分析。随后，使用用于ChIP-Seq分析的软件套件HOMER进行峰值调用和基序分析。HOMER的方法（如下所述）已经实现，可以在http://biowat.ucsd.edu/homer/(Heinz等人，2010年). 每个独特位置的一个标签被认为可以消除ChIPSeq协议期间片段克隆扩增产生的峰值。峰值是通过在一个200 bp的滑动窗口内搜索标签簇来确定的，要求相邻簇之间的距离至少为1 kb。确定有效峰值的标签数量阈值被选为错误发现率<0.0001，这是通过使用随机标签位置重复峰值发现程序而根据经验确定的。峰需要具有比输入或IgG对照样品多至少4倍的标签（标准化为总计数）和相对于局部背景区域（10kb）多4倍的标签，以避免鉴定具有基因组重复或非局部结合的区域。通过识别最近的RefSeq转录起始位点，将峰值注释到基因产物。ChIP-Seq结果的可视化是通过将自定义轨迹上传到UCSC基因组浏览器实现的。人类表型分析使用GREAT（注释工具的基因组区域富集）在http://great.stanford.edu/.

微阵列数据分析

根据标准方案，使用RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）从原代大鼠或小鼠HSC中分离出总RNA。使用安捷伦生物分析仪评估RNA的完整性和质量，并根据标准Illumina方案制备用于与Illuminia大鼠或小鼠基因表达阵列杂交的RNA。使用Illumina GenomeStudio软件进行特征提取。使用VAMPIRE在http://sasquatch.ucsd.edu/吸血鬼/.

​

亮点

  • 维生素D受体（VDR）配体可逆转肝星状细胞（HSC）的活化
  • Vdr公司基因敲除小鼠自发发生肝纤维化
  • TGFβ1在HSC中释放一个隐匿的VDR池蛋白
  • VDR拮抗SMAD3/TGFβ1原纤维化基因的激活

补充材料

01

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02

单击此处查看。（15K，xlsx）

03

单击此处查看。（11K，xlsx）

04

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致谢

我们感谢C.Brondos和E.Ong的行政协助，J.Nery的DNA测序协助，C.Benner的HOMER软件协助，以及H.Juguilon和J.Alvarez的技术协助。N.D.由基因泰克基金会的博士后奖学金资助，G.D.B.由K08HL092298资助。这项工作得到了NIH（DK057978、HL105278、DK090962、HL088093、ES010337和CA014195）、澳大利亚国家卫生和医学研究委员会项目拨款512354和632886（C.L.和M.D.）以及赫尔姆斯利慈善信托基金会、塞缪尔·瓦克斯曼癌症研究基金会和Ipsen/Biomeasure的资助。R.M.E.和M.D.的部分资助是由娱乐产业基金会（SU2C-AACR-DT0509）的项目“挺身而出抗癌梦想团队转化癌症研究拨款”提供的。R.M.E是霍华德·休斯医学研究所的研究员，也是索尔克研究所分子与发育生物学的March of Dimes主席。

脚注

接入号码

完整数据集（ChIP-seq和微阵列）的GEO登录号为GSE38103标准.

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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