谷氨酸脱氢酶在调节自噬中有助于亮氨酸传感

亮氨酸以依赖GLUD1的方式抑制自噬

GLUD1的活性由氨基酸亮氨酸特异性调节，亮氨酸作为许多不同细胞类型中自噬的有效抑制剂已被广泛研究。在第一系列实验中，我们证实了亮氨酸对饥饿诱导的自噬的抑制作用(图2). 亮氨酸以浓度依赖的方式抑制营养饥饿时LC3-II的积累(图2A). 同样，亮氨酸阻止了GFP-LC3点状结构的积聚(图2B). 为了验证亮氨酸对自噬的抑制作用是特异性的，我们在氨基酸缬氨酸存在下重复饥饿实验。根据LC3-II积累的程度判断，亮氨酸对营养饥饿时自噬的抑制作用不能用缬氨酸来概括(图2A)和GFP-LC3 punta(图2B). 从这些结果中，我们得出结论，亮氨酸确实强烈抑制饥饿诱导的自噬体形成。

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图2。亮氨酸而非缬氨酸抑制自噬。(A类)免疫印迹分析在完整培养基或补充1、5或10 mM亮氨酸或缬氨酸的EBSS中培养的HeLa细胞中LC3-I和LC3-II水平4小时。ACTB免疫印迹用作负荷对照。使用Bio-1D定量软件测定LC3-II/ACTB比率。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）*p＜0.05。(B类)在完全培养基或添加10 mM亮氨酸或缬氨酸的EBSS中培养4 h的HeLa GFP-LC3细胞中GFP-LC2染色的代表性图像。在100个细胞上对每个细胞的GFP-LC3dots数量进行评分。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）*p<0.05。

接下来我们研究了亮氨酸对自噬的调节是否依赖于GLUD1的表达。为此，我们评估了亮氨酸对对照细胞和GLUD1缺失细胞自噬的影响(图3). 同样，在以营养为目标的对照细胞中，亮氨酸的存在足以抑制自噬体的生物合成，这是由GFP-LC3点的数量判断的(图3A). 一致的是，亮氨酸使自噬通量正常化，达到在完全培养基中培养的细胞中观察到的水平，如无LC3-II积累所示(图3B)和受损的SQSTM1降解(图3C). 最后，亮氨酸还可以防止饥饿诱导的长期蛋白质降解(图3D). 重要的是，我们发现GLUD1的敲除消除了亮氨酸对GFP-LC3点堆积的抑制作用(图3A). 自噬体的增加与持续的自噬流量和溶酶体活性有关，这是由LC3-II在巴非霉素a中的积累决定的₁-处理过的细胞(图3B)以及SQSTM1的降解(图3C)在GLUD1缺失的细胞中，亮氨酸无法再抑制其活性。同样，GLUD1缺失细胞中饥饿诱导的长寿命蛋白质降解率对亮氨酸的添加不敏感，但对3-MA仍敏感(图3D)是一种通过干扰PIK3C3（III类PtdIns3K）活性而抑制自噬体形成的抑制剂。³³总之，这些结果有力地表明，亮氨酸对自噬的抑制作用需要GLUD1。

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图3。敲除GLUD1可防止亮氨酸对自噬的抑制。(A类)在用对照（ct）siRNA（上直方图）或总账1siRNA（较低的直方图）和用完全培养基（CM）、饥饿培养基（EBSS）和饥饿培养基补充10 mM亮氨酸（EBSS+Leu）进行4小时处理。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）**p<0.01。(B类)免疫印迹分析转染对照（ct）siRNA或总账1siRNA培养72小时，并在补充有10 mM亮氨酸或缬氨酸的EBSS中培养4小时。如有指示，200 nM巴非霉素A₁（BAF）存在2 h以阻止LC3-II的溶酶体降解。ACTB的免疫印迹用作负荷对照。使用Bio-1D定量软件测定LC3-II/ACTB比率。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）**p<0.01。(C类)用对照（ct）siRNA转染HeLa细胞中SQSTM1水平的免疫印迹分析（上直方图）或总账1siRNA（低直方图），并在完全培养基或添加10 mM亮氨酸的EBSS中培养4小时。ACTB的免疫印迹用作负荷对照。使用Bio-1D定量软件测定SQSTM1/ACTB比率。列：平均值；棒材：扫描电镜（n=3）**p<0.01。(D类)测量转染对照（ct）siRNA的HeLa细胞中长寿命蛋白质降解情况（上western blot和柱状图）或总账1siRNA（低western blot和直方图）培养72小时，并在完全培养基或补充有10 mM亮氨酸或10 mM 3-甲基腺嘌呤（3-MA）的EBSS中培养。列：平均值；钢筋：SEM（n=3）*p<0.05。

亮氨酸需要GLUD1来促进MTORC1活性

在所有氨基酸中，亮氨酸不仅在抑制自噬方面最有效，而且还可以刺激MTORC1。因为亮氨酸显然需要GLUD1来抑制自噬，我们研究了这是否是因为它能够重新激活MTORC1通路。在这里，我们发现亮氨酸的存在，至少在部分上，保留了饥饿对照细胞中MTORC1的激活(图4). 然而，这种刺激作用在GLUD1被击倒后被消除。缬氨酸不控制自噬，在两种情况下都不能刺激MTORC1通路。这些结果表明，亮氨酸通过以GLUD1依赖的方式激活MTORC1，至少部分抑制了自噬。

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图4。GLUD1的敲除阻止亮氨酸对MTORC1信号传导的刺激。用对照（ct）siRNA或总账1siRNA并在完全培养基或添加10 mM亮氨酸或缬氨酸的EBSS中培养4小时。柱：平均值；钢筋：SEM（n=3）*p<0.05。

细胞培养

人宫颈癌细胞系HeLa在添加10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的RPMI 1640中生长，37°C，5%CO₂HeLa-GFP-LC3细胞系从英国剑桥大学Aviva M.Tolkovsky博士处获得，并在37°C、5%CO、添加10%胎牛血清和500μg/ml基因素的RPMI 1640中培养₂为了去除血清和氨基酸，细胞在厄尔平衡盐溶液中培养，用25 mM HEPES强化，pH 7.4。为了测试亮氨酸和缬氨酸对自噬的影响，除非另有说明，否则将细胞培养在厄尔平衡盐溶液中，其中含有25 mM HEPES加上10 mM亮氨酸或10 mM缬氨酸。

GFP-LC3测定

该检测在稳定转染大鼠GFP-LC3的HeLa细胞中进行。在分析之前，按照正文中所述对细胞进行处理。然后使用共焦显微镜（LSM 510/蔡司）通过使用Imaris 6.3软件计算每个细胞的GFP-LC3点数量来测量自噬。每个实验至少计数50到100个细胞。

蛋白质印迹分析

在10 mM Tris pH 7.4、1%十二烷基硫酸钠、1 mM钒酸钠中制备细胞提取物，在室温下用苯并核酸酶（Sigma，E1014）处理5分钟，并煮沸3分钟。将细胞提取物的部分（20μg）进行SDS-PAGE。电泳后，将蛋白质转移到蛋白质硝化纤维素转移膜（Amersham Biosciences，RPN303E）。在封闭膜之前（PBS中含有5%的脱脂乳蛋白/0.1%吐温-20），通过蓬索染色评估蛋白质负荷。然后使用制造商的方案用一级抗体培养印迹，然后用适当的辣根过氧化物酶结合二级抗体（抗鼠IgG-HRP，Bio-Rad，170-6516；抗兔IgG-HRP，Amersham，NA9340V）培养印迹。使用化学发光底物（Millipore）显示免疫染色蛋白。免疫印迹的密度分析通过Bio-1D软件进行量化。实验至少重复了三次，并显示了典型的放射自显影。

长寿命蛋白质降解分析

该分析改编自Bauvy等人。⁵²siRNA转染72小时后，HeLa细胞在37°C下用0.2μCi/ml l-[¹⁴C] 完全培养基中的缬氨酸（添加10%胎牛血清和25 mM HEPES的RPMI1640）。在放射标记期结束时，用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水清洗细胞三次。然后将细胞在补充有10 mM未标记缬氨酸的完整培养基中培养1 h（短寿命蛋白质降解的追逐前阶段）。然后用完全培养基或厄尔平衡盐溶液代替培养基，其中25mM HEPES（饥饿培养基）补充或不补充10mM亮氨酸。再继续培养4小时（追踪期）。将来自4h培养基的细胞和放射性标记蛋白沉淀在4°C下最终浓度为10%（vol/vol）的三氯乙酸中。沉淀蛋白通过600×g离心10分钟从可溶性放射性中分离出来，然后溶解在0.5 ml 0.2 N NaOH中。通过液体闪烁计数测定放射性。蛋白质降解是通过将从细胞和培养基中回收的酸溶性放射性除以细胞和培养液中沉淀蛋白质中所含的放射性来计算的。

用小干扰RNA转染细胞

在人类中，有两种基因编码GLUD：总账1和GLUD2公司.总账1发生在所有哺乳动物中，但GLUD2公司仅存在于人类，仅在大脑（星形胶质细胞）和睾丸（支持细胞）中表达。⁵³出于这个原因，我们决定进行一些实验，在这些实验中，小干扰RNA可以对抗总账1使用了（Invitrogen）。Eurogentec（比利时Seraing）合成了对照siRNA。在6孔板中培养的细胞通过使用寡聚体试剂（Invitrogen，12252011）以最终浓度200nM转染siRNA。然后，在添加5%胎牛血清之前，将细胞在37°C下培养8小时，然后再静置72小时。然后，按照文中所述处理细胞，并进行蛋白质印迹分析、长期蛋白降解或GFP-LC3分析。

ROS生成的测量

用对照siRNA或总账1将siRNA胰蛋白酶化并用培养基洗涤两次，培养基包括132 mM NaCl、20 mM HEPES、5 mM KCl、1.2 mM KPi、1 mM MgCl2、1.3 mM CaCl2和0.2%（w/v）透析的BSA（最终pH 7.4）。细胞以0.5×10的浓度重新悬浮⁶/ml，并在不存在或存在完整氨基酸（AA）混合物或含有亮氨酸（1 mM）和谷氨酰胺（2 mM）组合的情况下，在37°C下预培养45分钟。由100倍非必需AA储备溶液（Gibco/Initrogen，11140）和50倍必需AA储备溶液（Gibco/Initrogen，11130）制备25倍浓缩的AA混合物，其中添加谷氨酰胺（20mM）和HEPES（50mM），并加入足够的NaOH以中和该酸性混合物的pH。在预培养加或减AA后，将细胞（在300µl等分溶液中）转移到含有1µl DHE（1.5 mM，溶解在DMSO中）的试管中，或在随后的实验中转移到含有一µl MitoSOX（300µM，溶解于DMSO）的试管。在FACS Calibur（BD BioSciences）上分析样品而不洗涤，6000个事件的结果表示为红色（FL3）通道中的平均荧光强度（MFI）。线粒体SOX（线粒体超氧化物产生的一种测量方法）的红色荧光增加⁵⁴)证明在至少90分钟的时间内呈线性。分析中排除了细胞碎片和显示非常高红色荧光的细胞（<5%的总人口）。高MitoSox染色似乎是由于与死亡细胞的DNA结合，如Sytox Green（Invitrogen，S7020）双重染色的对照实验所示。

本文旨在纪念我们两人（A.J.M.，A.J.V.）的老师Joseph M.Tager教授，他于2011年2月去世。他在20世纪60年代对谷氨酸脱氢酶的研究为我们的观点奠定了基础，即这种酶可能以不同于其传统氨代谢功能的方式影响信号传递。

作者感谢S.P.J.Albracht博士分享其关于线粒体呼吸链，特别是复合物I在活性氧生成中的作用的观点。作者还感谢M.P.Murphy博士（英国剑桥市MRC）对MitoQ和V.Keizer的亲切馈赠和专家建议，感谢她对ROS测量的贡献。

P.Codogno实验室的工作得到了国家医学研究所（INSERM）的机构资助、国家医学研究院（ANR）和国家癌症研究所（INCa）的资助。