DNA损伤通过NF-κB依赖机制加速骨老化

ERCC1缺乏导致骨形成减少和破骨细胞生成增强

骨稳态由两个紧密耦合但相反的生物过程决定：骨形成和骨吸收(26). 免疫印迹分析显示，ERCC1在WT小鼠的成骨细胞和破骨细胞中均表达。(补充图2A至C). 为了首先确定ERCC1缺陷是否影响骨形成，通过钙黄绿素双标记对8周龄儿童进行动态组织形态计量学分析错误代码1^−/Δ小鼠和WT的同窝伙伴，以测量新的骨基质沉积。错误代码1^−/Δ与WT同窝小鼠相比，小鼠的骨形成率显著降低(图2A). 这与他们减少的Ob一致。N/B.pm与WT室友相比(图1D，右侧）。接下来，我们询问ERCC1缺乏是否会影响骨吸收（破骨细胞生成）。8周龄WT和Ercc1型^−/Δ对小鼠进行破骨细胞标志物抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色。Ercc1型^−/Δ与WT小鼠相比，小鼠整个胫骨的TRAP染色显著增加(图2B，左）。这与增加的Oc一致。S/B和Oc。海绵体中的N/BPm错误代码1^−/Δ胫骨与WT的比较(图2B，右侧）。破骨细胞生成增加。S/BS和Oc。在中也观察到N/BPm错误代码1^−/−老鼠。综上所述，这些结果表明，骨形成和骨吸收存在解偶联，ERCC1缺陷小鼠的骨形成和吸收增强。

破骨祖细胞原代骨髓单核细胞（pBMM）是从错误代码1^−/Δ和WT室友。将pBMM暴露于破骨介质中，诱导其进行体外破骨形成(27). TRAP阳性（TRAP⁺)多核细胞（定义为每个细胞有3个或更多核的细胞）被视为成熟破骨细胞。错误代码1^−/Δ培养物中破骨细胞的数量明显多于WT培养物(图2D). 此外，错误代码1^−/Δ与WT pBMM相比，pBMM表现出破骨细胞分化标志物的mRNA表达增强，如组织蛋白酶K（CTSK）、活化T细胞的核因子、细胞质C1（NFATC1）、核因子κB受体活化剂（RANK）和TRAP(图2E). 最后，错误代码1^−/Δ与WT pBMM相比，pBMM在体外表现出更大的吸收牛骨的能力(图2F). 这表明ERCC1缺陷的pBMM更容易通过细胞自主机制产生破骨细胞。

ERCC1缺陷影响成骨细胞分化

接下来，我们询问DNA修复缺陷的ERCC1小鼠，骨沉积所需的成骨细胞系缺陷是否也会导致骨质疏松。我们测量了5个月大的椎骨中成骨细胞标志物的mRNA表达错误代码1^−/Δ和WT小鼠。Osterix的表达(奥斯克斯)成骨细胞分化和骨唾液蛋白所需的转录因子(Bsp公司)，一种骨细胞外基质糖蛋白(26)，在年显著减少错误代码1^−/Δ小鼠与年龄匹配的WT小鼠的比较(图3A). 这表明DNA修复缺陷影响成骨细胞分化。

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图3

ERCC1缺乏导致间充质干细胞萎缩并损害成骨细胞分化

（A） 成骨细胞标记物Osx和Bsp在5月龄（n=4）WT（+/+）和错误代码1^−/Δ老鼠。（B） 对WT（+/+）小鼠和小鼠分离的骨髓细胞进行骨髓CFU-F分析（苏木精染色）错误代码1^−/Δ室友。对CFU-F菌落进行量化（n=3）。（C） 8周龄WT（+/+）和WT分离的骨髓细胞的骨髓CFU-ALP染色错误代码1^−/Δ室友。对CFU-ALP菌落进行量化（右侧面板，n=3）。（D） 对8周龄WT（+/+）和WT分离的骨髓细胞进行骨髓CFU-OB分析（von-Kossa染色）错误代码1^−/Δ室友。比例尺，100μm。（E） 成骨细胞标记物在WT（+/+）小鼠贴壁BMSCs表达的qRT-PCR分析错误代码1^−/−室友（n=3）。（F） WT（+/+）和错误代码1^−/−BMSCs在规定时间段内处于成骨诱导条件下（n=3）。所有实验都独立进行了三次，并显示了具有代表性的数据。所有数值均显示为平均值±SEM。*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。

据报道，ERCC1缺乏会减少造血储备(13). 因此，我们假设ERCC1缺陷小鼠的成骨祖细胞数量会减少。成骨祖细胞是粘附BMSCs的一个克隆形成亚群，称为集落形成单位成纤维细胞（CFU-Fs）。事实上错误代码1^−/Δ与WT小鼠相比，小鼠的CFU-Fs含量显著减少(图3B). 此外，BM错误代码1^−/Δ与WT同窝小鼠相比，成骨碱性磷酸酶阳性集落（CFU-ALP+）数量显著减少(图3C). WT小鼠的BM细胞培养物自发形成矿化结节，模拟体外骨形成，而从错误代码1^−/Δ老鼠有缺陷(图3D). 这些结果表明，DNA修复缺陷的骨髓中成骨祖细胞数量减少错误代码1突变小鼠。

接下来，我们询问这是否是由于骨髓基质干细胞未能向成骨细胞系分化所致。骨髓间充质干细胞从错误代码1^−/Δ和WT小鼠，以相同密度电镀，并在成骨分化培养基中培养3周。在每周的时间点，收集细胞，并通过qRT-PCR测量几种成骨细胞标记物的表达。的表达式奥斯克斯,阿尔卑斯山和附件4和第1列BMSC显著减少错误代码1^−/Δ小鼠与WT小鼠的比较，至少在一个时间点(图3E). 此外，ALP染色在分化的错误代码1^−/Δ成骨诱导2周和3周后的BMSCs培养(图3F). 这些结果表明成骨细胞分化Ercc1型^−/Δ骨髓间充质干细胞严重受损，这可能导致成骨祖细胞数量减少错误代码1^−/ΔBMSC人群(图3B至3D).

ERCC1缺乏导致原代成骨细胞和BMSCs持续DNA损伤和细胞衰老

ERCC1在DNA修复中起着重要作用。因此，我们预测ERCC1缺陷会导致骨组织中DNA损伤的积累。ATM是DNA损伤的近端效应器，尤其是DSB(28). ATM激活后，磷酸化几个下游底物，包括H2AX（核小体组蛋白变体），以促进检查点激活和DNA修复。磷酸化H2AX（γ-H2AX）迅速定位于DSB并形成明显的病灶，这是持续DNA损伤和细胞衰老的特征(29).错误代码1^−/−与WT细胞相比，原代成骨细胞表现出更多且更明显的γ-H2AX病灶(图4A). 骨表面衬里细胞的γ-H2AX免疫染色也增加错误代码1^−/Δ小鼠比WT对照组(图4B). 此外，骨表面衬里细胞磷酸化ATM底物的免疫组织化学染色增强，表明激活的DNA损伤反应(30)英寸错误代码1^−/Δ骨组织与野生动物的比较(图4C). 这些数据支持ERCC1缺陷导致骨骼组织持续DNA损伤的结论。

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图4

ERCC1缺乏导致成骨细胞DNA损伤增加和细胞衰老

（A） WT（+/+）和WT培养物中γ-H2AX的免疫荧光染色错误代码1^−/−初级颅骨成骨细胞。比例尺，20μm。（B） 8周龄WT（+/+）小鼠胫骨γ-H2AX染色错误代码1^−/Δ室友。比例尺，50μm。（C） 8周龄WT（+/+）小鼠胫骨中p-ATM的染色错误代码1^−/Δ同窝的人。比例尺，100μm。（D） p16染色^{INK4A（墨水）}2周龄WT（+/+）和Ercc1型^−/−老鼠。比例尺，50μm。（E） 8周龄WT（+/+）和错误代码1^−/Δ室友。比例尺，50μm。（F） Western blot分析显示5月龄WT（+/+）小鼠椎体提取物中cyclin D1的表达错误代码1^−/Δ室友。（G） WT（+/+）和错误代码1^−/−初级颅骨成骨细胞。（H） 2周龄WT（+/+）小鼠颅骨成骨细胞的Ki67染色错误代码1^−/−通道3（上面板）和通道6（下面板）的室友。定量Ki67阳性细胞的百分比（右侧面板）。比例尺，100μm。（一） 4周龄WT（+/+）小鼠骨髓间充质干细胞的SA-β-gal染色错误代码1^−/Δ第二通道的室友。比例尺，50μm。阳性细胞百分比被量化（右侧面板，n=4）。所有实验均独立进行了三次，并显示了具有代表性的数据。数值显示为平均值±SEM。***p<0.001。

持续的DNA损伤会导致细胞过早的复制性衰老(29,31). 测试成骨细胞是否错误代码1^−/Δ小鼠经历了过早衰老，我们检测了几种衰老标记物在骨组织中的表达。如8周龄胫骨的免疫组织化学染色所示Ercc1型^−/Δ和WT小鼠错误代码1^−/Δ小鼠p16表达增加^{INK4A（墨水）}(图4D)，一种与细胞衰老相关的细胞周期素依赖性激酶抑制剂(32). 此外，细胞增殖标记物Ki67的表达(33)，年减少错误代码1^−/Δ小鼠与野生动物的比较(图4E). 最后，Western blot分析显示错误代码1^−/Δ与WT动物相比，小鼠的cyclin D1表达显著降低(图4F). 总之，这些数据表明骨组织和相关细胞的细胞衰老加剧，细胞增殖减少错误代码1^−/Δ老鼠。

为了证实这些体内观察结果，从WT和错误代码1^−/−对小鼠进行体外测定。尽管电镀密度相同，错误代码1^−/−与WT细胞相比，成骨细胞在每一代都显著减少了细胞数量(图4G). 在通道4处，错误代码1^−/−成骨细胞停止增殖(图4G)并获得衰老的形态学特征，包括增大的细胞体和细胞核（数据未显示），而WT成骨细胞继续增殖。在通道3处，7.4±0.4%错误代码1^−/−与28.4±1.5%的WT细胞相比，原代成骨细胞的增殖标记物Ki67呈阳性染色。在第6代，在错误代码1^−/−培养，而WT原代成骨细胞的12.9±1.8呈阳性染色(图4H). 据此Ercc1型^−/−与WT pBMSC相比，衰老相关β-半乳糖苷酶（SAβ-Gal）染色阳性的pBMSC(图4I). SAβ-Gal染色增加的程度与对照组相似错误代码1^−/−原代成骨细胞与WT原代成骨细胞的比较（数据未显示）。这些数据表明，DNA修复缺陷的成骨细胞和BMSC过早衰老。总之，数据支持这样的结论，即成骨祖细胞的过早衰老，除了分化缺陷外，也会导致ERCC1缺陷小鼠的骨质疏松。

ERCC1缺乏在BMSCs和成骨细胞中触发衰老相关分泌表型（SASP），创造有利于破骨细胞生成的炎症微环境

持续的DNA损伤信号促进衰老相关炎性细胞因子的分泌，称为衰老相关分泌表型（SASP），以大量IL-6分泌为特征(29). 由于ERCC1缺陷小鼠的成骨细胞系表现出持续的DNA损伤，我们假设这会诱导SASP，从而在骨骼中创建炎症微环境。为了支持这一点，错误代码1^−/ΔqRT-PCR检测到骨髓间充质干细胞显著增加了IL-6 mRNA的表达(补充图3A). 此外，与WT细胞相比，这些细胞也分泌了更高水平的IL-6(图5A). 一直以来，白细胞介素-6的水平在错误代码1^−/Δ小鼠与野生动物的比较。由于IL-6具有破骨作用(34)，我们还检测了调节破骨细胞形成的其他炎症细胞因子，包括TNFα（肿瘤坏死因子α）、RANKL和OPG（骨保护素），一种RANKL拮抗剂(35). 8周龄儿童脊椎的RT-PCR分析错误代码1^−/−小鼠TNFαmRNA表达上调2倍以上(补充图3B). 在两组患者的血清中均检测到TNFα分泌增加错误代码1^−/Δ小鼠和条件培养基错误代码1^−/ΔBMSC与WT同行的比较(图5B和C). 此外，RANKL在错误代码1^−/Δ与野生动物相比，脊椎增加了4倍以上，而OPG表达减少了70%(补充图3B)，导致RANKL与OPG的比率增加11倍，OPG是BMSC破骨潜能的指标。RANKL的mRNA表达也在Ercc1型^−/ΔqRT-PCR测定的原代成骨细胞与WT细胞的比较(补充图3C). 与此一致，错误代码1^−/−与野生动物相比，小鼠的血清RANKL升高了2.8倍，血清OPG降低了30%(图5B). 最后，慢病毒转导错误代码1^−/Δ小鼠骨髓间充质干细胞错误代码1显著降低IL-6和TNFα分泌，使其水平与WT BMSCs相当(图5C)支持DNA损伤修复失败导致成骨细胞系中细胞衰老和SASP的结论。

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图5

ERCC1缺乏触发SASP并诱导有利于骨吸收的炎症微环境

（A） 白细胞介素-6在WT（+/+）和BMSCs条件培养液中分泌的ELISA分析错误代码1^−/Δ老鼠。BMSCs分别与成骨培养基培养0或7天。**经Student t检验，p<0.01。（B） ELISA分析WT（+/+）和错误代码1-缺陷小鼠（n=9）。*经Student t检验，p<0.05、**p<0.01和**p<0.001。（C） 白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α分泌的ELISA分析错误代码1^−/Δ用表达空载体（EV）或错误代码1与+/+GFP相比，*p<0.05和**p<0.01，与错误代码1^−/Δ用EV.（D）pBMMs-BMCs共培养分析转导的细胞。来自WT的pBMSC（+/+）和错误代码1^−/Δ用表达空载体（EV）或Flag-m的慢病毒转导小鼠Ercc1型然后将感染的BMSCs与WT（+/+）BMMs在破骨分化培养基中共培养7–8天，然后对TRAP+单核细胞（MNCs）进行TRAP染色。比例尺，50μm.**与具有EV表达的WT（+/+）BMSCs相比p<0.01，与具有EV表达的WT（+/+）BMSCs相比#p<0.05错误代码1^−/ΔEV表达的BMSCs。所有实验均独立进行了三次，并显示了具有代表性的数据。所有数值均显示为平均值±SEM。

为了确定细胞衰老和SASP是否有助于破骨细胞生成，将原代小鼠WT BMM与原代WT或错误代码1^−/δ,BMSC持续7天。TRAP染色显示错误代码1^−/Δ骨髓间充质干细胞诱导大量破骨细胞的形成(图5D)与WT BMSCs相比，每个破骨细胞的核数更多（数据未显示），尽管事实上错误代码1^−/ΔBMSC（数据未显示）。小鼠的再表达错误代码1在中错误代码1^−/Δ骨髓间充质干细胞降低了其诱导破骨细胞生成的增强能力(图5D). 这些数据提供了直接的实验证据，证明ERCC1缺陷小鼠的BMSCs也通过非细胞自主机制促进破骨细胞生成。

NF-κB在DNA修复缺陷小鼠的成骨细胞和破骨细胞中被激活

在证明了未修复DNA损伤促进过早骨质疏松症的细胞机制后，我们接下来研究了潜在的分子事件。NF-κB信号转导的诱导代表了与幼年动物相比，老年动物各种组织和细胞中常见的分子变化，如肝、脑、肾、骨等(36–38). 来自老龄（28个月龄）WT小鼠的pBMSCs增强了NF-κB活性，TNFα治疗后细胞裂解物中磷酸化p65、磷酸化IκBα和磷酸化IKKα/β的水平升高证明了这一点(补充图4A). 此外，在没有TNFα治疗的情况下，这些细胞中的核p65的免疫染色增强(补充图4B)与2周龄小鼠的pBMSCs进行比较。类似地，来自前体细胞的原代成骨细胞Ercc1型^−/−小鼠IκBα磷酸化增强(图6A)以及核定位和NF-κB p65亚基水平的增加(图6B)与WT窝友的细胞相比。此外，在pBMSCs中检测到磷酸化p65蛋白水平增加Ercc1型^−/−小鼠与WT BMSCs的比较(图6C).

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图6

NF-κB在骨质疏松ERCC1缺陷小鼠的原代成骨细胞、BMSCs和原代骨髓巨噬细胞中被激活

（A） Western blot分析显示从1周龄WT（+/+）和错误代码1^−/−诱导成骨小鼠分别为0天和7天。β-actin作为负荷控制。（B） 1周龄WT（+/+）和错误代码1^−/−老鼠。用TNFα处理细胞0分钟（上面板）或60分钟（下面板）。比例尺，50μm。（C） Western blot分析显示WT（+/+）和错误代码1^−/Δ具有7天成骨诱导的原代BMSCs。β-actin作为负荷控制。（D） Western blot分析显示WT（+/+）和错误代码1^−/ΔpBMSC。（E） Western blot分析显示WT（+/+）和错误代码1^−/Δ主BMM。（F） Western blot分析显示WT（+/+）和错误代码1^−/Δ主BMM。细胞在增殖培养基中培养3天，然后在收获前用RANKL处理指定的时间段。β-actin作为负荷控制。所有实验均独立进行了三次，并显示了具有代表性的数据。

接下来，我们确定了导致ERCC1缺陷小鼠NF-κB信号增加的分子变化。鉴于IKK是负责IκBα磷酸化和随后NF-κB信号激活的上游激酶，我们测量了磷酸化和总IKKα、β和γ亚型的水平。有趣的是，磷酸化和总IKKα和β在Ercc1型-缺陷细胞和WT细胞（数据未显示）。然而，来自Ercc1型^−/Δ与WT小鼠相比，小鼠丝氨酸85处磷酸化IKKγ水平增加(图6D). 与这些发现一致，pBMSCs(图6D)和骨组织(图4C)来自错误代码1-缺陷小鼠表现出ATM的水平和活性增加，ATM是一种上游激酶，在丝氨酸85处磷酸化IKKγ以应对基因毒性应激。最后，增强丝氨酸85处IKKγ的磷酸化(图6E)导致基线和RANKL诱导的NF-κB信号活性水平升高(图6F)在中观察到错误代码1^−/ΔBMM公司。综上所述，这些数据表明，ERCC1缺陷导致成骨细胞和破骨细胞中NF-κB活性增加，这可能是通过ATM依赖性增加IKKγ活性来应对未修复的内源性DNA损伤。

p65亚基杂合缺失可挽救骨质疏松症

在ERCC1缺陷小鼠的成骨细胞和破骨细胞中，NF-κB活性均增加，我们接下来询问这种活性是否与骨骼缺陷有关。首先，我们观察到，p65在稳定的小鼠成骨细胞系MC4中过度表达，会损害其对抗坏血酸的分化反应，这反映在成骨细胞标记物Osterix、碱性磷酸酶（Alp）和Osteocalcin（OCN）的表达显著减少(补充图5A)以及碱性磷酸酶染色减少(补充图5B). 接下来，我们培育了ERCC1缺陷小鼠，这些小鼠对NF-κB的p65亚单位具有足够的单倍体，这是一种以前用于表征NF-κ）B在Duchenne型肌营养不良症中作用的策略(39). 年龄和性别匹配的WT胫骨和腰椎的μQCT，错误代码1^−/Δ和错误代码1^−/Δ;第65页^+/负极小鼠发现p65单倍体不足部分但显著地缓解了骨质疏松症错误代码1^−/Δ老鼠(图7A、B和C). 明确地，错误代码1^−/Δ;第65页^+/负极与Ercc1型^−/Δ小鼠，其将BV/TV的41.7%（椎骨）或59.8%（胫骨）挽救到WT小鼠的正常水平(图7B). 这个错误代码1^−/Δ;第65页^+/负极与对照组相比，小鼠的小梁数量和厚度显著增加，小梁空间减少错误代码1^−/Δ老鼠(图7B). 此外，组织形态计量学分析表明第65页单倍体不足在很大程度上纠正了Ob的下降。N/B.Pm和破骨细胞生成增强（Oc.N/B.Pm和Oc表面增加）见于错误代码1^−/Δ老鼠(图7C). 这些结果表明，在加速衰老的小鼠模型中，NF-κB信号的基因减少可减轻骨质疏松症。

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图7

杂合性缺失第65页亚单位治疗骨质疏松症

来自15周龄WT（+/+）的胫骨（上片）和腰椎（下片）的（A–C）μQCT图像（A）和组织形态计量学分析（B&C），错误代码1^−/Δ,和错误代码1^−/Δ;第65页^+/负极年龄匹配的小鼠（n=3）。（D） 15周龄WT（+/+）分离的BMSCs衰老相关β-半乳糖苷酶染色的视觉（左）和定量（右）显示，错误代码1^−/Δ和Ercc1^−/Δ第65页+/−第2代小鼠（n=4）。比例尺，100μm。（E） p65单倍体不足对10周龄儿童血清IL-6（右）和TNFα（左）水平的影响错误代码1^−/Δ小鼠（n=3），通过ELISA测定。（F） 骨髓CFU-F检测WT（+/+）和错误代码1^−/Δ, 错误代码1^−/Δ第65页^+/负极老鼠。对结节数量进行量化（右侧面板，n=3）。（G） WT的骨髓CFU-ALP测定（+/+），错误代码1^−/Δ,和Ercc1型^−/Δ第65页^+/负极老鼠。对结节数量进行量化（右侧面板，n=4）。（H） 从3周龄WT（+/+）分离的BMSCs的ALP染色，错误代码1^−/−,错误代码1^−/− 第65页^+/负极诱导成骨7或14天的小鼠（n=3）。（一） 从15周龄WT（+/+）分离的pBMM的TRAP染色的视觉和定量表现，错误代码1^−/Δ,和错误代码1^−/Δ第65页^+/负极老鼠。细胞在破骨培养基中培养6天（n=5）。比例尺，50μm。实验至少独立进行了三次，并显示了具有代表性的数据。所有数值均显示为平均值±SEM。与WT相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，与错误代码1^−/Δ.

为了阐明p65单倍体不足如何拯救ERCC1缺陷小鼠的骨质疏松症，我们测量了从年龄匹配的WT、，错误代码1^−/Δ和错误代码1^−/Δ;第65页^+/负极老鼠。SAβ-Gal染色显示，p65单倍体不足可消除BMSCs的细胞衰老(图7D). 然而，Ki67染色在错误代码1^−/−和错误代码1^−/−;第65页^+/负极BMSC(补充图6A).第65页单倍体不足使SASP因子IL-6和TNFα升高的血清水平完全恢复到与野生动物相当甚至更低的水平(图7E). 此外，错误代码1^−/Δ;第65页^+/负极BMSCs形成的CFU-Fs和CFU-ALP+菌落明显多于Ercc1型^−/Δ小鼠，尽管仍明显少于野生型骨髓基质干细胞的菌落(图7F和G). 一致地，碱性磷酸酶染色显示p65的hapoinfufficiency显著挽救了受损的成骨细胞分化Ercc1型^−/−BMSC(图7H). 这些数据表明，p65单倍体不足部分缓解了ERCC1缺陷对成骨细胞系的抑制作用。最后，我们观察到NF-κB的激活也有助于促进破骨细胞的生成错误代码1^−/Δ小鼠骨髓基质干细胞的TRAP染色错误代码1^−/Δ;第65页^+/负极与对照组相比，小鼠破骨细胞形成减少错误代码1^−/ΔBMM公司(图7I). 综上所述，这些结果支持了一种模型，即NF-κB通过驱动细胞自主变化来促进骨吸收增加和骨形成减少，从而在ERCC1缺陷小鼠中介导骨质疏松症。

我们感谢G.David Roodman博士（印第安纳大学）和Kenneth Patrene先生（匹兹堡大学）进行了骨μCT分析，Tao Chen博士（匹兹伯格大学）提供了慢病毒构建物，以及Matthew H.Pham和Andrew Stypula博士（匹兹堡大学）准备了组织切片。我们感谢弗吉尼亚州匹兹堡医疗系统提供公共设施和退伍军人事务部的支持。这项工作得到了NIH/NIDCR（RO1DE017439）、NIH/NCI（R21CA161150）、H.O.多发性骨髓瘤研究基金会（MMRF）肿瘤微环境奖、H.C.B.的R01AR055208、AG033907、AR051456、NS058451和P.D.R.的AG024827、ES016114、P30AG024817、P30CA047904和L.J.N的Ellison医学基金会AG-NS-03-05的支持，以及脊柱侧凸研究学会（SRS）向Q.C颁发的新研究员拨款。所表达的意见不是退伍军人事务部或美国政府的意见。