组蛋白脱甲基酶Jmjd3依次与转录因子Tbx3和Eomes结合，驱动内胚层分化

Tbx3招募Jmjd3到增强子区域脱中胚蛋白轨迹

调查监管因素是否可能参与从脱中胚蛋白启动子在分化过程中，我们对组蛋白3赖氨酸4（H3K4me1）的单甲基化和组蛋白3赖氨酸27（H3K27ac）的乙酰化进行了表观基因组分析。我们先进行ChIPs，然后进行高通量测序（ChIP-Seq），以确定这些标记的富集情况。我们确定了脊椎动物中保守的转录起始位点上游7kb的区域(补充图2A)并以H3K27me3和H3K4me1标记(图2A-C). 这种染色质特征通常存在于发育调节因子中，这些发育调节因子在ES细胞中是不活跃的，但在谱系规范期间处于激活状态(Creyghton等人，2010年;Rada Iglesias等人，2010年;Zentner等人，2011年). H3K27ac在脱中胚蛋白在分化过程中增强后，H3K27me3标记显著降低(图2A、C)与该增强子元素的激活相一致(Rada-Iglesias等人，2010年). 接下来我们研究了负责去除H3K27甲基化的酶是否被招募到脱中胚蛋白分化过程中的增强子。ChIP分析显示，Jmjd3在脱中胚蛋白与ES细胞相比，分化细胞中的增强子(图2E;补充图2B和C). Jmjd3绑定特定于脱中胚蛋白在中未检测到增强子和结合脱中胚蛋白近动机区(补充图2C). 这些结果表明，Jmjd3的占有率增加与H3K27甲基化在脱中胚蛋白增强剂。

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图2

Tbx3和Jmjd3在物理上相互关联并共同占据脱中胚蛋白轨迹。(A类)一个富含H3K4me1和H3K27ac的活性增强子区域被鉴定为脱中胚蛋白（红色方框）。H3K4me1和H3K27ac富集剖面的基因组浏览器表示脱中胚蛋白ES细胞和分化细胞中的位点。(B类——D类)组蛋白修饰在增强子区的富集脱中胚蛋白被改变以反映增强子的准备激活状态。H3K4me1的富集度不变(B类)，H3K27me3降低(C类)H3K27ac增加(D类)在脱中胚蛋白分化的mES细胞中的增强子。在ES细胞和D1–D2分化细胞中使用一对引物进行ChIP实验脱中胚蛋白（En）和阴性对照区（Neg）。(E类)Jmjd3推广脱中胚蛋白增强剂激活。ChIP分析显示Jmjd3与脱中胚蛋白D1–D2分化细胞中的增强子。(F类,G公司)Tbx3而非Nanog与脱中胚蛋白与ES细胞相比，分化细胞中的增强子区（红盒）显著增加。(F类)基因组浏览器表示Nanog和Tbx3在脱中胚蛋白使用ChIP-seq分析ES细胞和分化细胞中的位点。(G公司)ChIP分析显示Tbx3结合增加脱中胚蛋白D1-D2分化期间的增强子。(H（H）)Tbx3和Jmjd3在早期分化过程中具有物理相关性。用Tbx3抗体共免疫沉淀D2-分化细胞，然后用Jmjd3抗体进行western blot。还显示了反向和自交免疫沉淀。添加DNAse1处理以测试相互作用是否独立于DNA。IgG作为阴性对照。(我,J型)与小鼠细胞类似，TBX3和激活的JMJD3绑定到EOMES公司D1-分化hES细胞中的增强子。使用ChIP分析测量TBX3和JMJD3的富集度。ChIP数据为平均值±标准误差(n个=2–3).

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源数据图2^{（340万tif）}

越来越多的人认识到调节ES细胞多能性的基因也参与生殖层谱系承诺(Loh和Lim，2011年;汤姆森等人，2011年;Wang等人，2012年). 我们假设ES细胞因子可以与脱中胚蛋白并对一些ES细胞因子进行表观基因组分析(图2F). 先前的研究表明，另一种多能性因子Nanog与脱中胚蛋白增强剂(Teo等人，2011年). 我们的分析证实，Nanog与脱中胚蛋白ES细胞中的增强子。我们还鉴定了Tbx3，它是ES细胞中表达的主要T-box家族成员，与脱中胚蛋白分化过程中的增强子(图2F和G;补充图2D和E). ChIP分析证实Tbx3与分化细胞中的Eomes增强子区域结合(图2G). 我们的分析还表明，与Jmjd3和Tbx3不同，Nanog已经绑定到脱中胚蛋白在EB分化过程中，ES细胞中的增强子和Nanog结合减少(补充图2F). 在EB分化过程中Jmjd3和Tbx3的招募表明，这些因素可能与脱中胚蛋白增强子区域。用Tbx3抗体与Jmjd3抗体进行免疫印迹共沉淀EB，结果表明Tbx3-与Jmjd3共沉淀(图2H). 用Jmjd3抗体进行反向共免疫沉淀，然后用Tbx3抗体进行免疫印迹，证实了这两种蛋白之间的相互作用(图2H). 此外，当细胞裂解物用DNase1处理时，相互作用仍然存在(图2H)完全消除了DNA的存在(补充图2G). 这些结果表明，Tbx3–Jmjd3相互作用与DNA无关。接下来，我们调查了TBX3和JMJD3的招募是否EOMES公司在hES分化过程中也出现增强子。使用ChIP分析EOMES公司增强子在分化早期显示TBX3和JMJD3的占用率增加(图2I和J). 这些分析表明，Jmjd3和Tbx3在物理上是相关联的，并且共同占据了脱中胚蛋白在分化的早期阶段增强子。

Tbx3和Jmjd3共占脱中胚蛋白基因座

进一步调查Jmjd3和Tbx3是否相互需要脱中胚蛋白激活，我们使用短发夹RNA（shRNA）介导的Jmjd3号机组和Tbx3型(补充图3A和B). EB形成的ChIP分析Jmjd3号机组-击倒ES细胞显示Tbx3募集到脱中胚蛋白增强剂被阻止(图3A). 相反，Jmjd3没有绑定到脱中胚蛋白EB中的增强子由Tbx3型-击倒ES细胞(图3B)，强化了Tbx3和Jmjd3相关的观点。与野生型ES细胞不同，Jmjd3号机组-空ES细胞激活失败脱中胚蛋白分化过程中的表达(图3C;补充图3C). 同样，Tbx3型使用shRNA击倒(图3D)或SMARTPool siRNA(补充图3D和E)阻止脱中胚蛋白分化过程中激活。这些结果表明，Jmjd3和Tbx3都绑定到脱中胚蛋白需要增强子脱中胚蛋白转录激活。我们还注意到H3K27me3在脱中胚蛋白当Jmjd3-null细胞用于分化时，增强子不受影响(图3E). 这表明Jmjd3的酶活性对Eomes的转录激活至关重要。为了解决这个问题，我们过表达了JMJD3野生型或JMJD3-H1350A，这是一种导致去甲基化酶活性缺乏的点突变(Sen等人，2008年)在Jmjd3空单元格中。WT-Jmjd3的表达足以挽救Eomes的转录激活。相反，JMJD3-H1350A的表达未能激活Eomes转录(图3F和G). 这些实验表明，Jmjd3的脱甲基酶活性对Eomes在分化过程中的转录激活至关重要。接下来我们研究了Jmjd3–Tbx3复合体是否与脱中胚蛋白增强子影响了来自脱中胚蛋白发起人。ChIP分析显示，RNAP-Ser2P在脱中胚蛋白启动子在缺乏Tbx3的情况下被阻止(图3H). 这些结果表明，Tbx3–Jmjd3复合物修饰了脱中胚蛋白增强剂，促进来自脱中胚蛋白发起人。

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图3

脱中胚蛋白基因激活依赖于Jmjd3去甲基酶活性，并涉及增强子-启动子DNA环。(A类,B类)Tbx3和Jmjd3是绑定到脱中胚蛋白增强剂。(A类)ChIP分析在脱中胚蛋白增强剂。D2分化患者Tbx3的招募减少Jmjd3号机组-与对照（pS）细胞相比，敲除（pS.shJmjd3）细胞。(B类)Jmjd3绑定到脱中胚蛋白D2-分化组增强子减少Tbx3型-敲除（pS.shTbx3）。(C类,D类)需要Tbx3和Jmjd3脱中胚蛋白转录激活。(C类)脱中胚蛋白在Jmjd3号机组-零（ΔJmjd3号机组)与野生型（WT）细胞相比，在D1–D2分化过程中。(D类)同样，脱中胚蛋白通过定量RT-PCR测定Tbx3型基因敲除在分化过程中受到抑制。(E类)H3K27me3与脱中胚蛋白使用未分化Jmjd3-null mES细胞和D1-D2分化细胞的染色质进行检测。增强子上的H3K27me3水平脱中胚蛋白Jmjd3-null细胞在分化后没有改变。(F类,G公司)转录激活脱中胚蛋白在D2-微分中被救出Jmjd3号机组-零单元（ΔJmjd3号机组)过度表达JMJD3-WT（JMJD3野生型蛋白）。使用JMJD3的过表达和去甲基化酶激活点突变H1390A未观察到救援。(H（H）)丝氨酸2处RNAP的磷酸化依赖于增强子处的Tbx3结合。ChIP分析在脱中胚蛋白近端启动子（a–d）Tbx3型-D1-D2分化过程中的敲除细胞。未观察到RNAP-Ser2P的富集。(我)长程增强子-启动子相互作用伴随脱中胚蛋白转录激活。对从ES细胞和D2分化细胞中提取的交联染色质进行定量3C分析。染色质用消息传递程序1，降级并使用增强子区域的锚定引物和面向消息传递程序1个摘要站点。用于检测扩增子的Taqman探针位于锚定引物附近。锚和所选引物之间的关联频率在y轴上表示。5′染色体坐标（mm9）脱中胚蛋白轨迹显示在x轴上。所有值均为平均值±标准误差(n个=2–3）。

因此，我们假设脱中胚蛋白在EB形成过程中，该位点经历了空间重组，以允许增强子区域与近动机区域进行直接的物理相互作用。这种启动子-增强子相互作用反过来可以促进平衡RNAP的释放和转录激活脱中胚蛋白。我们研究了染色质在脱中胚蛋白使用染色体构象捕获（3C）测定法在EB形成过程中改变基因座。该试验确定了调节元件之间染色质环的形成(Dekker等人，2002年). ES细胞和EB的完整细胞核经过多聚甲醛交联，以固定彼此物理上非常接近的基因组DNA片段。用消息传递程序我随后进行结扎。我们设计了一系列独特的引物消息传递程序I限制性消化位点脱中胚蛋白轨迹。使用位于脱中胚蛋白增强子，我们进行qPCR分析以确定基因座不同区域与脱中胚蛋白增强剂。给定PCR产物的存在表明在任何给定时间捕获到的两个限制性位点彼此相对接近。ES细胞和EB之间交联频率的比较表明，在EB形成期间，Eomes位点发生了巨大的三维变化(图3I). 与ES细胞相比，位于启动子限制位点附近的引物显示EB的交联频率增加，表明增强子-启动子相互作用(图3I). 3C结果与EB形成期间Tbx3–Jmjd3结合促进脱中胚蛋白通过增强子-启动子DNA链激活基因。

激活素A信号增强脱中胚蛋白终末内胚层的表达与分化

的表达式脱中胚蛋白在EB分化和核心决定性内胚层调节因子（如Sox17系列未在培养基中补充激活素A时未被诱导(图1B,​，4A），4A级)表明脱中胚蛋白EB分化过程中诱导的与最终内胚层的形成无关。为了解决调节最终内胚层形成的分子机制，我们使用含有loxed盒受体等位基因的小鼠ES细胞系插入一个Cre-GFP公司（绿色荧光蛋白）融合蛋白替代Sox17系列通过重组介导的盒式交换（RMCE）编码序列(Long等人，2004年). 我们通过比较胚胎中GFP的表达，验证了GFP表达准确反映了内源性Sox17的表达Sox17.Cre-GFP标准Sox17内源性蛋白定位的小鼠。该ES细胞系使我们能够直接观察分化方案中Sox17的表达，并分离出Sox17表达的细胞。

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图4

Jmjd3和Smad2结合并解析核心权威内胚层调节因子启动子内的二价结构域。(A类,B类)维护需要Activin A脱中胚蛋白表达和归纳Sox17系列表达式。定量RT-PCR显示脱中胚蛋白(A类)和Sox17系列(B类)在无激活素A培养的ES细胞和分化的类胚体中培养7天。(C类)使用Sox17.GFP基因敲除ES细胞分离Sox17.GFP⁺细胞。(D类——F类)从Sox17.GFP核心最终内皮调节因子启动子中去除H3K27me3抑制标记⁺单元格(D类)与Jmjd3一致(E类)和Smad2(F类)招募这些推广人员。对ES和Sox17.GFP进行ChIP试验⁺带有指示抗体的细胞。在三组选择的启动子上使用四对位于近端启动子区域（a–d）的引物；核心多能性调节器、核心最终内胚层和其他胚层的关键转录调节器。(G公司,H（H）)Jmjd3和Smad2是招聘到Sox17系列发起人。Smad2的ChIP分析(G公司)和Jmjd3(H（H）)在Sox17系列启动子区域（a–d）显示Activin a分化的结合减少Smad4公司-与对照组（pS）相比，敲除（pS.shSmad4）细胞。所有值均为平均值±标准误差(n个=2–4).

这个Sox17.Cre-GFP标准ES细胞没有检测到GFP表达水平。按照两步分化方案，观察到GFP的强烈表达(图4C)和GFP⁺通过流式细胞术分离细胞并进行微阵列表达分析。多功能转录调控因子的水平，如纳米,10月4日,Sox2系统、和Klf4公司在分离的GFP中被下调⁺细胞与ES细胞的比较(补充图4A). 定形内胚层的核心调节因子，如福克斯2,Sox17系列,混合物1、和Gata6公司在GFP中高度表达⁺单元格(补充图4A). 在其他谱系中选择性激活的转录调节因子，例如Sox1系列对于神经外胚层，Sox7指数胚胎外内胚层，腕表用于中胚层，以及Cdx2因为滋养层没有上调(补充图4A). 这表明，通过我们的方案可以优先定向分化到最终的内胚层胚层。

Jmjd3和Smad2解析核心权威内胚层调节因子启动子内的二价结构域

接下来我们研究了核心最终内胚层调节因子的选择性激活是否伴随组蛋白修饰的变化。二价组蛋白修饰的ChIP分析表明，在分离的GFP中，核心最终内胚层调节因子的启动子H3K27me3缺失⁺单元格(图4D). 相比之下，来自其他胚层的谱系标记的启动子则因该抑制标记而富集(图4D). 值得注意的是，与EB分化阶段不同脱中胚蛋白在最终内胚层阶段，近端运动区H3K27me3被耗尽(图4D). H3K27me3的缺失伴随着Jmjd3在最终内胚层标记物的启动子处的结合(图4E). 另一方面，H3K4me3维持在最终内胚层标记的启动子上，但从多能性和其他谱系标记的启动子中耗尽(补充图4B). 我们还观察到组蛋白甲基转移酶Set7/9与最终内皮层标记物的启动子结合(补充图4C). 这些结果表明，在分化过程中，能够分解二价结构域的酶占据核心最终内胚层调控因子的启动子。

活化素A信号需要激活核心内胚层调节器并增强脱中胚蛋白我们评估了激活素A信号的细胞内介质Smad2是否被招募到最终内胚层标记物的启动子中。Smad2 ChIP分析显示Smad2与GFP中核心确定性内胚层调节因子的启动子结合⁺单元格(图4F). 然而，Smad2并没有占据多能性调节器和其他谱系调节器的启动子(图4F). 击倒Smad4公司Smad2在细胞核中的重要伴侣导致Smad2与Sox17系列发起人(图4G). 有趣的是，Jmjd3绑定到索克斯17启动子也减少，表明Smad2和Jmjd3与Sox17系列发起人(图4H). 这些分析表明，Jmjd3和Smad2在核心决定性内胚层调节因子的启动子处具有功能关联。

Eomes参与一个正反馈回路，以增强其自身的表达，并以核心权威内胚层调节器的启动子为目标

为了阐明Jmjd3和Smad2如何在分化过程中靶向核心定形内胚层调节因子的启动子，我们试图鉴定EB中存在的一种可能与Jmjd3相互作用的转录因子。我们推断Eomes是EBs中表达的最终内皮层调控因子，它将Jmjd3和Smad2导向最终内皮层启动子。ChIP分析确实表明，Eomes选择性地结合到其自身的启动子和其他明确的内胚层调节器的启动子上(图5A). Eomes、Jmjd3和Smad2在确定性内胚层调节器启动子上的共有性表明，这些因素共同作用控制核心确定性内胚叶调节器的表达。利用顺序ChIP分析和ChIP分析Jmjd3号机组,脱中胚蛋白、和Smad4公司敲除细胞后，我们确认Eomes、Jmjd3和Smad2在脱中胚蛋白发起人(补充图5A-E). 我们还预计这些因子的敲除将对最终的内胚层分化产生抑制作用。确实，击倒Jmjd3号机组,脱中胚蛋白、和Smad4公司使用shRNA导致所有定形内胚层标志物的表达减少，此外流式细胞术显示GFP的比例⁺细胞明显减少(图5B和C;补充图5F和G). 类似地，击倒Smad4公司使用SMARTpool siRNA抑制脱中胚蛋白基因激活(补充图5H)。

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图5

Eomes将Jmjd3和Smad2招募到核心最终内胚层基因的启动子区域。(A类)Eomes选择性地占据Sox17.GFP中最终内胚层基因的启动子⁺细胞。ChIP实验在三组选择的启动子的近端promotor区域（a–d）使用四对引物；核心多能性调节器、核心最终内胚层和其他胚层的关键转录调节器。(B类,C类)Activin A的最终内胚层规范需要Eomes和Jmjd3。(B类)GFP数量⁺通过流式细胞术分析对照组（pS）细胞中形成的细胞，这些细胞分化为不含激活素A（左面板）、含激活剂A（中面板）和Jmjd3号机组-用Activin A分化的敲除（pS.shJmjd3）细胞（右侧面板）。(C类)在对照（pS）细胞（左侧面板）和脱中胚蛋白-敲除细胞（pS.shEomes），均与激活素A分化（右侧面板）。(D类——F类)Eomes-Smad2-Jmjd3结合需要Sox17启动子上的T盒结合基序。(D类)野生型和突变Eomes结合基序的序列Sox17系列启动子，包含两个串联核心基序（粗体）。(E类)转染Hek293T的mCherry荧光索克斯17发起人麦克里用Activin A刺激后，含有野生型Eomes结合序列基序的报告结构（左面板）高于突变结构（中面板）。该图显示了两个独立实验的相对mcherry荧光的平均值±标准偏差。(F类)JMJD3、EOMES和SMAD2的ChIP分析表明，与野生型的结合增加，但与突变型的结合没有增加索克斯17Activin A处理后在Hek293T中构建启动子。数据值为平均值±标准误差(n个=2–3).

为了进一步研究Eomes如何特异性靶向确定性内胚层调控因子的启动子，我们结合T盒结合模体特异性开发了一种穷举模体搜索算法(Conlon等人，2001年)我们关于Eomes绑定的ChIP数据。我们确定了假定的T盒结合位点，该位点由许多明确的内胚层调节器启动子区域内由四到八个核苷酸分开的两个串联核心基序组成(补充图5I和J). 然后，我们通过克隆Sox17系列转化为含有荧光报告基因mCherry的无启动子载体。我们还产生了一个突变体Sox17系列通过将核苷酸替换引入假定的Eomes结合位点构建启动子报告子(图5D). 转基因Sox17系列在人胚胎肾细胞系293T（HEK293T）中构建启动子并没有产生明显的荧光水平。然而，当用Activin A处理这些转染细胞时，观察到强烈的mCherry荧光(图5E). 相反，激活素A对转染突变株的HEK293T细胞的治疗Sox17系列报告结构没有产生明显的荧光水平(图5E). ChIP分析还显示Eomes、Smad2和Jmjd3与野生型结合Sox17系列激活素A处理后的启动子区域。然而，在转染了突变体的Activin A处理的HEK293T细胞中未观察到Eomes、Smad2和Jmjd3的结合Sox17系列报告器构造(图5F). 综上所述，这些结果证实，作为对激活素A信号的响应，Eomes将Smad2和Jmjd3引导至最终内皮层调节器的启动子，以增强其自身的表达，并激活其他最终内皮层调控器的表达。

连续两步激活脱中胚蛋白基因座导致最终的内胚层分化

我们的结果表明，最终内胚层的形成分两步进行：（1）增强子-启动子DNA环的形成导致诱导脱中胚蛋白和（2）激活素A介导的脱中胚蛋白明确的内胚层调节因子的表达和转录激活。我们假设脱中胚蛋白涉及环路形成的细胞能够响应激活素A信号并形成最终的内胚层。我们首先检测了脱中胚蛋白该基因座维持在定形内胚层中。我们对脱中胚蛋白ES细胞和GFP基因座⁺使用两步分化方案对细胞进行分类。我们观察到启动子近端区域和增强子之间的相互作用频率增加脱中胚蛋白GFP基因座⁺细胞与ES细胞的比较(图6A). 的交互频率剖面脱中胚蛋白最终内皮细胞和EB细胞中的位点相似(图3F和​和6A）6A级)表明脱中胚蛋白EB分化过程中形成的位点维持在最终的内胚层中。调查是否诱导脱中胚蛋白启动细胞对激活素A的反应并形成最终的内胚层Tbx3型，这是初始诱导所必需的脱中胚蛋白但不参与激活素A介导的脱中胚蛋白确定性内胚层调节因子的表达和转录激活(补充图6A). 基因表达分析Tbx3型-经内胚层分化方案敲除的ES细胞显示脱中胚蛋白和Sox17系列表情严重减弱(图6B). 相应地，流式细胞术分析显示GFP显著降低⁺单元格(图6C). 此外，在Tbx3敲除细胞中，ChIP分析表明Activin A处理并没有促进Smad2和Jmjd3与脱中胚蛋白启动子或导致稳定RNAP的释放(图6D–F;补充图6B). 我们进一步分析了介体复合体的结合，这是一种转录辅激活子，已被证明可以连接增强子结合转录因子和启动子结合RNAP(Heintzman等人，2009年;Kagey等人，2010年). Med12是介体复合体的一个亚单位，其ChIP分析显示，介体与脱中胚蛋白ES细胞中的位点，但在最终内皮分化细胞中结合到增强子和启动子近端区域(图6G). Med12在增强子和启动子近端区域的结合与脱中胚蛋白轨迹。相反，Med12绑定到脱中胚蛋白Tbx3敲低时未观察到基因座(图6G). 通过3C分析，我们证实增强子-启动子环的形成在两种基因中都被阻断Tbx3型-击倒和Jmjd3号机组-内皮分化过程中的空细胞(图6H;补充图6C). 这些结果与初始DNA环形成导致诱导脱中胚蛋白并且是Activin A介导的最终内胚层分化所必需的。

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图6

Tbx3-介导的诱导脱中胚蛋白是最终内胚层分化所必需的。(A类)的交互作用脱中胚蛋白增强子及其启动子维持在最终的内胚层中。ES和分类Sox17.GFP的定量3C分析⁺使用增强子区域的锚定引物和选择的面向Msp1消化位点的引物进行细胞培养。锚和所选引物之间的关联频率在y轴上表示。5′染色体坐标（mm9）脱中胚蛋白轨迹显示在x轴上。(B类,C类)Tbx3的缺失阻止了最终的内胚层分化。(B类)的表达式脱中胚蛋白和Sox17系列和(C类)GFP的流式细胞术分析⁺Activin A分化的细胞Tbx3型-敲除和控制细胞。(D类,E类)ChIP分析Tbx3型-敲除细胞显示Jmjd3需要Tbx3(D类)和Smad2(E类)绑定到脱中胚蛋白激活素A诱导分化后的近运动区。(F类)ChIP分析Tbx3型-敲除细胞显示Tbx3是RNAP-Ser2P延伸复合物在脱中胚蛋白激活素A诱导分化后的近运动区。(G公司)ChIP分析Tbx3型-敲除细胞未显示Med12与脱中胚蛋白所有ChIP实验均使用交联染色质和指定的抗体和引物在脱中胚蛋白近端启动子区（a–d）脱中胚蛋白如图所示，增强子区（En）和阴性对照区（Neg）。(H（H）)Tbx3和Jmjd3是增强子和启动子之间的初始染色体相互作用所必需的脱中胚蛋白轨迹。增强子-启动子相互作用脱中胚蛋白基因座采用3C定量分析进行监测。从细胞中提取交联染色质。锚定点和所选引物区域之间的关联频率在y轴上表示。5′染色体坐标（mm9）脱中胚蛋白轨迹显示在x轴上。增强子和启动子之间的DNA链脱中胚蛋白在分化的野生型细胞（pS）中观察到，但在Tbx3型-击倒（pS.shTbx3）和Jmjd3号机组-零单元（ΔJmjd3号机组). 数值为平均值±s.e.m(n个=2–3).

小鼠和人类ES细胞培养、分化和RNA干扰

所有细胞在37°C和5%CO下培养₂原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）来源于E13.5 CF1小鼠胚胎，经γ射线（UCLA）灭活。Sox17.GFP敲除ES细胞和Jmjd3-null ES细胞（来自敲除小鼠项目库（KOMP）的KO-2211）；该细胞系携带缺失的Kdm6b等位基因：Kdm6b^{tm1（KOMP）Wtsi公司})在含有Knock-out-Dulbecco改良Eagle’s培养基（KO-DMEM；GIBCO）的小鼠ES培养基中，加入10%热灭活胎牛血清（FBS，Hyclone）、0.055 mMβ-巯基乙醇（GIBCOL（左）-谷氨酰胺（GIBCO）、0.1 mM非必需氨基酸（GIBCO-）、5000 U/ml青霉素-链霉素（GIBCO-）、15 mM HEPES（GIBCO）和1000 U/ml LIF（Millipore/Chemicon）。如前所述，使用高浓度G418抗生素（2.5 mg/ml）在上述培养基中选择Jmjd3-null ES细胞作为纯合菌落Mortensen等人（1992年）如前所述进行RNA干扰(Loh等人，2007年)使用shRNA-expressing pSuperpuro（Oligoengine）构建物，以1μg/ml的浓度选择嘌呤霉素（Sigma）或siRNA SMARTpool（Dharmacon）。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行所有转染。shRNA序列见补充表1为了分化，mES细胞最初在非粘附条件下以1×10的密度培养⁴细胞/ml，在补充的KO-DMEM中持续2天。然后，在1:1的KO-DMEM/神经基底培养基（GIBCO）中，使用20 ng/ml激活素A（R&D）处理5天，将形成的EB分化为最终的内胚层，该培养基补充N2（GIBCO）、B27（GIBC0）、0.055 mMβ-巯基乙醇、2 mML（左）-谷氨酰胺、0.1 mM非必需氨基酸、5000 U/ml青霉素-链霉素、15 mM HEPES和20 ng/ml EGF（研发）(Kubo等人（2004年）和Morrison等人（2008）绿色荧光蛋白的形成⁺用Leica DMLRE2显微镜监测细胞。将人ES细胞（HSF1）和人诱导多能干细胞（hiPS2）保存在含有DMEM/F12（GIBCO）并添加2 mM的人ES培养基中L（左）-谷氨酰胺、0.1 mM非必需氨基酸、5000 U/ml青霉素-链霉素、15 mM HEPES、20%敲除血清替代物（Invitrogen）和10 ng/ml碱性FGF（研发系统），如前所述(劳里和普拉斯，2008年). Hek293T细胞保存在补充10%热灭活FBS（GIBCO）、2 mML（左）-谷氨酰胺和5000 U/ml青霉素/链霉素。使用100 ng/ml Activin A在DMEM/F12中用2 mM将HSF1和hiPS2分化为内胚层5天L（左）-谷氨酰胺、15 mM HEPES、5000 U/ml青霉素-链霉素并补充FBS（第0天至第1天为0%，第1天至第2天为1%，第2天至第5天为2%）(D’Amour等人，2005年;Borowiak等人，2009年;Patterson等人，2011年)。

ChIP-qPCR和序列ChIPs

ChIP根据Dahl和Collas（2008）稍作修改。简单地说，1×10的单细胞悬浮液⁵细胞用1%甲醛交联并在室温下培养15分钟。通过添加最终浓度为125 mM的甘氨酸使甲醛失活。使用100μl裂解缓冲液对细胞进行裂解，该裂解缓冲液由50 mM Tris–HCl pH 8.0、10 mM EDTA、1%十二烷基硫酸钠组成，并辅以1×完整蛋白酶抑制剂（钙生物化学），然后使用生物破坏者（Diagenode）对其进行超声处理，以产生平均大小为500 bp的DNA片段。根据抗体同型，在4°C下，总共有1-2μg抗体与20μl蛋白-A/g代谢物（Invitrogen）结合2小时。四分之一的超声染色质在4°C下与总体积为200μl的抗体-β复合物在RIPA缓冲液中培养过夜，RIPA缓冲溶液中含有10 mM Tris–HCl pH 8.0、140 mM NaCl、1 mM EDTA、1%Triton X-100、0.1%SDS和0.1%Na-脱氧胆酸盐，并辅以1×完整蛋白酶抑制剂。用RIPA缓冲液和TE缓冲液分别洗涤4倍和1倍后，洗脱染色质，然后在68°C下反向交联4小时，在蛋白酶K（Sigma）存在下剧烈搅拌。然后使用酚氯仿提取和乙醇沉淀纯化DNA片段。对于连续的ChIP实验，使用75μl TE缓冲液（含2%SDS、15 mM DTT和1×完整蛋白酶抑制剂）在37°C下将第一步免疫沉淀中洗涤的蛋白质-DNA复合物洗脱30分钟。然后用RIPA缓冲液将该洗脱液稀释20倍，并进行第二次ChIP分析。SYBR绿色qPCR使用ABI7900HT进行，每次反应使用10-20 ng DNA。ChIP-qPCR信号以输入百分比计算。数据代表两到三个独立的实验，误差条表示复制品的标准误差。使用的引物序列和一级和二级抗体补充表2和3分别是。

免疫共沉淀和免疫印迹

每次免疫沉淀1×10⁷使用300μl非变性裂解缓冲液对细胞进行裂解，该缓冲液由50 mM Tris–HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1%NP-40组成，并在4°C下添加1×完整蛋白酶抑制剂20 min。通过将蛋白提取物与3–5μg一级抗体在4°C下孵育过夜，然后与60μl蛋白-A/g代谢物在4°C孵育5小时，来执行协同免疫沉淀。每次共免疫沉淀用裂解缓冲液洗涤三次，每次洗涤5分钟。在一些实验中，细胞裂解液在共免疫沉淀前用100 U/ml DNAse1（Roche）处理30分钟。使用Qubit HS DNA分析（Invitrogen）监测处理过的裂解液中DNA的完全消除，并使用脱中胚蛋白DNA提取后的增强子区域（850 bp）（Qiagen）。捕获的蛋白质在样品缓冲液（Invitrogen）中被还原，并通过煮沸10分钟使其变性。蛋白质在Nupage凝胶（Invit罗gen）上运行。将凝胶印迹到PVDF膜（Amersham）上，然后如图所示用第一抗体染色，然后与辣根过氧化物酶（HRP）二次偶联。使用的抗体列于补充表3根据制造商的说明，使用ECL western印迹检测系统（Millipore）开发膜。

ChIP-seq公司

根据制造商的说明，使用Illumina ChIP-seq DNA样本制备试剂盒，从ChIP和输入样本中生成ChIP-seq库。然后使用Illumina HiSeq2000对这些文库进行测序。使用Illumina软件生成了基本排名和质量控制统计数据。Bowtie绘制了所有独特序列(Langmead等人，2009年)小鼠mm9基因组。独特读数的数量是在整个基因组的垃圾箱中计算出来的。通过与泊松背景模型的比较，确定了含有具有统计意义的Chip-seq富集的Bins。为所有ChIP-seq数据集生成了WIG文件。这些文件随后用于可视化目的和获取平均信号剖面。

染色体构象捕获分析

染色体构象捕获（3C）分析如Gavrilov等人（2009年）使用消息传递程序我消化交联染色质。采用基于Taqman的qPCR技术检测3C连接产物。qPCR控制用于测定每个引物组合的引物效率，使用覆盖脱中胚蛋白研究中的基因组片段。相互作用频率用控制区片段间相互作用频率的对数比进行标准化，以校正交联和连接效率以及模板的数量。数据代表两到三个独立的实验，误差条表示复制品的标准误差。探针和引物序列包括在补充表2详见补充资料。

生物信息和统计分析

Mathematica7.0被用于构建一个穷尽式模体搜索算法，以在−2500到+500之间映射小鼠启动子上的Eomes结合模体。然后使用Weblogo（加州大学伯克利分校）对提取的一致序列进行图形化表示。使用Affymetrix Suite Analysis软件进行质量控制扫描后，对微阵列原始数据进行RMA归一化。差异基因表达分析使用Z轴-测试错误发现率（FDR）-调整P（P）-值。热图数据是表达水平的对数标度。使用ChiP-seq数据分析结合位点Z轴-测试FDR已调整P（P）-值。A类P（P）-值截止值为10⁻⁶用于确定可比数量的结合位点。使用Student’s对其他生物数据进行统计分析t吨-测试或Z轴-测试，然后进行Bonferroni修正以进行多重比较。基因组坐标基于小鼠的构建mm9和人类的构建hg19。请参见补充数据了解详细信息。

这项工作得到了NIDDK、青少年糖尿病研究基金会和赫尔姆斯利信托基金会对AB的资助。我们感谢加州大学洛杉矶分校广泛干细胞研究中心高通量测序核心的支持。

作者贡献AK和AS对mES细胞进行了实验和分析。AK、JZ和MK进行了Chip-seq实验和分析。AK、DC和WL对hES细胞进行了实验和分析。AG生成了Sox17 GFP构造。MM生成的Sox17 Cre-GFP mES细胞。AB和AK构思、计划实验并解释数据。AB和AK写了手稿。