α-突触核蛋白（αS）是一种与帕金森病（PD）有关的14.4kDa神经元蛋白，是受影响脑组织中发现的路易体斑块的主要成分。αS定位于突触末端，在细胞溶质和突触膜之间平衡存在(1).体外αS结合合成脂质双层的能力已得到证实，并观察到对特定脂质和高度弯曲膜的偏好(2). αS的结合显著改变膜的性质；它可以诱导脂质双层的弯曲、变薄和小管化(三-5). αS对与脂质双层结合的这些不同影响暗示了αS在诸如膜融合等过程中的潜在作用，这些过程取决于通过高膜曲率状态的过渡。
也有越来越多的研究支持αS在调节突触囊泡融合中的作用（综述于6). 可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）蛋白负责突触囊泡融合以及细胞内大多数其他融合事件(7). 在神经元中，v-SNARE（VAMP2或synaptobrevin）与囊泡膜相关，而t-SNARE在靶膜中发现（syntaxin和SNAP-25）(8). 在囊泡融合事件中，t-SNARE和v-SNARE组装成四螺旋束，将两个膜拉在一起，导致融合(9). 多个动物模型显示αS过度表达后神经递质释放减少(10-12)表明αS可能作为神经传递的调节器，改变或破坏SNARE驱动的突触小泡融合。在缺乏所有三种（α、β和γ）突触核蛋白的小鼠中发现诱导多巴胺释放增加(13).
在这里，我们研究了αS在调节SNARE介导的囊泡融合中的作用。为了直接评估αS的影响，我们使用了在体外SNARE融合分析。制备的囊泡含有v-或t-SNARE成分（参见支持信息). 通过在不存在或存在αS的情况下混合两种类型的SNARE囊泡来启动融合，并通过脂质混合后荧光增强进行监测。
αS以浓度依赖的方式抑制SNARE介导的囊泡融合(). 在αS：可获得的脂质比率小于1:500时观察到抑制作用。抑制程度随着αS的增加而增加，并且在αS：可获得的脂质比为~1:20时，效果饱和。相对于控件，熔合被抑制的最大值约为50%。已建立的SNARE介导融合调节器也观察到类似程度的影响(14,15). αS似乎不会阻碍半融合时的融合过程(图S1).
αS抑制囊泡融合。A.SNARE介导的囊泡融合作为αS浓度增加的函数（800μM脂质）。插图。量化在没有αS的情况下归一化为融合的抑制程度。B.αS变体的比较（5μMαS，800μM脂质）。N=3，误差为s.e.m.，*P<0.01，与学生T检验的WT相比。
为了进一步了解这一现象，我们利用了实验室先前的工作，量化了与家族型PD相关的αS变异体之间的膜亲和力差异(2). 每种变体都抑制SNARE介导的融合，尽管与野生型（WT）相比程度不同：E46K>WT、A30P<WT和A53T≈WT(). 重要的是，每个变体抑制融合的程度与其对脂质双层的亲和力相关，因此与囊泡相关的αS的量相关。举例来说，E46K与膜的结合更紧密，并且相对于WT的抑制作用更强，而A30P与膜的粘合作用更弱，抑制融合的效果不如WT(2). 哺乳动物来源的αS在其N末端乙酰化(16)；这种修饰不会干扰其抑制融合的能力(). 残基100截短的αS也能抑制融合()，尽管程度低于根据其结合亲和力预测的程度(三). 虽然C末端不直接与脂质双层相互作用，但这支持了它在抑制融合中的作用，可能是通过静电排斥。它还可能反映了两亲性α-螺旋膜结合蛋白改变脂质双层性质并影响融合和微管化等过程的更一般能力。最后，值得注意的是最近的一项研究，其中报道低聚物αS抑制SNARE介导的囊泡融合(17). 虽然在本研究中未发现单体αS具有相同的效果，但这可能是由于囊泡中使用的阴离子脂质含量低（参见支持信息).
融合分析的结果表明，抑制程度与与囊泡结合的αS量之间存在相关性，这一点得到了我们之前对纯脂质囊泡的研究的有力支持(2). 然而，t-和v-SNARE蛋白的存在可能会改变αS向SNARE囊泡的分配，以及αS与任一SNARE蛋白质的结合(18). 为了直接评估t-和v-SNARE蛋白的影响，我们测量了αS与含有t-和v-SNARE的囊泡的结合。在残基33处用NBD标记αS，NBD是一种环境敏感荧光团（αS-NBD）。αS-NBD荧光强度在插入脂质双层后发生变化，报告结合(图S2).
与纯脂质囊泡相比，αS与含有v-或t-SNARE蛋白的囊泡的亲和力较低(). 结果量化为表S1使用浮选试验作为正交方法，我们筛选了更广泛的脂质成分，并发现所有测试成分的结果都相似(图S3). SNARE蛋白的存在可能影响αS与囊泡的结合，其机制有多种。最简单的解释是，SNARE蛋白质占据了αS可以到达的脂质结合位点，从而降低了蛋白质结合。静电对αS与纯脂质泡的结合很重要(2,19)SNARE蛋白的存在，尤其是高酸性t-SNARE，将改变囊泡的有效电荷。然而，鉴于αS与带更多负电荷的脂质囊泡具有更高的亲和力，并且还观察到它与各种带负电荷的大分子相互作用(20-22)，我们可能预期结合t-SNARE小泡增加，而不是观察到的减少。最后，由αS的C末端和VAMP2的N末端介导的αS与VAMP2直接结合，这两种蛋白都可以通过膜相关形式获得(23,24)已提议加强SNARE融合复合体的组装(18). 我们的预期是，αS与VAMP2的结合将导致测得的K净减少d日对于v-SNARE小泡，相对于仅脂小泡，而我们观察到K几乎增加了三倍d日(表S1).
αS不与SNARE蛋白结合。A.αS（500 nM）与SNARE囊泡（开放）的结合比与相当的纯脂质囊泡（封闭）的结合更弱。N=3，误差为s.e.m.B.当CDV-AL594（灰色）与反映可溶性SNARE络合物形成的sol-t（青色）混合时，FCS观察到扩散时间增加。过量的αS（蓝色）不会影响络合物形成的程度或速度。
可溶性t-和v-SNARE构建体的使用使我们能够在没有脂质双层的情况下检测它们与αS的相互作用。特别是，我们考虑了与实际突触小泡相比，我们模型系统中发现的相对于蛋白质的脂质过多的可能性(25)干扰或掩盖αS和任一SNARE蛋白之间直接相互作用的证据。通过移除跨膜锚定，形成可溶性SNARE结构，导致c细胞质的d日的域V（V）AMP2（CDV：残基1-95）和可溶性t-SNARE（sol-t：合成蛋白残基1-265和全长SNAP-25）。通过使用荧光相关光谱（FCS）监测Alexa 594标记CDV（CDV-AL594）与未标记sol-t结合后扩散时间的增加，观察到这些可溶性结构的SNARE复合物形成。由于流体动力学尺寸的增加，CDV-AL594并入更大的复合物中会导致荧光物质扩散更慢(). 添加过量的αS不会改变动力学或络合物形成的程度(). 通过重复使用Alexa 488标记的αS（αS-AL488）和未标记的CDV和sol-t，直接评估αS与SNARE复合体的相互作用(图S4). 在SNARE复合物形成的时间尺度上，αS的扩散时间没有变化，表明它与SNARE复合体无关。最后，在αS存在和不存在的情况下，使用尺寸排除色谱法从CDV/sol-t样品中的游离组分蛋白质中分离SNARE复合物，以检测复合物的形成(26,27). 观察到αS作为游离单体洗脱，络合物形成的程度与αS无关(图S5). 这一发现与我们的FCS测量结果一致，表明αS似乎在伴随SNARE复合体形成中没有直接作用。然而，通过这些测量，我们不能排除与αS的相互作用可能由调节SNARE复合物形成的众多蛋白质中的任何一种介导的可能性，例如突触球蛋白和复合蛋白体内.
我们的结果强烈支持一个模型，即αS通过与脂质膜的相互作用抑制SNARE介导的囊泡融合。这些发现与在体外和体内这项研究表明，αS的功能可能来源于其改变脂质双层特性的能力，使其融合性降低。该模型最直接的支持来自于αS抑制钙介导的SNARE依赖性囊泡融合的观察(28)(图S6)表明膜融合性降低可能与融合机制无关。已观察到αS可以退火双层膜中的缺陷，从而形成更均匀的膜，具有更高的熔合能量屏障(29). 实验和模拟都表明，αS结合使脂质双层变薄并增加其刚性(三)，这一效应增加了形成高度弯曲的聚变中间产物所需的能量(30). 更一般地说，αS能够在由一系列脂质组成的双层中诱导弯曲和微管化(三-5). 诱导脂质双层的弯曲和微管化也是许多BAR结构域蛋白的一个特征，它们在各种内吞和外吞途径中重塑膜的作用已被广泛研究。最近的一项研究发现，在α、β和γ突触核蛋白缺乏的小鼠中，BAR结构域蛋白内亲素A1和内亲素B2上调，这最后一个特征特别有趣(5). 内白细胞素特别与膜曲率的感应/诱导有关(31,32)，表明在缺乏所有突触核蛋白的情况下，这些功能的丧失可能会得到补偿(图S7).
在解释各种模型系统中的αS功能研究时，考虑我们模型的后果是很有意义的。αS基因敲除小鼠的多巴胺释放增加和αS基因过度表达小鼠多巴胺释放减少都可以用αS抑制融合的功能来解释(10-13). 在培养的哺乳动物细胞和酵母中，αS的过度表达破坏内质网向高尔基体的转运(26,33)这是一个高度依赖于囊泡融合的过程。αS在秀丽线虫由于线粒体之间融合减少，导致线粒体碎片增加(28). 此外，αS的下调与线粒体伸长有关，反映融合增强。最后，我们观察到αS没有增强SNARE复合物的形成，这与一项研究一致，该研究观察到缺乏synuclein家族所有三个成员的小鼠体内SNARE复合体的正常丰度(13). 我们的结果有助于从机理上理解观察到的膜融合改变事件体内并强烈暗示αS在突触末端的膜重塑中的作用。
