心脏肥大发生在机体正常生理生长期间，是对压力或体积压力、心脏蛋白突变或代谢紊乱的适应性反应(1). 肥大的特征是细胞尺寸增加，蛋白质合成增强，在某些情况下，肌节重组。在病理性肥大中，心肌细胞大小的增加被认为是一种补偿机制，可以减少高血压、瓣膜性心脏病或心肌梗死引起的壁应力。心室肥厚与心力衰竭和恶性心律失常风险显著增加相关(2).
多种信号通路导致肥大表型(三,4). 许多研究表明，丝氨酸-三氢嘌呤激酶Akt（蛋白激酶B）是心肌细胞生长的重要调节因子(5)和生存(6). 许多刺激物激活Akt，包括生长因子胰岛素和IGF1(7)，血管紧张素II(8)和机械应力(9). Akt在转基因小鼠中的组成性过表达可导致收缩性增强(10)、细胞保护(11)和病理性心肌肥大(12,13). Akt信号也是生理性心脏生长的重要决定因素，并随着机体营养状态的变化，协调心脏大小和身体大小(7). 生长因子/Akt信号通路通过激活哺乳动物雷帕霉素靶点的机制上调蛋白质表达(13)，真核起始因子4E-结合蛋白(14)，p70S6k(7)和GSK3的抑制β(15).
目前对负性调节肥厚表型的机制知之甚少。心脏会因一些环境参数而缩小，包括营养输入减少和负荷减少。例如，神经性厌食症患者的心脏明显缩小(16)肥胖患者的体重减轻与血压或其他血流动力学参数无变化时的心脏缩小有关(17). 左心室辅助装置支持后心脏尺寸也会减小(18)并通过减少体积和压力过载(19,20). 异位心脏移植后心脏重量也显著减轻(21,22).
叉头转录因子FOXO亚家族是Akt的下游靶点。这个亚家族由三个成员组成，FOXO1（FKHR）、FOXO3a（FKHRL-1）和FOXO4（AFX），它们都被Akt灭活(23,24). Akt的磷酸化导致核排斥和叉头转录程序的抑制。FOXO转录因子参与调节多种细胞功能，包括分化、代谢、增殖和存活(25,26). 最近，FOXO转录因子也被证明促进骨骼肌萎缩(27,28). 然而，叉头转录因子在心肌细胞生物学中的调控和功能尚未被研究。
“Atrogenes”描述了在几种骨骼肌萎缩模型中通常受调控的转录物家族(29–32). 在骨骼肌中，被称为atrogin-1或MAFbx的atrogene通过FOXO因子的直接转录调节由生长因子/Akt信号轴调节(27,28,32). 由于在atrogin-1中存在F-box基序，因此它是SCF复合体的一个特定于基态的成分(30–33). 这些复合物是E3泛素连接酶，介导泛素与蛋白质结合，靶向蛋白质进行蛋白体破坏(34–36). 最近，李等。(37)证实atrogin-1抑制钙调神经磷酸酶依赖性心肌肥大。
我们现在首次表明FOXO亚家族的叉头转录因子在心肌细胞中表达，并受生长因子/Akt信号轴的调节在体外和体内我们还表明，FOXO控制这些细胞内的一个atogene转录程序，并且其功能是调节心肌肥大多个调节因子下游的心肌细胞大小。
实验程序
细胞培养和试剂
如前所述，通过改良Kasten技术从新生大鼠中分离新生大鼠心室肌细胞（NRVMs）(38). 细胞生长在Dulbecco改良的Eagle’s培养基（DMEM）中，DMEM用10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（Invitrogen，Carlsbad，CA）代替血清刺激，DMEM+0.5%FBS代替血清饥饿，并涂在涂有明胶的培养皿或培养皿上。接种细胞后2天，隔夜进行腺病毒转导。如前所述，NRVM通过Flexercell计算机驱动真空系统进行循环拉伸(39). 将接种在BioFlex培养板上的NRVM置于37°C、5%CO的带衬垫的基板上2培养箱，在频率为1 Hz的−21千帕真空下，以每循环0.5秒的方波模式施加应变，持续24小时。使用这些参数，该系统在膜上产生变形梯度，最大变形为25。不受拉伸的平行BioFlex培养板用作对照。IGF-1购自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州），LY294002购自Calbiochem，胰蛋白酶购自Invitrogen，胰岛素购自Lilly（印第安纳波利斯，印第安纳州），血管紧张素II购自Sigma。
腺病毒结构
先前描述了编码野生型FOXO3a（WT-FOXO3a）和非磷酸化的组成型活性形式FOXO3a（TM-FOXO3a）的腺病毒载体(26). 编码IKB和NIK的腺病毒载体在其他地方也有报道(28). 如前所述，构建复制缺陷型腺病毒载体，表达带有血凝素表位标记的小鼠Akt的显性阴性和组成活性形式(40). 显性阴性Akt突变体（Ad-dnAkt）在308位有丙氨酸残基取代苏氨酸，在473位有丝氨酸残基。组成活性Akt（Ad-myrAkt）具有c-Src肉豆蔻酰化序列，该序列在框架内融合到野生型Akt编码序列的N末端，该编码序列将融合蛋白靶向膜。一些检测使用了表达催化活性GSK3的复制缺陷型腺病毒载体β（KM-GSK3）β)其中，位置85和86处的赖氨酸残基分别突变为蛋氨酸和丙氨酸。另一种载体表达GSK3的非磷酸组成活性突变体β位置9处的丝氨酸残基突变为丙氨酸（S9A-GSK3β) (41). 所有构建物在293细胞中扩增并通过超速离心纯化。病毒滴度被确定为斑形成单位。对于转导，心肌细胞培养物通常与腺病毒在10–50倍的感染率下孵育12小时。对照培养物用腺病毒载体感染，该腺病毒载体仅表达由相同系统或腺病毒载体制备的GFP转基因（Ad-GFP）-β-gal，表示lacZ公司巨细胞病毒启动子基因(42). 在此条件下，转导效率大于90%。
免疫荧光染色
大鼠新生心肌细胞在涂有明胶的Lab-Tek®盖玻室（纽约州罗切斯特Nalge Nunc International）中培养，并用上述腺病毒载体转导。培养期结束后，用温热的PBS清洗细胞三次，并在室温下用3.7%的副甲醛固定20分钟。在用PBS进行另一个清洗步骤后，在室温下使用0.2%Triton X-100在PBS中渗透细胞20分钟。使用含有10%FCS、0.1 N NaN的PBS溶液进行封堵三和0.1%Triton®声波风廓线仪X-100。首先，在室温下用抗FKHRL1（Upstate，Waltham，MA）抗体以1:100的稀释度孵育1小时，然后用Alexa®-Fluro 597抗体（Molecular Probes，Eugene，OR）以1:1000的稀释度培养第二抗体30分钟。所有抗体在PBS+5%FBS中稀释。将载玻片在PBS中清洗三次，取下盖玻片，并使用含有DAPI的Vectashield®安装介质（加利福尼亚州伯灵盖姆Vector Laboratories）安装细胞。在565波长的荧光显微镜（NIKON Diaphot，NIKON，Tokyo，Japan）下观察细胞(红色)400（DAPI）和505 nm(绿色)分别是。利用GFP的表达测定转导效率。对照实验分别在没有初级或次级抗体的情况下进行。
西方免疫印迹分析
通过修改上述程序进行免疫印迹分析(41). 组织样品在裂解缓冲液中均质。细胞在由50 mM Tris-HCl、pH 7.2、2 mM EDTA、1%Nonidet P-40、0.05%SDS和250 mM NaCl、10 mM组成的裂解缓冲液中培养前用PBS洗涤两次α-磷酸甘油，1 mM钒酸盐。在使用前加入一片蛋白酶抑制剂混合物（Complete Mini®，罗氏诊断公司，印第安纳州印第安纳波利斯）。刮除后，将全细胞裂解物放在冰上30分钟，并使用BCA蛋白质检测试剂盒（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）测定蛋白质浓度。20 –50μg蛋白质通过SDS-PAGE分离并转移至聚偏二氟乙烯膜（Immobilon-P，Millipore，Billerica，MA）。使用含有3%干乳的0.05%T-PBS（1×PBS和0.05%吐温20）封闭膜30分钟，并在4°C下与一级抗体孵育过夜。在含有1.5%干牛奶的0.3%T-PBS中洗涤步骤之后，用3%牛血清白蛋白封闭膜。在室温下应用第二抗体1小时。在0.05%T-PBS中清洗膜1 h后，用化学发光检测试剂ECL或ECL-Plus（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）检测免疫复合物。使用Restore Western blot Stripping Buffer（Pierce）对膜进行重制。本研究中使用的主要抗体为：抗磷酸苏氨酸32-FKHRL1（兔多克隆IgG，Upstate），1:500；抗FKHRL1（上游），1:1000；抗磷Akt（Ser473)（兔多克隆IgG，Upstate），1:500；抗Akt-1（山羊多克隆IgG，圣克鲁斯生物技术，加利福尼亚州圣克鲁斯），1:200；抗HA（小鼠单克隆IgG，Roche），1:4000；抗p-FKHR和抗-FKHR（上游），1:1000；或反-α-微管蛋白（癌基因，Carpindia，CA），1:4000。作为二级抗体，以1:2000的稀释度使用抗鼠IgG辣根过氧化物酶、抗羊IgG（Promega，Madison，WI）或抗兔IgG Horsradish过氧化物酶（Promeca）。使用NIH Image®软件定量免疫印迹。
QRT-PCR分析
通过RNA三唑提取（Ultraspec™-II RNA分离系统，德克萨斯州休斯顿Biotecx）。RNA（2μg） 用扩增级DNase I（Invitrogen）处理（37°C下30分钟）。使用Taqman逆转录（Invitrogen）试剂盒生成cDNA。根据制造商的说明（英国柴郡PE-Applied Biosystems），使用SYBR®Green PCR Master Mix（1:1，PE-Appied BiosSystems）、正向和反向引物（各200 nM），在ABI-Prim 7900上使用SYBR Green I作为双链DNA特异性染料，进行三次实时PCR（QRT-PCR），和样本RNA（90 ng）。为了标准化所选基因的定量，通过QRT-PCR对每个样本中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶进行量化，并将所选基因归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。使用的引物如下：大鼠atrogin-1正向，5′-CAGGCCCCCAAACCAGTAAC-3′，反向5′-GGCAGGGAACGTCTAATAATGG-3′；甘油醛-3-磷酸脱氢酶正向、5′-ACAGCTCCAAGATCAGCA-3′和反向5′-CACATCAGCCACAGTTCC-3′；大鼠MuRF-1正向、5′-GCCCCTGGACGAGAAGAG-3′和反向5′-AGCGGCTTG-GCACTCAAG-3′。引物设计为与单个QRT-PCR热谱兼容（95°C持续10分钟，40个95°C循环持续30秒，60°C持续1分钟），以便可以同时分析多个转录物。实时监测PCR产物的积累（PE-Applied Biosystems），以及交叉阈值（Ct吨)使用PE-Applied Biosystems软件确定。对于每组引物，包括无模板对照和无反向扩增对照。评估扩增后解离曲线，以验证在没有DNA污染的情况下是否存在单一扩增产物-使用Ct吨方法。
萤光素酶报告者检测
对于在体外实验中，大鼠新生心肌细胞在6孔培养箱中培养，并用复制缺陷型腺病毒载体转导过夜。根据制造商提供的协议，使用脂质体转染试剂（Invitrogen）在6孔板中进行瞬时转染，转染过程中使用atrogin-1启动子荧光素酶报告子和Renilla对照质粒（Promega），转染时间为4 h。阿托品启动子-荧光素酶报告子结构已在前面描述过(28). 转染24小时后，使用荧光素酶细胞裂解缓冲液（Promega）制备细胞提取物。根据制造商的建议，在具有荧光素酶测定系统（Promega）的光度计上评估荧光素酶报告活性。对于体内研究，109腺病毒与20混合的pfuμag启动子荧光素酶报告子(28)和0.5μ将g Renilla报告质粒注入左心室，1周后处死动物。心脏被切除，左心室壁被切除，并在4°C的荧光素酶细胞裂解缓冲液（Promega）中均质。进行了双荧光素酶启动子分析，并将atrogin-1活性归一化为Renilla。
体外评价心肌细胞大小
大鼠新生心肌细胞在Lab-Tek®室载玻片上培养24小时。与生长因子孵育24小时后，通过与IGF-1或胰岛素孵育48小时来诱导肥大。用表达FOXO3a的复制缺陷型腺病毒转导细胞。24小时后，即在实验开始后48小时，用4%多聚甲醛固定细胞，并对其进行心肌特异性标记物染色α-原肌球蛋白。使用NIH/OpenLab®软件分析图像以确定细胞表面积。对于拉伸实验，新生大鼠心室肌细胞生长在Bioflex®六孔板上，用所示腺病毒载体转导并拉伸24小时。实验结束时，在绿色荧光灯下拍摄细胞照片，并使用NIH/OpenLab®软件测量细胞大小。
小鼠应变
CIRKO小鼠的产生和基因分型如前所述(7). 野生型小鼠在处死前10分钟静脉注射1毫克/公斤体重的胰岛素。在心脏过度表达组成活性形式Akt1（myrAkt1）的转基因小鼠(6)是通过交叉产生的α-MHC-tTA小鼠和Tet-myr-Akt1小鼠(43)，在四环素反应启动子的控制下表达myrAkt。2之前描述过Akt-1缺陷小鼠(44). 所有小鼠均喂食正常的食物即兴创作如前所述进行经主动脉缩窄(45). 用阿维丁麻醉动物，在胸部切开后，取出心脏并立即在液氮中快速冷冻。心脏组织在细胞裂解缓冲液（cell Signaling，Beverly，MA）中均质，用一片蛋白酶抑制剂（Complete Mini®，Roche）替代，并进行蛋白质印迹处理。所有动物研究均由波士顿大学医学院动物护理和使用委员会批准。
细胞大小的体内测量和体内基因转移
通过注射109Ad-WT-FOXO3a或Ad-GFP（对照）的pfu进入野生型小鼠的左心室壁。7天后，将心脏切除并植入OCT复合物中。然后对冷冻组织切片进行FKHRL-1（上游1:100）染色以检测转基因表达，用小麦胚芽凝集素染色确定细胞边界，用DAPI贴载载玻片进行核染色。每个小鼠心脏中鉴定出50个FOXO3a阳性细胞，并使用OpenLab Image软件对细胞大小进行量化。
cRNA的制备及微阵列分析
使用TRIzol（Ultraspec）从双转基因阳性小鼠的冷冻心脏中提取RNA™-II RNA分离系统，Biotecx）。根据Affymetrix协议（加利福尼亚州圣克拉拉市Affymetix），使用含有T7启动子的poly（dT）引物在Superscript Choice系统（Invitrogen）中生成cDNA。结果cDNA通过结合生物素化CTP和UTP，使用ENZO生物阵列生成生物素标记的cRNA。随后，将样品与Affymetrix GeneChip®小鼠表达集430微阵列杂交，并根据Affymetrix方案通过染色和扫描对结合序列进行定量。在基线（转基因Akt1诱导前）、转基因Akt2诱导后2周和转基因抑制后2天获得双转基因阳性小鼠心脏的杂交数据。数据采集后，使用MAS 5.0软件（Affymetrix）对扫描图像进行量化，得出基因芯片上每个探针的信号强度。通过方差分析计算错误发现率进行方差分析第页错误发现率<1的选定转录本中的值。
统计分析
所有数据均由Student的t吨使用Stat View 4.5（马萨诸塞州伯灵顿Abacus Software）进行测试。数据表示为所示独立实验数量的平均值±S.E。A类第页<0.05被认为是显著的。
结果
FOXO转录因子是体外心肌细胞生长因子信号转导的下游靶点
由于之前尚未在心肌细胞中研究FOXO转录因子，因此我们首先研究生长因子/Akt/叉头信号轴在该细胞类型中是否起作用。如所示用血清或IGF-1刺激心肌细胞可增加Akt、FOXO1（FKHR）、FOXO3a（FKHRL-1）和FOXO4（AFX）的磷酸化。在另一组实验中，用胰岛素刺激心肌细胞导致Akt和三种FOXO转录因子的磷酸化增加(). 这些效应是PI 3-激酶依赖性的，因为LY294002治疗阻断了Akt和FOXO因子磷酸化。叉头转录因子FOXO亚类的磷酸化决定其在细胞内的分布。
心肌细胞FOXO调节在体外在有或无血清、生长因子（IGF）的情况下培养大鼠新生心室肌细胞(A类)和胰岛素(B))或PI 3-激酶抑制剂LY294002(B). 分别用针对总蛋白的特异性抗体和丝氨酸256（FOXO1）、苏氨酸32（FOXO3a）和丝氨酸193（FOXO4）的磷酸化位点来测定FOXO 1、FOXO3、FOXO4蛋白的水平和磷酸化。Akt的磷酸化状态也在丝氨酸473下进行评估。剥下蛋白印迹膜并重新制备微管蛋白，以比较各车道的负荷。所示的蛋白质印迹是三个或更多独立实验的代表。
为了测试FOXO3a定位是否受Akt信号调节，用表达组成型活性或显性阴性Akt和WT-FOXO3a或TM-FOXO3a的腺病毒载体共同转导肌细胞。TM-FOXO3a在FOXO3a的32、253和315位有丙氨酸残基取代丝氨酸/苏氨酸残基，并且它具有组成活性，因为它不能被磷酸化灭活(24,46). Ad-WT-FOXO3a和Ad-myrAkt的共转染导致FOXO3a被排除在细胞核之外，而Ad-WT-VOXO3A和Ad-dnAkt共转染则导致FOXO3a的主要核染色模式(). 相反，TM-FOXO3a的核定位不受Ad-dnAkt或Ad-myrAkt转导的影响。总的来说，这些数据表明所有FOXO叉头因子都在心肌细胞中表达，并且可以通过PI 3-激酶/Akt信号轴进行调节。由于表达该亚型的腺病毒载体的可用性，进一步的分析侧重于FOXO3a。
FOXO3a受Akt信号调节腺病毒编码的WT-FOXO3a和TM-FOXO3a蛋白的亚细胞定位。如图所示，用FOXO3a或Akt（组成活性，MyrAkt；显性阴性，DnAkt）复制缺陷型腺病毒隔夜转导细胞。用抗FKHRL-1和罗丹明结合二级抗体通过免疫荧光法测定亚细胞FOXO3a的分布。左上面板显示GFP，左下面板图示核染色（DAPI），中上部面板表示FOXO3a染色（罗丹明），以及下部中间面板图示了FOXO3a和DAPI的合并图像。上部和右下面板从FOXO3a染色或FOXO3a-和DAPI染色的图像中描绘细胞的高倍图像中间面板由白色箭头.
为了测试FOXO3a的过度表达是否影响上游信号传导，用表达TM-FOXO3a或WT-FOXO3a的腺病毒载体转导大鼠新生心室肌细胞，并通过Western blot分析评估Akt的活化磷酸化。如所示，用TM-FOXO3a或WT-FOXO3a转导增加了Akt在Ser473，表示反馈调节。
FOXO3a的过度表达促进Akt磷酸化在有或无血清的情况下培养大鼠新生心室肌细胞。用表达FOXO3a或GFP的复制缺陷型腺病毒载体隔夜转导细胞。Akt蛋白和磷酸化水平用针对总Akt1蛋白的特异性抗体和丝氨酸473处的磷酸化测定。用抗血凝素抗体检测转基因表达。膜被剥离，并用微管蛋白进行再生，作为每条车道的负荷控制。这个蛋白印迹是三个独立实验的代表。TM（TM），三突变；哈，血凝素。
叉头转录因子是体内心脏生长因子/Akt信号的下游靶点
采用几种小鼠模型来分析FOXO3a在心脏中的调节体内(). 心脏胰岛素受体敲除（CIRKO）小鼠的心脏表型较小，因为Akt信号受损(7). 与野生型小鼠（WT）相比，CIRKO小鼠显示Akt和FOXO3a磷酸化水平降低。相反，在野生型小鼠中静脉注射胰岛素导致FOXO3a和Akt磷酸化增加。为了证明观察到的对FOXO3a磷酸化的影响是因为Akt激活，我们对诱导过表达组成活性形式Akt1的转基因小鼠心脏进行了Western blotting。在该模型中，通过磷酸化诱导和激活Akt与FOXO3a磷酸化增加平行。相反，Akt1等位基因纯合子缺失的小鼠心脏中FOXO3a磷酸化水平较低。综上所述，这些数据表明生长因子-Akt信号轴调节叉头转录因子磷酸化体内.
小鼠心脏中的生长因子Akt-FOXO信号轴体内采用不同的转基因小鼠模型研究FOXO3a的调控体内小鼠模型为：CIRKO-胰岛素受体敲除小鼠；myrAkt-TG，心脏特异性过表达Akt-1的转基因小鼠；Akt1−/−，Akt1纯合子缺失小鼠。此外，向野生型小鼠注射1 mg/kg体重的胰岛素，10分钟后采集心脏进行分析。将左心室均质化，并使用细胞裂解物进行Western blotting。用抗Akt1、抗p-Akt（Ser473)，抗p-FOXO3a（Thr32)和抗FOXO3a。用微管蛋白作为每条车道的负荷控制，对膜进行剥离和再增殖。每个Western blot代表三个或更多独立实验。C类，对照（野生型）；iv（四）静脉注射；热失重，转基因。
病理性肥大条件下FOXO磷酸化的调控
血管紧张素II对心肌细胞的作用可能有助于病理性肥大期间心肌质量的增加。当NRVM与血管紧张素原II孵育时在体外，我们观察到Akt磷酸化显著增加，同时FOXO3a磷酸化增强(). 研究病理性肥大条件下Akt叉头信号轴的激活体内采用经主动脉缩窄的压力过载模型。TAC后1周制备的心脏的Western blot分析显示Akt的显著激活与FOXO3a磷酸化的增加平行(). 综上所述，我们的数据表明Akt-FOXO3a信号轴的活性可以被病理性肥大介质调节在体外和体内.
病理性肥厚刺激对FOXO3a的调节NRVM与血管紧张素II（AngII，10−7M）在体外持续10分钟跨主动脉缩窄(节气门执行器控制)在C57BL/6上进行7天。裂解液用于使用抗Akt1抗体的Western blotting。为了第页-瑟32-FOXO3a和FOXO3a总蛋白。Tubulin表示每条车道的荷载相等。每个Western blot代表三个或更多独立实验。C类，控制。
FOXO3a体外调节心脏大小以响应生长因子信号和心脏伸展
研究FOXO3a对心肌细胞大小的影响在体外在FOXO3a-腺病毒载体存在或不存在的情况下，用IGF-1孵育新生大鼠心室肌细胞。与对照组相比，IGF-1孵育诱导心肌细胞大小增加约30%，而生长因子缺乏导致细胞大小小幅但具有统计学意义的减少。IGF介导的心肌细胞大小增加被TM-FOXO3a转导阻断(). WT-FOXO3a的转导可被生长因子信号失活，部分抑制IGF-1对心肌细胞大小的肥大作用。
FOXO3a抑制生长因子诱导的心肌细胞肥大在体外NRVM在含有或不含有IGF的Lab-Tek®室载玻片上的DMEM+10%FBS中孵育48小时。细胞的平行培养也在不含血清的情况下孵育。IGF-1孵育24小时后，用编码GFP（对照）、WT-FOXO3a或TM-FOXO3a的复制缺陷型腺病毒载体转导心肌细胞。通过原肌球蛋白心肌特异性染色鉴定心肌细胞。通过绿色荧光蛋白评估转基因的表达（FOXO载体也表达GFP）。使用OpenLab®软件在转导24小时后量化细胞大小。数据表示为3个独立实验的平均值±S.E.（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01与IGF）。
心脏牵张通过激活Akt信号的G蛋白偶联受体而诱导肥大(9,47). 为了测试FOXO3a是否抑制由这种刺激引起的肥大，将心肌细胞接种并拉伸24小时。拉伸导致Akt和FOXO3a磷酸化增加，伴随着心肌细胞大小增加约35%(). 当用TM-FOXO3a转导细胞时，心肌细胞大小的增加被阻断，而用WT-FOXO3a转导的细胞部分抑制了肥大反应。
FOXO3a抑制拉伸诱导的心肌细胞肥大在体外将NRVM涂布在Bioflex®培养板上，用指示的载体转导，并按照“实验程序”中的描述拉伸24小时左侧面板，细胞裂解物用于Western blotting以评估血清473-Akt和Thr32-FOXO3a后续延伸(S公司)和非拉伸(纳秒). 作为负荷控制，剥离膜并重新培养微管蛋白。Western blot是三个或更多实验的代表。右侧面板,条形图指示心肌细胞大小。固定细胞，并使用NIH/OpenLab®软件计算心肌细胞表面积。数据以3个独立实验的平均值±S.E.表示（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01与拉伸控制）。
FOXO3a基因转移降低体内心肌细胞大小
在野生型小鼠左前壁注射表达WT-FOXO3a或GFP的腺病毒载体。腺病毒载体注射一周后，处死动物，并对冷冻切片中的细胞大小进行荧光免疫组织学分析。通过FOXO3a免疫染色或GFP免疫荧光检测来评估转基因的表达。用小麦胚芽凝集素染色确定细胞边界(). 与表达GFP的对照病毒相比，FOXO3a的转导导致心肌细胞大小显著减小(). 在相邻切片中，细胞大小的减少没有伴随TUNEL染色的增加（数据未显示）。
体内FOXO3a基因转移导致小鼠心脏细胞尺寸减小将表达WT-FOXO3a或GFP的腺病毒载体注射到小鼠（109pfu）。A类转导后1周，处死动物，通过FOXO3a免疫荧光染色测定转基因表达(左侧面板). 用小麦胚芽凝集素表征同一样品中的细胞边界(世界黄金协会)染色(中间面板). 使用DAPI安装介质进行核染色。这个右侧面板描述合并的FOXO3a/WGA/DAPI图像。箭头表明转基因阳性细胞。下部面板表示心肌细胞的放大倍数较高白色箭头与周围转基因阴性心肌细胞相比，转基因细胞体积较小。B，量化两个实验组的细胞大小。数据表示为平均值±S.E.（**，第页< 0.01). 转导细胞(n个=50）与GFP组的类似切片进行比较。
FOXO3a介导的心肌细胞心房生成素的调节
Atrogenes最初被鉴定为骨骼肌中的一组基因，在肌肉快速减重过程中受到协调调节(29,31,32). 由于通过IGF途径的信号显著调节骨骼肌和心肌细胞的大小，我们在心肌细胞中寻找类似的调节体内通过对在心脏特异性启动子控制下诱导表达组成活性形式Akt的转基因小鼠进行微阵列分析。2周的转基因诱导伴随着50.7%(n个= 4,第页心脏/体重/体重比增加，转基因表达2天失活，导致心肌肥厚2天部分逆转（14.1%，n个= 4,第页<0.05）。采用微阵列分析表征Akt激活/失活条件下促肾上腺皮质激素基因的调节(). 在Akt激活期间，Atrogin-1（MAFbx）的表达被抑制了3.5倍，而Akt转基因失活与相对于对照心脏的4.4倍Atrogin-1.激活有关。骨骼肌中鉴定的其他在心肌细胞中Akt转基因诱导时被抑制和Akt抑制时被诱导的萎缩基因包括组织蛋白酶L和泛素化因子E4B(). 另一方面，Akt刺激胰岛素样生长因子结合蛋白5（Igfbp5）的表达，而Akt抑制后其表达降低。
表一
| 基因名称 | MyrAkt诱导：2周 | 第页价值 | MyrAkt诱导：2周/抑制：2天 | 第页价值 |
|---|
| | -折叠变化 | | -折叠变化 | |
| MAFbx公司 | 阿托金-1 | −3.5 | <0.01 | +4.4 | <0.01 |
| Ube4b型 | 泛素化因子E4B | −1.5 | <0.01 | +1.9 | <0.01 |
| Ctsl公司 | 组织蛋白酶L | −1.3 | <0.01 | +1.7 | <0.01 |
| 免疫球蛋白5 | 胰岛素样生长因子1结合蛋白5 | +3.1 | <0.01 | −1.3 | <0.01 |
为了更详细地分析atogene调节，对培养的心肌细胞中的atogen-1和MuRF-1进行了QRT-PCR分析。血清饥饿导致atrogin-1表达增加，而胰岛素在培养基中的加入则逆转了这种表达(). 同样，胰岛素治疗导致另一种肌肉萎缩特异性Ub蛋白连接酶MuRF-1的表达下降(33)DNA微阵列上没有显示。在单独的实验中，IGF-1治疗抑制了MuRF-1的表达，而用表达TM-FOXO3a的腺病毒载体转导导致表达增加(). IGF-1的刺激也抑制了atrogin-1的表达，WT-FOXO3a或TM-FOXO3a的转导导致表达的剂量依赖性增加(). 非磷酸化突变体FOXO3a在诱导方面更有效阿奇金-1野生型FOXO3a的转录本。
FOXO3a诱导泛素连接酶atogin-1和MuRF-1的表达体内A类，NRVM在DMEM+10%FBS中培养(血清+)或DMEM+0.5%FBS(血清−）有无胰岛素。对atrogin-1和MuRF-1进行定量RT-PCR。数据表示为平均值±S.E。B，FOXO3a调节心肌细胞中MuRF-1的表达。C类，FOXO3a调节启动子-1。WT-或TM-FOXO3a腺病毒基因转移后NRVM中的QRT-PCR分析。用IGF-1（50 ng/ml）培养平行培养物过夜。数据表示为平均值±S.E。C类，控制；TM（TM），三重突变。
其他分析检查了阿奇金-1利用含启动子3.5kb碱基对片段的荧光素酶报告质粒在培养心肌细胞中表达基因(28) (). 用所示腺病毒载体转染细胞，然后用启动子报告质粒瞬时转染细胞。组成型活性形式的Akt1的转导抑制了atrogin-1启动子的活性，而显性阴性形式的Akt1激活了启动子。FOXO3a载体的转导导致阿特拉津-1启动子活性显著升高。非磷酸化突变体比野生型FOXO3a载体更有效地激活启动子。相反，表达IκB、 NIK和构成活性（S9A）或显性负性（KM）GSK3β对启动子活性没有可检测的影响，表明Akt/FOXO介导的调节的特异性。最后，将atrogin-1启动子与表达β-半乳糖苷酶、WT-FOXO3a或TM-FOXO3a进入小鼠左心室壁(). 基因转移后3天评估启动子活性(). 相对于控件(β-半乳糖苷酶）WT-FOXO3a增加了体内阿特拉津-1启动子的活性为6–8倍，而TM-FOXO3a载体将阿特拉津1启动子活性增加了10–12倍。
Atrogin-1启动子活性受Akt-FOXO信号轴调节在体外和体内A类用所示腺病毒载体转导NRVM，并分别用阿曲素-1-荧光素酶或Renilla报告子构建物转染NRVM。转染后12 h测量荧光素酶/肾素活性。数据表示为一式三份的五个独立实验的平均值±S.E。B，腺病毒载体表达β-半乳糖苷酶(β-女孩)、WT-Ad-FOXO3a或TM-FOXO3a（109pfu每次注射）与20只μag启动子质粒。基因传递后3天，心脏被snap冷冻，用抗凝血素的Western blotting检测转基因表达(哈)抗体。为了第页-FOXO3a。Tubulin表示每条车道上的荷载相同。C类,条形图荧光素酶结构体的指示活性体内。数据以每组三只动物的平均值±S.E.表示。
讨论
左心室肥大的特征是心肌细胞大小增加。心肌细胞大小由蛋白质合成和降解的相对平衡决定。在这项研究中，我们对FOXO转录因子进行了表征，并描述了它们在控制心肌细胞中促甲状腺激素原基因和细胞大小方面的功能意义。所有三个FOXO亚家族成员FOXO1、FOXO3a和FOXO4均存在于心肌细胞中，并通过磷酸化对其进行调节，以应对多种肥大刺激。此外，我们证明其中一个因子（FOXO3a）作为心肌细胞大小的负调节因子，控制着atogene调节程序的表达。
生长因子/PI3-激酶/Akt信号轴是心脏大小的主要调节器。IGF-1受体的过度表达(48)，PI 3-激酶(49)或Akt(10,12,13)导致小鼠的心脏重量/体重比显著增加。相反，心肌细胞中缺乏胰岛素受体的小鼠表现出较小的心脏表型，至少部分原因是PI 3-激酶/Akt信号减弱(7). 该信号系统的激活似乎是生理性心脏生长的主要特征，因为在心肌细胞中表达主要负形式的PI 3-激酶的小鼠在压力过载而非运动训练时表现出肥大(50). 此外，在培养的心肌细胞中Akt的过度表达将导致在肌原纤维重组或胎儿型心脏基因激活缺失的情况下细胞增大，而胎儿型心脏的基因通常与病理性肥大有关(7). 然而，这种信号系统似乎也参与了病理性肥厚过程，因为它被压力过载激活(51)并且Akt的慢性过度表达足以在转基因小鼠中产生病理性肥大(12,13). 我们现在表明，通过PI 3-激酶/Akt信号调节FOXO转录是心肌细胞大小的重要决定因素，正如骨骼肌中的一样(31). 多种促增生刺激，包括生长因子、拉伸、血管紧张素II和压力过载，通过Akt介导的磷酸化导致FOXO失活(). 相反，减少PI 3-激酶/Akt信号传导的条件，如营养缺乏(7)，将促进FOXO向细胞核移位并激活与“萎缩程序”相关的基因(29,52).
Akt/FOXO介导的心肌细胞大小调节的拟议方案多种输入包括生长因子、血管紧张素II、拉伸和压力过载导致Akt磷酸化。Akt通过哺乳动物雷帕霉素依赖途径的靶点增加蛋白质合成，从而诱导心肌细胞肥大。Akt激活还通过磷酸化导致叉头转录因子失活。FOXO转录因子激活atrogenes，包括泛素连接酶atrogin-1和MuRF-1，促进蛋白质分解。
除了证明FOXO因子在心肌细胞Akt信号下游受到调节外，我们的研究还发现FOXO3a的过度表达促进了Akt的活化磷酸化。这些数据表明，FOXO3a可以反馈至心肌细胞中的Akt信号通路，从而将FOXO活性的增加降至最低。这些观察结果与最近的一份报告形成对比，该报告发现FOXO4过度表达抑制肿瘤细胞中的Akt信号(53).
我们的研究确定了心脏中Akt/FOXO信号的一些潜在转录靶点，这些靶点可能参与心脏重量的净损失。这些蛋白质包括泛素化因子E4B、E3泛素连接酶atogin-1/MAFbx和MuRF-1，它们以蛋白质体蛋白降解蛋白、组织蛋白酶L、，溶酶体蛋白酶和Igfbp5。在各种类型的骨骼肌萎缩中，这些基因产物被协调诱导，Ig-fbp5被抑制(28,31,32). 在禁食期间骨骼肌中诱导了Atrogin-1(30)、败血症(54)，肾功能衰竭(30)，恶病质(30)和废用/去神经(33). 缺乏atogin-1基因的小鼠在废用性萎缩期间肌肉损失减少(33)这两种泛素连接酶都是由骨骼肌中的叉头转录因子FOXO1和-3诱导的(33). 有趣的是，泛素化因子E4B的调节，它与E3连接酶结合以提高泛素结合的效率(55)与泛素连接酶的调控类似。组织蛋白酶L是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶。虽然溶酶体在细胞内蛋白水解中的作用有限，但组织蛋白酶L在败血症和禁食啮齿动物的骨骼肌中显著诱导，可能参与萎缩期间细胞外成分的转换(56). Ig-fbp5调节对IGF-1的反应(57)在几种骨骼肌萎缩的情况下，它显著下调(29). 转基因小鼠模型的结果表明，它可能是FOXO1的转录靶点(58). 总的来说，这些数据表明，Akt/FOXO信号轴促进心脏中的转录变化，这与萎缩期间骨骼肌中发生的转录变化非常相似，表明这两个系统中细胞尺寸减小的机制类似。
最近Li等。(37)证实atrogin-1在心脏中表达，并通过启动钙调神经磷酸酶进行泛素介导的蛋白水解来抑制钙调神经蛋白依赖性心肌肥大。有研究表明，IGF和钙调神经磷酸酶诱导的肥大是通过不同的信号通路发生的(59). 然而，我们目前的调查结果和李的数据等。(37)提示atrogin-1可能是连接这两个信号系统的心肌细胞肥大的共同负调控因子。在该模型中，PI3-激酶/Akt信号传导的减少将导致FOXO介导的萎缩蛋白-1的上调，并导致钙调神经磷酸酶靶向萎缩蛋白-1-SCF泛素连接酶复合物。因此，NFAT介导的心肌肥大在PI3-激酶/Akt信号减弱的心脏中无法手术。
总之，这些数据表明FOXO转录因子是心肌肥厚的负调控因子。它们可能参与左心室辅助装置支持期间发生的心脏逆向重塑(19)，高血压治疗(60)营养缺乏和体重减轻(7). 由于过度的心肌肥大会增加心脏骤停和心力衰竭的风险，因此对FOXO转录调控因子的进一步研究可能会导致开发新的治疗心脏病的干预措施。
