胃肠病学。作者手稿；PMC 2013年4月7日提供。
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NIHMSID公司：NIHMS345168
肝窦内皮细胞分化在大鼠肝纤维化进展和消退中的作用
,1 ,1 ,1 ,1 ,2 ,2 ,三和1
谢冠华
1南加州大学洛杉矶分校胃肠道和肝脏疾病科和南加州大学肝脏疾病研究中心
王向东
1加利福尼亚州洛杉矶市南加州大学胃肠和肝病科和南加州大学肝病研究中心
王磊
1加利福尼亚州洛杉矶市南加州大学胃肠和肝病科和南加州大学肝病研究中心
王林（Lin Wang）
1加利福尼亚州洛杉矶市南加州大学胃肠和肝病科和南加州大学肝病研究中心
罗斯科·D·阿特金森
2加利福尼亚州洛杉矶南加州大学凯克医学院病理学系
加里·卡内尔
2加利福尼亚州洛杉矶南加州大学凯克医学院病理学系
威廉·加德
三ISIS制药公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德
劳里·D·德勒
1加利福尼亚州洛杉矶市南加州大学胃肠和肝病科和南加州大学肝病研究中心
1加利福尼亚州洛杉矶市南加州大学胃肠和肝病科和南加州大学肝病研究中心
2加利福尼亚州洛杉矶南加州大学凯克医学院病理学系
三ISIS制药公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德
通讯作者：Laurie D.DeLeve，医学博士，南加州大学凯克医学院消化道和肝脏疾病科博士，2011 Zonal Avenue-HMR603，Los Angeles CA 90033，电话323-442-3248，传真323-442~3238，ude.csu@eveled公司 - 补充资料
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摘要
背景和目标
以肝窦内皮细胞（LSEC）失去分化为特征的毛细血管化先于肝纤维化的发生。我们研究了恢复肝脏中LSEC的分化是否会影响其与肝星状细胞（HSC）的相互作用，从而促进HSC的静止和纤维化的消退。
方法
用抑制剂和/或激动剂培养大鼠LSEC，并通过扫描电子显微镜检查筛板中的窗孔。用硫代乙酰胺诱导大鼠肝硬化，然后给药BAY60-2770，一种可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）激活剂。天狼星红染色评价纤维化；免疫印迹法检测α-平滑肌肌动蛋白的表达。
结果
维持LSEC分化需要血管内皮生长因子-A刺激一氧化氮（NO）依赖性信号（通过sGC和cGMP）和一氧化氮依赖性信号。在硫代乙酰胺诱导的肝硬化大鼠中，BAY 60-2770可加速毛细血管化的完全逆转（LSEC的恢复分化），而不会直接影响HSC的激活或纤维化。在没有进一步暴露于BAY 60-2770的情况下，LSEC的分化恢复导致HSC停止，纤维化消退。尽管继续使用硫代乙酰胺，但BAY 60-2770激活sGC可阻止肝硬化的进展。
结论
LSEC的分化在大鼠HSC激活和纤维化过程中起着重要作用。
关键词：VEGF，大鼠模型，慢性肝病，开窗
介绍
肝窦内皮细胞（LSEC）在肝星状细胞（HSC）激活和纤维化之前，其高度特异性的表型丢失1,2如果LSEC表型的改变不仅先于HSC激活，而且与HSC激活有因果关系，这将大大提高我们对慢性肝病发展的认识。
有证据表明，LSEC和HSC保持彼此的分化表型。HSC或肝细胞产生的VEGF-A（以下简称VEGF）维持LSEC分化三相反，体外研究表明，分化的LSEC（即开窗LSEC）阻止HSC激活并促进激活的HSC逆转至静止状态，但当它们去分化或“毛细血管化”时，LSEC会失去这种作用4毛细管化定义为体内随着有组织基底膜的形成，LSEC开窗损失5.毛细血管化发生在人类纤维化肝脏中5–7和实验动物模型8–10在酒精性肝损伤发生纤维化之前1，非酒精性脂肪肝2，以及在胃内酒精输注或硫代乙酰胺诱导的实验性肝病模型中（DeLeve LD等人，未发表的观察结果）。综上所述，这些发现表明毛细血管化不仅先于纤维化，而且对其也可能是允许的，并且LSEC分化的变化可能是纤维化发展的一个组成部分。
肝细胞或HSC旁分泌VEGF和VEGF刺激的eNOS下游自分泌NO维持LSEC开窗三,11一氧化氮（NO）可以通过可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）/环鸟苷酸（cGMP）/蛋白激酶G（PKG）途径发挥作用12或通过蛋白质S-亚硝基化13为了研究毛细血管在纤维化过程中的作用，我们研究了这些信号通路中哪些控制LSEC分化体外，使用开窗的存在作为LSEC分化的替代标记，并使用开窗的存在作为毛细管作用的替代标记。体内研究检查了通过激活相关信号通路逆转毛细血管化是否促进HSC静止和纤维化消退，并防止肝硬化进展。
方法
动物研究
雄性Sprague-Dawley大鼠（体重220–250 g）来自Bantin and Kingman Laboratories（加利福尼亚州弗里蒙特）。每周给药两次硫代乙酰胺，200mg/kg i.p。间隔60-277014每天给药0.3 mg/kg。静脉注射20 mg/kg VEGF反义寡核苷酸，每周两次，持续4周。
南加州大学动物护理和使用委员会审查并批准了所有方案，以确保动物得到合乎道德和人道的待遇。本研究遵循国家科学院编制、国家卫生研究院出版的NIH《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物86-23，1985年修订）中概述的指南。
细胞分离和培养
LSEC通过胶原酶灌注、碘克沙醇密度梯度离心和离心淘洗分离，如前所述和修改15,16正常大鼠肝脏的平均产量为1亿个细胞，存活率大于95%，纯度大于99%，这是通过摄取甲醛处理的血清白蛋白（一种LSEC的特异标记物）来确定的17–19.
HSC由南加州大学非肾脏肝细胞亚核心提供。通过胶原酶/蛋白酶消化和Stractan密度梯度离心分离HSC。HSC和LSEC的共培养如前所述4（详情请参见补充材料).
扫描电子显微镜和定量成像
如前所述，对细胞和肝组织进行扫描电子显微镜（SEM）样品制备和孔隙率（窗孔所占LSEC表面的百分比）测量20（详情请参见补充材料).
纤维化和肝硬化的评估
在天狼星红染色切片中，用G.C.K盲目评估纤维化和肝硬化。如前所述，由R.D.A盲目进行全切片扫描形态图像分析2.
统计
所有数据均表示为平均值±平均值标准误差（SE），至少来自三个单独的实验。各组通过方差分析（ANOVA）进行比较，并通过最小显著性差异进行后验对比；或使用Microsoft Excel Analysis ToolPak（Microsoft，Redmond，WA）进行学生t测试。p<0.05的结果被认为是显著的。
结果
VEGF刺激的NO/cGMP途径需要维持LSEC分化
分化的LSEC的主要形态特征，即窗孔组合成筛板，很快就消失了体外
三,21,22培养2天的LSEC失去了开窗作用，但在40 ng/ml VEGF的存在下开窗作用保持良好(). 相反，反义寡核苷酸对肝脏VEGF蛋白的敲除()导致明显的正弦防御()，证实VEGF维持LSEC开窗体内.VEGF通过eNOS催化的NO生成发挥作用三NO信号可以通过可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）/cGMP/蛋白激酶G（PKG）途径发生12和/或通过蛋白质S-亚硝基化13.
VEGF需要维持LSEC表型体外和体内(A类)LSEC与（左面板）和（右面板）VEGF培养2天的典型SEM显示筛板中的窗孔缺失体外在缺乏VEGF的情况下。比例尺，5μm。(B类)VEGF在免疫印迹上的肝脏表达(C类)用VEGF ASO或对照寡核苷酸治疗的大鼠肝窦的典型SEM。*p<0.05。比例尺，2μm。所有数字表示n≥3。
10μM ODQ对sGC活性的抑制作用(补充图1A)或10μM Rp-8-pCPT-PET-cGMPS的PKG活性(补充图1B)完全阻断VEGF维持LSEC开窗()，证实VEGF/cGMP通路对维持LSEC开窗是必要的。
VEGF刺激的cGMP是必要的，但不足以维持LSEC表型体外ODQ（sGC抑制剂）或Rp-8-pCPT-PET-cGMPS（PKG抑制剂）完全阻断培养2天的LSEC中VEGF刺激的（A）开窗和（B）孔隙度。比例尺：5μm.*p<0.001与VEGF对照组相比，n=3。（C） 没有VEGF的YC-1（sGC激活剂）或8-pCPT-cGMP（cGMP类似物）都无法使开窗正常化。然而，VEGF+L-NAME（eNOS抑制剂）+YC-1或VEGF+ODQ+8-pCPT-cGMP使LSEC开窗正常化；因此，需要不依赖NO的VEGF和VEGF刺激的cGMP途径，而VEGF+L-NAME+YC-1的实验也表明蛋白质S-亚硝化是不必要的。比例尺：5μm。（D） （C）中所述实验的孔隙度测量。*p<0.001与VEGF对照组相比；NS，不显著；n=3。
维持LSEC分化需要VEGF通过cGMP途径刺激-NO，再通过NO-依赖途径刺激VEGF
在不含VEGF的情况下，用YC-1（一种NO-依赖性sGC激活剂）或8-pCPT-cGMP（一种cGMP类似物）培养原代LSEC，以确定仅挽救cGMP通路是否足以维持LSEC分化。在缺乏VEGF的情况下，30μM YC-1和100μM 8-pCPT-cGMP都不能维持正常的LSEC窗开度和孔隙度()尽管30μM YC-1导致细胞cGMP水平是VEGF刺激的LSEC的两倍。这些数据表明，维持cGMP通路本身并不能维持正常的LSEC开窗。因此，cGMP途径是必要的，但不足以维持LSEC分化。
除了经典的cGMP途径外，NO还可以诱导蛋白质S-亚硝基化。为了确定是否需要蛋白质S-亚硝化，用VEGF、3mM NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）处理LSEC以抑制VEGF刺激的NO生成，YC-1刺激sGC。在这些条件下不会刺激NO生成，但LSEC保持正常的开窗()证明蛋白质S-亚硝基化对维持开窗是不必要的。此外，当与VEGF、ODQ和cGMP类似物8-pCPT-cGMP一起培养时，LSEC维持开窗，以阻断VEGF刺激的cGMP产生(). 结合上一段所述的研究，这两个实验证明，维持LSEC分化需要VEGF刺激的NO通过cGMP途径工作，加上VEGF独立于NO工作。
为了确认需要VEGF刺激NO，添加L-NAME以抑制VEGF模拟NO的生成。与VEGF和L-NAME孵育2天后，LSEC完全防御(). 为了进一步验证是否需要NO-依赖途径，进行了以下实验。为了确定没有VEGF的NO是否足够，将DETA NONOOate（NO供体）加入培养基中。6μM DETA-NONOate在培养基中产生的NO和LSEC中的cGMP水平与用VEGF培养的LSEC相似（数据未显示），但NO供体未能维持LSEC的正常开窗(). 这表明，没有VEGF的NO是不够的。然而，当LSEC与VEGF、L-NAME（阻断VEGF刺激的NO）和DETA-NONOate孵育时，LSEC的孔隙度保持不变(). 综上所述，这些数据证实，维持正常LSEC开窗需要VEGF诱导的NO依赖性和VEGF刺激的NO。
VEGF依赖NO和VEGF刺激NO都需要维持正常的LSEC开窗用VEGF+L-NAME（左上图）或DETA-NONOate（NO供体；右上图）培养2天的LSEC没有开窗，而用VEGF+L-NAME+DETA-NNOate（左下图）培养2天后的LSEC显示正常开窗。孔隙度显示在右下面板中。比例尺，5μm.*与VEGF对照组相比p<0.001；NS，不显著；n=3。
sGC的激活加速毛细作用的逆转
控制正弦包含许多组合成筛板的窗孔()并用硫代乙酰胺（TAA）治疗3周，显著保护鼻窦(). 定量形态计量学表明，TAA导致孔隙度减少3到4倍，这是窗孔数量和大小的指标(). 中断TAA一周后，开窗的恢复程度最低()，通过孔隙度测量确认(). 此外，LSEC cGMP水平在毛细血管化开始后显著下降，在TAA停药1周后仍保持较低水平()，与以前的报告一致23然而，当大鼠接受3周的TAA后，再接受1周的BAY 60-2770（一种NO-依赖性sGC激活剂14)，LSEC cGMP水平标准化()和开窗()和孔隙度()已恢复。直到TAA停药2周后，毛细血管才发生自发逆转（数据未显示）。这些结果表明，cGMP通路在毛细血管化过程中受到抑制，拯救该通路可加速毛细血管化的逆转。
体内sGC激活可恢复硫代乙酰胺（TAA）诱导的毛细血管化LSEC表型（A） 肝窦的典型SEM。左上图：正常肝窦，有开窗，分为网板。右上图：TAA 3周后毛细血管化。左下面板：停用TAA后1周毛细血管的最小逆转。右下图：停用TAA后，每日服用sGC激活剂1周，完全逆转毛细血管化。比例尺：2μm。（B） 按（A）处理的大鼠的孔隙度。*P＜0。001.（C）根据（A）所示治疗的大鼠分离的LSEC中的细胞cGMP水平。*P<0.001。n=3。
LSEC表型的正常化促进HSC静止和纤维化的消退
要确定体内研究了5个治疗组的毛细血管化逆转是否促进纤维化的消退(). 首先，我们研究sGC激活是否对HSC有直接影响。TAA（第1组）诱导HSC活化三周()和肝硬化()在大鼠体内。TAA停药后一周内使用溶剂（第2组）或使用sGC激活剂BAY 60-2770（第3组）治疗均未显著降低HSC活化()或纤维化(). 这些数据表明，1周的sGC激活剂并没有直接降低HSC的激活体内尽管如前一段所述，LSEC的开窗已经完全正常化。为了研究LSEC分化的恢复是否会减少HSC激活和纤维化，大鼠接受了额外一周的溶剂治疗。通过α-SMA免疫印迹分析评估HSC激活()和免疫荧光()在接受sGC激活剂1周后再进行1周溶剂治疗的肝硬化大鼠中（第5组）。天狼星红染色和全断面扫描形态计量学()与TAA后2周接受溶剂治疗的第4组大鼠相比，肝纤维化显著下降（注：LSEC在TAA和溶剂治疗1周后毛细血管化）。这些数据表明，毛细血管化消失后，正常的LSEC促进HSC静止，并在缺乏sGC激活剂的情况下加速纤维化的消退。α-SMA的下降与sGC活化剂诱导的纤维化消退（第5组）显著大于结蛋白的下降(补充图2B)这表明HSC激活的减少是由于激活的HSC恢复静止和凋亡的结合。
分化LSEC表型的恢复加速了硫代乙酰胺（TAA）诱导的早期肝硬化的消退（A） 5个治疗组的方案（n=9-12）。（B） TAA治疗3周后，免疫印迹密度测定和（C）免疫组织化学显示α-SMA表达升高。停止TAA后1周使用溶剂或sGC激活剂不会改变α-SMA的表达，但当使用sGC激活器1周后再使用溶剂1周时，α-SMA表达显著降低（第5组），而TAA后2周使用溶剂（第4组）。*p<0.001。比例尺，30μm。（D） 典型的天狼星红染色显示TAA治疗3周的大鼠出现早期肝硬化（中上部）。TAA停药后使用溶剂（右上）或sGC激活剂（左下）1周后，肝硬化持续存在，但与TAA后使用溶剂2周的大鼠（中下）相比，在使用sGC激活器1周后再使用溶剂1周（右下），仅观察到桥接性纤维化。比例尺，1.2 mm。（E）通过扫描形态计量学定量纤维化。*p<0.05。
VEGF和VEGF受体2（VEGF-R2）的表达和肝静脉血清VEGF随着纤维化的进展而增加，与文献报道一致24–26随着sGC活化剂诱导的纤维化的消退而降低（第5组；补充图3B–E). eNOS的表达在纤维形成过程中保持不变，与其他组的报告一致25,26但sGC激活剂治疗组（第3组和第5组），即LSEC毛细血管逆转的大鼠中eNOS表达增加(补充图3B).
尽管正在使用TAA治疗，sGC激活仍能恢复LSEC分化并防止肝硬化进展
大鼠接受6周的TAA治疗以诱导肝硬化，并在TAA第4周至第6周接受BAY 60-2770或溶剂的联合治疗。扫描电镜显示，在TAA治疗3周和6周后，LSEC均处于防御状态（第I组和第II组），而在最后3周接受TAA治疗并与sGC激活剂联合治疗的大鼠（第III组）在第6周结束时，开窗和孔隙度完全正常(). 在TAA加sGC激活剂治疗的第三组大鼠中，α-SMA的表达降低()与仅接受6周TAA的II组大鼠相比。天狼星红染色和形态计量分析显示，TAA治疗6周后（第二组）与TAA治疗3周后（第一组）相比，纤维化程度更高，但与仅治疗3周的第一组大鼠相比，TAA加sGC激活剂治疗6周的大鼠（第三组）在第4周至第6周的纤维化没有进展(). 这些数据表明体内sGC激活使LSEC表型正常化，并完全阻止纤维化的进展，尽管TAA持续暴露。
体内sGC激活通过恢复LSEC分化来阻止肝硬化的进展并加速其消退（A） 5个治疗组的方案（n=5）。（B） 代表性SEM（比例尺，2μm）和孔隙度测量（n=4）表明，sGC活化剂处理与溶剂对照（II组）相比，尽管进行了TAA（III组），但完全逆转了毛细作用。*P<0。001.（C）免疫印迹（n=5）和（D）免疫组织化学显示，与TAA治疗6周的大鼠（第II组）相比，第4周至第6周sGC与TAA联合治疗（第III组）降低了α-SMA的表达。停药4周后，与4周前（第III组）或TAA溶剂对照组（第IV组）相比，第V组α-SMA的表达进一步降低。*P＜0.05。比例尺，30μm。（E） 代表性天狼星红染色及其（F）扫描形态计量学（n=5）显示，TAA 6周后（第二组）的纤维化程度高于TAA 3周后（第一组）。TAA加sGC激活剂治疗6周后，与TAA治疗3周（第一组）相比，第4周至第6周（第三组）的纤维化程度没有变化。停止治疗4周后，与溶剂组（IV组）相比，sGC激活剂（V组）后纤维化的消退更大。比例尺，1.2 mm.*P<0.001。
TAA治疗6周后，VEGF和VEGF-R2的表达以及肝静脉血清VEGF的表达增加（第II组），但当sGC激活剂与TAA合用时，其表达显著降低（第III组vs第I和II组）(补充图4B-E). 与未使用sGC激活剂的TAA治疗大鼠（即毛细血管逆转大鼠）相比，在使用TAA加sGC激活物的大鼠中也观察到eNOS表达增加(补充图4B).
晚期纤维化的消退
在停止治疗4周后，对只接受3周TAA的大鼠进行肝脏评估，然后再额外接受3周的TAA（第五组）或不接受（第四组）与sGC激活剂联合治疗3周。在接受sGC激活剂的第V组大鼠中，与4周前（第III组）或与TAA加溶剂对照组（第IV组，). 天狼星红染色和形态计量分析表明，sGC激活剂治疗组在停药4周后的纤维化程度明显低于溶剂对照组(). 与对照组相比，sGC激活剂治疗组的VEGF和VEGF-R2表达以及肝静脉血清VEGF降低，而eNOS表达增加(补充图4B-E). 随着纤维化的消退，α-SMA和结蛋白均降低，但α-SMA的降低幅度更大(补充图5B).
sGC激活逆转活化HSC静止的机制
研究sGC激活剂对HSC的作用机制体外HSC可以在培养基中激活3天以上。从第3天到第6天，HSC在4种不同条件下培养：单独培养，用5μg/ml BAY 60-2770培养，与第3天刚分离的LSEC共培养，或与第3天新分离的LSEC+BAY 60-2-770共培养(). 单独培养的HSC被激活，与LSEC共同培养并没有减少激活的HSC数量，可能是因为这些LSEC已经毛细血管化(补充图6A). 与单独培养的HSC相比，用sGC激活剂培养的HSC-α-SMA阳性细胞有所减少(; 47.4±2.6%对87.4±6.5%α-SMA阳性细胞；n=4，p<0.001）；大于5μg的BAY 60-2770剂量没有提供额外效果（数据未显示）。然而，在LSEC和sGC激活剂存在的情况下，与单独使用sGC激活物培养相比，α-SMA阳性HSC（6.3±1.0%α-SMA）显著减少（n=4，p<0.001）。因此，虽然sGC激活在逆转HSC激活方面的益处有限体外，种群接近完全逆转至静止状态需要与LSEC和sGC激活剂共同培养。用活化的HSC和sGC活化剂培养的LSEC维持开窗(补充图6B); 分化的LSEC导致激活的HSC逆转至静止4这表明sGC激活剂通过其对LSEC分化的作用使活化的HSC（近）完全逆转至静止。大鼠心脏微血管内皮细胞没有阻止HSC激活，这表明LSEC的这种作用不是一种普遍的微血管内皮内皮细胞特性(补充图7).
sGC激活剂完全逆转HSC激活需要LSEC的存在，并且与NO无关（A）上图：与单独的BAY60-2770相比，用LSEC加BAY60-2770培养的HSC中通过共聚焦显微镜测定的α-SMA阳性HSC的百分比较低（p＜0.0001，n＝4）；下面板：HSC的代表性显微照片。HSC第6天：HSC单独培养6天；HSC第0天–6，LSEC第3天–6：从第0-3天开始单独培养HSC，然后从第3-6天开始与第3天分离的LSEC共培养（注意：与活化的HSC培养3天的LSEC被毛细管化）；HSC第0天–6，sGC激活剂第3天–6：第0-6天单独培养HSC，第3-6天培养BAY 60-2770；HSC第0天–6，sGC激活剂+LSEC第3天–6：HSC单独培养3天，然后在第3-6天与第3天分离的LSEC和BAY60-2770共同培养（注：与BAY60-2-770培养3天的LSEC保持分化）（比例尺：40μm，每组n=4-6）。（B）NO不促进HSC静止。α-SMA阳性HSC的百分比在含有或不含DETA-NONOate的HSC中，或与LSEC和BAY 60-2770联合培养的HSC（含或不含L-NAME）中没有显著差异。HSC第6天：HSC单独培养6天；HSC第0天–6，DETA-NONOate第3天–6：第0-6天单独培养HSC，第3天添加DETA-NONOate；HSC第0天–6，BAY+LSEC第3天–6：HSC单独培养3天，然后在第3-6天与第3天分离的LSEC和BAY 60-2770共同培养；HSC第0天–6，sGC激活剂+LSEC+L-NAME第3天–6：HSC单独培养3天，然后在第3-6天与第3天分离的LSEC共培养，再加上BAY 60-2770与L-NAME共培养。每组n=3–6。
上一段中的研究支持这样的概念，即sGC激活器通过LSEC依赖机制对HSC起作用。我们之前报道过LSEC介导的HSC激活逆转是由NO介导的4。我们在目前的研究中重新研究了这一点。为了确定外源性NO是否单独促进激活的HSC逆转至静止状态，将NO供体DETA-NONOate添加到培养3天的HSC中。与单独培养的HSC相比，DETA-NONOate没有减少α-SMA阳性细胞的数量(; 75.4±11.3%对87.4±6.5%α-SMA阳性HSC；n=4，NS）。为了检测阻断LSEC产生NO是否消除LSEC加sGC激活剂对HSC激活的影响，将L-NAME添加到培养3天的HSC中(). L-NAME不能阻止LSEC加sGC激活剂诱导的活化HSC逆转为静止状态。这两项数据表明NO不介导LSEC对HSC表型的影响。我们以前的报告4是对数据的误解：最有可能的解释是L-NAME阻断了VEGF刺激的NO产生，导致LSEC毛细管化()不能促进激活的HSC逆转至静止。
讨论
这里报告的主要发现如下。保持LSEC差异化体外需要VEGF刺激NO通过sGC激活发挥作用，再加上VEGF通过NO-依赖性途径发挥作用。体内研究表明，sGC激活可以逆转肝硬化LSEC毛细血管化。一旦sGC活化使LSEC表型正常化，即使在没有sGC活化剂的情况下，HSC活化和纤维化也会加速逆转。sGC激活剂对HSC激活的逆转作用有限体外但与LSEC和sGC激活剂共同培养时，HSC种群几乎完全逆转至静止状态。尽管正在进行硫代乙酰胺治疗，sGC激活剂也能逆转毛细血管化并阻止肝硬化的进展。
这些发现表明，LSEC分化的恢复促进了HSC的静止，从而加速了衰退并阻止了纤维化的进展。这些体内调查结果证实了之前体外研究4LSEC对HSC激活的影响，以及LSEC被毛细化后缺乏影响。因此，提出的范式是，差异化LSEC具有促进HSC静止的守门人功能，并且该守门人职能随着毛细作用而丧失。sGC激活诱导的LSEC分化导致HSCα-SMA表达减少，结蛋白阳性细胞减少。然而，由于结蛋白阳性细胞（总HSC数）的下降幅度大大小于α-SMA阳性细胞（活化HSC）的下降，这表明HSC凋亡以及HSC恢复到静止状态都是一个因素。这种恢复静止和凋亡的混合现象与其他研究人员最近的报告一致27,28TUNEL在所有组中均为阴性（数据未显示），但这可能是一个假阴性：TUNEL是一个快速转变过程的定格，可能难以捕捉。
sGC激活器阻止HSC激活体外（数据未显示），与之前使用cGMP类似物的报告一致29然而，我们没有观察到sGC激活剂对HSC的直接影响体内在已确立的纤维化中，只有有限的体外对活化HSC的影响。观察到静止的HSC表达α1β1cGMP生成和下游事件需要异二聚体形式的sGC，但α1β1激活的HSC中检测不到异二聚体sGC30因此，sGC激活可能通过保存LSEC表型和防止HSC激活来防止从正常肝向纤维化肝的转变。然而，一旦纤维化形成，HSC已经被激活，并且对sGC激活剂无反应。因此，在已建立的纤维化中，sGC激活通过恢复LSEC分化以及随后SEC与HSC的串扰，而不是直接作用于HSC，诱导现有纤维化的消退并阻止纤维化的进展。
VEGF刺激的NO维持LSEC分化三目前的研究检查了下游信号转导，并证明VEGF刺激的cGMP通路对于维持LSEC分化是必要的，但还不够。维持LSEC分化需要两条VEGF途径：VEGF独立于NO，加上VEGF刺激的NO通过cGMP途径发挥作用。VEGF激活了多种信号通路，包括MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）、FAK（粘着斑激酶）、PI3K/Akt（磷脂酰肌醇3-激酶）和PLC-γ（磷脂酶C-γ）31肌动蛋白细胞骨架丝可能在LSEC开窗中起作用32–34因此，负责肌动蛋白重组的MAPK途径可能是NO-依赖性途径的良好候选途径。尽管VEGF是维持LSEC分化的关键因素，但VEGF和VEGF-R2在纤维化中增加，表明毛细血管化是由于VEGF下游信号传导的中断。随着cGMP水平的恢复体内足以使LSEC表型正常化，这表明导致肝硬化模型毛细血管化的极限缺陷是NO/sGC/cGMP途径。这些发现与观察到的肝硬化LSEC中eNOS活性、NO产生和细胞cGMP水平的下降一致23,35,36.
这里报道的结果有几个临床意义。首先，在毛细血管化的肝脏中恢复LSEC表型可能是一种可行的方法，可以促进纤维化的消退或在面临持续的侮辱时预防疾病的进展。第二，在aging相关的假球化中37,38开窗缺失会降低乳糜微粒残留的清除率。循环乳糜微粒残留的增加被认为在动脉粥样硬化的发生中起着关键作用39,40此外，LSEC清除剂受体介导的内吞作用随着年龄的增长而下降41可能有助于动脉粥样硬化的进展41,42因此，恢复LSEC分化可能是动脉粥样硬化的治疗方法。第三，有大量关于各种血管床中内皮细胞-脂肪细胞相互作用的文献43–47这表明目前的研究结果可能也适用于其他器官，如肺或肾，并为纤维化提供了类似的治疗策略。
致谢
作者感谢Robert S.McCuskey（亚利桑那大学）在扫描电子显微镜方面的帮助，以及Michelle MacVeigh-Aloni在免疫染色和共焦显微镜方面的协助。
拨款支持：这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R01-DK66423（L.D.D）和南加州大学肝病研究中心组织学和显微镜子核心的支持（美国国立卫生院拨款P30DK048522）。
缩写
| α-SMA | α-平滑肌肌动蛋白 |
| 电子NOS | 内皮型一氧化氮合酶 |
| HSC公司 | 肝星状细胞 |
| LSEC公司 | 肝窦内皮细胞 |
| L名称 | NG-硝基-L-精氨酸甲酯 |
| 不 | 一氧化氮 |
| OsO公司4 | 四氧化锇 |
| 一包 | 蛋白激酶G |
| 扫描电镜 | 扫描电子显微镜 |
| TAA公司 | 硫代乙酰胺 |
| sGC公司 | 可溶性鸟苷酸环化酶 |
| 血管内皮生长因子 | 血管内皮生长因子 |
| 血管内皮生长因子-R2 | 血管内皮生长因子2 |
脚注
披露：没有一位作者与这份手稿中的作品存在经济利益冲突。
作者贡献：G.X.设计和执行实验，分析数据，并撰写手稿；X.W.、L.W.和L.W.设计并执行了实验；R.D.A.对纤维化进行全断面扫描形态图像分析；G.C.K对肝脏组织学进行半定量盲法评分；W.A.G.提供了VEGF和反义寡核苷酸及其使用指南；L.D.D设计实验，监督研究，分析数据，并撰写手稿。
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工具书类
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