ASH2L调节向MLL的泛素化信号传导：高等真核生物中H3 K4甲基化的反式调节

ASH2L翼螺旋基序（WH）对泛素依赖性反式调节很重要

ASH2L蛋白采用模块化结构，包括PHD指、翼螺旋（WH）基序、SPRY结构域和DPY-30结合基序（DBM）(图1A). 鉴于ASH2L N末端对组蛋白泛素化甲基化串扰至关重要，我们进一步研究了哪些结构域，PHD指或WH基序，对反式调节至关重要。为此，我们以适当的化学计量比重建了四种不同的MLL核心复合物，其中包含以下ASH2L突变体：ΔPHD、K131A、K99A和K131/99A(补充图1B). 突变ASH2L WH基序的K131或K99导致ASH2L DNA结合受损在体外特别是K131A，将ASH2L招募人数减少至霍克斯细胞中的位点(Chen等人，2011年).

接下来，我们测试了这些重组复合物执行H3 K4甲基化的能力。如所示图1C，所有ASH2L突变体都影响核小体上MLL核心复合物的整体活性，这表明它们在调节MLL甲基转移酶活性中的作用。然而，只有ASH2L K99A或K131/K99A突变体进一步消除了MSL1/2依赖性H3 K4甲基化。无论是K99A还是K131/99A双突变体的MLL复合物，无论是否存在MSL1/2依赖性H2B泛素化，其活性都相同(图1C第5车道对第6车道，第7车道对第8车道）。这一结果表明，ASH2L K99对于介导H2BK34ub和H3 K4甲基化之间的反调节至关重要。相反，K131突变或N末端PHD指缺失对H2Bub依赖性激活没有影响。为了进一步研究这是否对MSL1/2介导的调节（即通过H2BK34ub）具有特异性，我们使用RNF20/40作为E3泛素连接酶建立了类似的实验(补充图2B). 结果如所示图1D，证明K99对RNF20/40介导的调节（即通过H2BK120ub）也是必不可少的。带有ASH2L K99A或K131/99A突变的MLL复合物未显示出依赖RNF20/40的H3 K4甲基化增加(图1D). 一起，我们的在体外HMT实验表明，ASH2L WH基序中的K99对H2Bub相关串扰至关重要。

组蛋白泛素化是反调节的主要贡献者在体外

我们之前证明MSL1/2底物H2BK34突变为精氨酸（R）可消除MLL的反调节(Wu等人，2011年). 在这里，我们决定进一步测试MLL复合物的成分是否可以在在体外如果是，它们是否以与ySwd2相同的方式促进反调节(Vitaliano-Prunier等人，2008年). 为此，我们首先测试了MSL1/2介导的每种MLL核心成分的泛素化在体外。如所示补充图3A，我们能够检测到低水平ASH2L泛素化（ASH2Lub）。在相同条件下未检测到其他三种蛋白质（即RbBP5、WDR5和MLL）的泛素化(补充图3B–3D). 接下来，我们建立了一个两步程序来区分H2Bub和ASH2Lub在以下甲基化反应中的功能（方案见图2A和2B). 具体来说，我们在进行组蛋白甲基化之前，进行了GST下拉以去除GST标记的E2酶（GST-UbcH5C）。这使我们能够在进行组蛋白甲基化反应之前停止核小体（2A）或MLL复合物（2B）的泛素化反应。作为控制，我们使用未标记的UbcH5C作为E2来模拟GST下拉。我们发现核小体先前的泛素化能够刺激核小体H3上的MLL甲基转移酶活性(图2A，右侧面板）。无论是否去除E2酶，MLL复合物的活性均受到同等刺激(图2A，车道2与车道4）。相反，一旦去除ubcH5C以防止H2B泛素化，先前的MLL复合物泛素化对H3 K4甲基化没有影响(图2B，车道2与车道4）。这些结果支持H2Bub在我们的检测条件下是反调节的主要贡献者。值得注意的是，在我们的分析中，鉴于ASH2Lub水平较低(补充图3A)，我们不能排除我们的在体外HMT分析不够敏感，无法检测ASH2Lub对MLL活性的可能刺激。

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图2

核小体泛素化而非MLL复合物组分有助于H3 K4甲基化的反调节

答：。左图为实验程序方案。重组核小体经MSL1/2体外泛素化后，GST-UbcH5C通过GST下拉去除。未结合部分中的核小体受到在体外通过添加MLL复合物和[^三H] -SAM。正确，重组核小体的体外HMT分析。甲基化H3表示为[^三H] -H3。定量[^三H] -H3表示为车道1的相对强度，任意设置为1。核小体的考马斯染色凝胶作为负荷对照。底部面板是输入UbcH5C、未结合UbcH3C和泛素化H2Bub的西方墨迹，如左图所示。用于检测的抗体显示在右侧。B。左图为实验程序方案。在MSL1/2对MLL复合物进行体外泛素化后，GST-UbcH5C通过GST下拉去除。未结合部分进一步与底物核小体和[^三H] -SAM用于在体外HMT分析。对，重组核小体的体外HMT分析。甲基化H3表示为[^三H] -H3。定量[^三H] -H3表示为车道1的相对强度，任意设置为1。核小体的考马斯染色凝胶作为负荷对照。底部面板是输入UbcH5C、未结合UbcH3C和泛素化H2Bub的西方墨迹，如左图所示。用于检测的抗体显示在右侧。另请参见补充图S3.

ASH2L K99A对泛素化核小体的亲和力降低

为了进一步了解ASH2L在反调节中的作用，我们测试了ASH2L是否直接与游离泛素相互作用，如果是，K99是否对这种相互作用至关重要。为此，我们用泛素培养FLAG标记的野生型ASH2L、ASH2L K131A或ASH2L K99A。在FLAG纯化后，我们用免疫印迹法检测结合组分中的泛素。采用不含ASH2L的模型纯化作为阴性对照。如所示图3A野生型和K131A ASH2L均能与泛素直接相互作用，在相同的检测条件下，K99A突变体的这种相互作用大大减少，表明ASH2L K99直接参与泛素识别。

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图3

ASH2L K99A降低MLL对泛素化核小体的亲和力

答：。使用泛素以及Flag标记的全长野生型ASH2L、K99A或K131A突变体的Co-IP实验。结合到M2珠的蛋白质被洗脱，并用所示的抗泛素或抗ASH2L抗体检测。输入物中泛素的免疫印迹作为对照。（B、C）含有His标记H2B的重组核小体被泛素化在体外通过MSL1/2综合体(B类)或RNF20/40复合体(C类). 将未修饰和泛素化的核小体分开，并在存在野生型ASH2L或如顶部所示的ASH2L突变体的情况下进行下拉分析。Ni-NTA纯化后，洗脱结合蛋白并用左图所示的特异性抗体检测。对照组包括输入Ash2L的免疫印迹。另请参见补充图S2D.

因为ASH2L WH基序参与核小体相互作用(Chen等人，2011年)一个合乎逻辑的扩展是检查K99A突变是否影响ASH2L与泛素化核小体的结合。为此，我们重组了含有His-tagged H2B的重组核小体，并对其进行MSL1/2(图3B)或RNF20/40(图3C)调解的在体外泛素化。然后将未修饰和泛素化的核小体分别与野生型、K131A、K99A或ΔPHD ASH2L混合进行下拉实验。与野生型ASH2L相比，ASH2L K131A和ASH2LΔPHD对核小体的总亲和力更低(图3B第3、7和1条通道），与它们各自在介导DNA中的作用一致(Chen等人，2011年)和组蛋白结合(补充图2D). 尽管相互作用较弱，但这两个ASH2L突变体对任一MSL复合物泛素化的核小体都表现出较高的亲和力(图3B)或RNF20/40(图3C). 相反，ASH2L K99A对H2B泛素化核小体没有偏好性。在与野生型ASH2L相当的水平上，它与未修饰和修饰核小体的结合同样良好(图3B和3C). 这些结果表明：1）ASH2L对H2B泛素化核小体具有较高的亲和力，可能是其与泛素直接相互作用的结果；2） ASH2L对泛素化核小体的偏好需要WH基序中的K99；和3）尽管K99A在DNA结合中起作用，但它对ASH2L与未修饰核小体的相互作用没有显著影响(Chen等人，2011年). 这与ASH2L K99A在霍克斯细胞中的位点(Chen等人，2011年).

MLL家族组蛋白甲基转移酶的反调节

H3 K4甲基化机制的复杂性是高等真核生物的一个独特特征(Rutenburg等人，2007年). 有六种MLL/hSET1家族HMT在哺乳动物中进行H3 K4甲基化，它们共享一组共同的核心成分，包括WDR5、RbBP5和ASH2L(Dou等人，2006年). 尽管进行了广泛的研究，但尚不清楚是否所有MLL家族HMT都受到H2Bub的调节。我们决定检测另外两种MLL家族HMT，hSET1和MLL3的反式调节。我们询问hSET1和MLL3是否受到H2Bub的反调节，如果是，是否需要ASH2L WH基序。为此，我们重组了含有野生型和ASH2L突变体的hSET1和MLL3核心复合物(补充图1B，中间和底部面板），并使其受到在体外HMT分析。与MLL一样，hSET1核心复合物在泛素化核小体上表现出较高的甲基转移酶活性(补充图4). ASH2L K99A突变体以与MLL复合物中相同的方式大大降低了H2Bub依赖性刺激。同样，ASH2L K131A突变虽然影响hSET1复合物的整体活性，但对H2Bub依赖性刺激没有影响。令我们惊讶的是，尽管MLL SET结构域具有高度保守的核心复合物构型和序列同源性，但MLL3核心复合物并未表现出H2Bub依赖性刺激(图4). MLL3核心复合物在核小体上的活性与MSL1/2修饰前后相同(图4A)或RNF20/40(图4B). 与缺乏泛素依赖性刺激一致，ASH2L K99A突变对MLL3复合物的整体活性没有影响(图4A和4B). 值得注意的是，无论MLL3核心复合物的泛素化状态如何，ASH2L K131A突变体始终降低其整体活性(图4A和4B，车道1与3）。这表明WH基序介导的核小体相互作用通常是MLL家族HMT活性所必需的。MLL3未能在泛素化核小体上显示活化，并不是因为酶分析相关的修饰水平低。我们的表现类似在体外使用含有野生型或化学合成H2BK120ub的重组核小体作为底物进行HMT分析，结果相同(图4C). 令人惊讶的是，我们发现MLL3核心复合物主要是H3 K4单甲基转移酶，尽管其序列与MLL同源^{SET（设置）}(图4C)H2BK120ub对该活性无影响。相反，H2Bub能够刺激MLL的单、二和三甲基化活性在体外H2BK120ub所有三种甲基化状态的增加表明，H2Bub的反调节影响MLL复合物的整体活性，而不是加工性。MLL家族HMT中H3 K4甲基化特异性和泛素依赖性反应的多样性可能反映了它们在高等真核生物中尚待表征的差异。

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图4

不同MLL家族HMT的转调节

答：。 体外使用重组核小体进行HMT检测，之前是否通过MSL1/2进行泛素化（A）或RNF20/40复合体（B）MLL3复合物的反应如顶部所示进行设置。对于A和B，顶部面板是[^三H] H3甲基化和底部面板是核小体底物的考马斯染色凝胶。定量[^三H] -H3表示为车道1的相对强度，任意设置为1。C、。左图：用于未经修饰的重组核小体（rNuc）和含有化学合成H2BK120ub的核小体的考马斯染色凝胶^{Ub（英国）}). 右侧：在体外使用组蛋白八聚体或具有或不具有H2BK120ub的核小体作为底物的HMT测定，如左图所示。如顶部所示，使用MLL或MLL3复合体。如右图所示，使用抗体通过免疫印迹检测H3 K4单甲基化、二甲基化和三甲基化。另请参见补充图S5A.

共价连接在H2B N末端的泛素能够刺激MLL甲基转移酶活性

使用化学合成的H2BK120，我们发现H2Bub仅在核小体环境中发挥其功能。泛素或游离H2BK120ub（组蛋白八聚体中）不能调节MLL活性在trans中(图4C，顶部面板）。我们设想了核小体H2Bub调节MLL整体活性的三种模型：首先，H2Bub可以诱导核小体上的变构变化，进而通过ASH2L增强MLL活性。其次，H2Bu进一步稳定ASH2L与泛素化核小体的相互作用，除了与核小体DNA和/或组蛋白H3和H4的相互作用外。ASH2L与泛素化核小体亲和力的增加足以增强MLL活性。第三，稳定的ASH2L泛素相互作用促进MLL复合物中的变构变化，这对优化催化至关重要。为了区分这些模型，我们设置了两个单独的实验。首先，我们决定通过30mer聚链（GS）30将泛素分子共价连接到组蛋白H2B（N-Ub-H2B）的N末端，从而将其从核小体核心粒子移开。我们将N-Ub-H2B重组为核小体在体外HMT分析。如所示补充图5，游离N-Ub-H2B（以组蛋白八聚体形式）对H3 K4甲基化没有影响。然而，N-Ub-H2B能够适度增强核小体背景下的MLL活性(补充图5，右侧面板）。作为对照，N-Ub-H2B对MLL3活性没有影响(补充图5). 值得注意的是，N-Ub-H2B对MLL活性的刺激作用不如H2BK120ub或H2BK34ub明显（参见图1C和1D). 然而，N-Ub-H2B调节MLL活性的能力表明，H2Bub介导的反调节可能涉及核小体核心颗粒变构变化以外的机制。

共价连接到ASH2L或RbBP5的泛素能够刺激MLL甲基转移酶活性

根据N-Ub-H2B实验的结果，我们接下来测试了H2B上的泛素是否仅用于稳定ASH2L与核小体的相互作用，还是通过ASH2L促进变构变化，从而实现更有效的MLL催化。为了区分这两种可能性，我们制作了一种泛素融合蛋白Ub-ASH2L，其中泛素与ASH2L N末端共价连接(补充图6A). 我们还为其他MLL复合物成分（包括RbBP5和WDR5）制作了额外的Ub融合蛋白作为对照(补充图6B). 在所有情况下，泛素分子都通过多链（GS）共价连接到蛋白质上₃₀融合蛋白分别并入MLL复合物，其化学计量比与其野生型对应物相同(补充图6). 我们认为，如果泛素仅用于稳定ASH2L与核小体的相互作用，那么Ub-ASH2L可能不会影响MLL甲基转移酶的活性。另一方面，如果泛素能够诱导MLL复合体的变构变化，那么稳定地定位在ASH2L WH基序附近的泛素也可能能够刺激MLL活性。如所示图5A在没有H2Bub的情况下，Ub-ASH2L能够增强核小体H3上的MLL甲基转移酶活性。与H2BK120ub类似，Ub-ASH2L能够增强核小体H3K4的单甲基化、二甲基化和三甲基化的MLL的总活性，而不能调节MLL3的活性(图5B). 重要的是，Ub-ASH2L中K99A的突变削弱了MLL刺激，表明K99是调节MLL复合体构象变化的关键残基。为了进一步支持核小体的可有可无的作用，Ub-ASH2L能够在没有核小体背景的情况下增强游离组蛋白H3的甲基化(图5A，底部面板）。总之，我们的结果表明，泛素至少部分通过ASH2L发挥作用，诱导MLL复合物的变构变化，以实现更高的甲基转移酶活性。

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图5

MLL活性调控Ub-融合蛋白

答：。 体外HMT分析含有ASH2L、ASH2L K99A、Ub-ASH2L或Ub-ASH2L K99A的重组MLL核心复合物，如顶部所示。如左图所示，使用重组核小体（rNuc）或游离H3作为底物。对于每个基板，顶面板是[^三H] -H3甲基化检测和底部面板是用于核小体或游离组蛋白H3底物的考马斯染色凝胶。定量[^三H] -H3表示为车道1的相对强度，任意设置为1。B。 体外如顶部所示，使用MLL或MLL3与ASH2L或Ub-ASH2L复合物进行HMT分析。使用未修饰的核小体作为底物，使用右侧所示抗体通过免疫印迹分析H3 K4单甲基化、二甲基化或三甲基化。另请参见补充图S6和S7.

有趣的是，Ub-RbBP5（而不是Ub-WDR5）也能够调节未修饰核小体上的MLL活性，尽管程度较小(补充图7). ASH2L K99A突变显著削弱了这种调节。值得注意的是，RbBP5与ASH2L形成稳定的异二聚体，而WDR5与MLL复合物中的ASH2L没有直接相互作用(曹等人，2010;Dou等人，2006年). 这些结果表明，泛素需要与ASH2L接近才能有效地进行反调节（见讨论）。

H2A泛素化对H3 K4甲基化的调节涉及不同的机制

为了进一步探索泛素位置的空间需求，我们研究了另一个重要的组蛋白泛素化事件，即组蛋白H2Aub by RING1b/BMI1如何影响MLL活性。为此，我们使用H2A泛素化核小体(补充图2C)作为基板在体外HMT分析。与H2Bub相反，RING1b/BMI1介导的H2Aub通过MLL核心复合物显著降低H3甲基化(图6A). 这种抑制不由ASH2L WH基序介导，因为含有ASH2L K133A或K99A突变体的MLL复合物同样受到影响(图6A). MLL3核心复合物的活性也受到H2Aub的轻微影响(图6A)，与之前的报告一致(Nakagawa等人，2008年). ASH2L在H2Aub介导的抑制中的可有可无以及H2AK119ub对MLL和MLL3的抑制表明，这两种反调节事件可能涉及不同的机制。考虑到H2AK119ub距离H3尾部很近(图6B,Luger等人，1997年)，H2AK119ub可以通过酶-底物相互作用的直接空间位阻影响MLL活性，这是H2AK119ub介导的抑制H3 K27甲基化的假说(Whitcomb等人，2012年). H2AK119ub对拮抗PRC2和MLL复合物活性的抑制揭示了H2Aub通过RING1b/BMI1在调节H3甲基化中的双重作用，这将是未来研究的兴趣所在。

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图6

H2AK119ub对H3 K4甲基化的反调节

答：。 体外如顶部所示，使用含有野生型ASH2L或ASH2L突变体的MLL（左）或MLL3（右）复合物进行HMT分析。底物是重组核小体，具有或不具有先前通过RING1B/BMI1复合物的泛素化。的荧光图[^三H] 包括-H3甲基化。定量[^三H] -H3表示为车道1（MLL）或车道7（MLL3）的相对强度，任意设置为1。底部面板是用于重组核小体的考马斯染色凝胶，作为负载控制。B。核小体结构示意图（PDB:1AOI，Luger等人，1997）。文中讨论的不同赖氨酸残基突出显示。另请参见补充图S1和S2.

H2Bub调节H3 K4与K79甲基化的不同机制

众所周知，H2Bub调节H3 K4和H3 K79甲基化。虽然H2Bub调节DOT1L/H3K79me的机制已经得到了很好的研究，但H2Bub如何调节高等真核生物中的MLL/H3K 4me尚不清楚。我们的研究表明，这两种组蛋白串扰事件可能具有不同的潜在机制，如以下观察结果所示：1)H2Bub以核内方式增强DOT1L介导的甲基化。H3 K79的有效甲基化需要存在H2Bub顺式（即在同一核小体上）(McGinty等人，2008年). 相反，H3 K4甲基化可发生泛素依赖性调节在trans中泛素可以在核小体H2B或ASH2L上刺激H3K4甲基化。在后一种情况下，完整的核小体是可选的，可以在游离组蛋白H3上观察到增强的活性(图5A、底部面板和补充图7A和7B). 值得注意的是，游离泛素或H2Bub不能刺激MLL活性在trans中，提示需要额外的蛋白质或蛋白质-DNA接触来稳定ASH2L泛素相互作用；2)DOT1L向单核小体的募集不是泛素化的功能。DOT1L对泛素化核小体和未修饰核小体具有相似的亲和力。(McGinty等人，2008年). 这表明泛素可能诱导核小体的变构变化，DOT1L可以检测到这种变构变化以获得最佳活性。相反，ASH2L对泛素化核小体有较高的亲和力(图3B和3C)并直接与泛素相互作用(图3A). ASH2L和泛素的直接相互作用可能通过诱导酶而非底物的变构变化来增强H3K4甲基化。在进一步的支持中，我们发现泛素将~60个氨基酸放置在远离核小体核心颗粒的位置（通过（GS）₃₀聚链）能够通过MLL增加H3 K4甲基化(补充图5).

H2Bub依赖性调节的两种不同机制的采用可能反映了H3 K4和H3 K79在核小体中的相对位置及其对各自修饰酶的可及性。我们设想H3 K79的部分可接近位置需要泛素化诱导的构象变化来改变固有核小体稳定性和/或表面电荷，以允许DOT1L以催化活性的方式结合(McGinty等人，2008年;沃纳和鲁森伯格，2011年). 因此，串扰仅限于同一核小体上的修饰。相反，H3N末端的K4对酶来说是完全可接近的，核小体核心颗粒没有变化。在这种情况下，泛素（在H2B或非组蛋白上）能够通过与ASH2L直接接触来刺激MLL复合体的酶活性。只要泛素-ASH2L相互作用稳定，泛素和H3 K4机制之间的通讯不一定局限于核小体甚至染色质。这预示着从蛋白质泛素化到甲基化的信号转导将比H2Bub和H3 K4甲基化的串扰更广泛，这将是未来研究的兴趣所在。

鉴于H2Bub（而非H2Aub）能够通过ASH2L调节MLL活性，泛素与ASH2L和/或MLL SET结构域的相对位置似乎对这种反调节很重要。MLL核心复合物可能以特定方式与核小体相互作用，从而使活性位点与H3底物最佳对齐。未来对核小体MLL复合物的结构研究对于完全理解这种反调节是必要的。

H2Bub介导的H3 K4和K79甲基化的共同特征

尽管存在不同的机制，但H2Bub对H3 K4和K79甲基化的调节具有一些共同特征。与DOT1L类似(McGinty等人，2008年)，H2Bub能够刺激MLL复合物的整体活性。虽然MLL复合物主要催化单甲基化和双甲基化，但H2Bub促进所有三种H3 K4甲基化状态(图4C). 值得注意的是，先前的酵母遗传分析表明，H2Bub影响细胞中的H3K4me2和H3K4me3，但不影响H3K4me1(Dehe等人，2006年;Shahbazian等人，2005年)支持H2Bub在调节ySET1过程中的作用。我们发现ASH2L显性阴性突变体的过度表达也会导致H3K4me2和H3K4me3的类似减少(图7A)或通过敲低HeLa细胞中的ASH2L基因(Dou等人，2006年). 然而，我们在体外生化分析清楚地表明，H2Bub或Ub-ASH2L大大增强了H3-K4甲基化的所有三种状态(图4C和​和5B）。5亿). 因此，细胞分析的结果可能是由于MLL家族HMT的多重性以及直接或间接参与H3 K4调节的染色质因子的变化的综合影响。我们的发现强调了使用在体外直接评估酶处理能力以避免数据解释中的并发症的生化分析。H3 K4和K79甲基化反调节的另一个共同特征是赖氨酸侧链的泛素化不需要(图5A和Chatterjee等人，2010年). 泛素可以通过多链以化学方式附着在H2B（K79）或非组蛋白N末端（K4）的半胱氨酸残基上，同时在反调节中保持有效。在这两种情况下，泛素锚定位点也具有灵活性。

ASH2L WH基序在串扰调节中的作用在trans中

我们研究的一个令人惊讶的发现是，H2Bub介导的反调节依赖于ASH2L WH基序，这是一个远离催化位点的区域。我们之前已经证明ASH2L在调节MLL活性方面是独特的，因为它的C末端SPRY结构域是活性位点的一部分，并稳定MLL的相互作用^{SET（设置）}带基板(曹等人，2010). 在这里，我们表明ASH2L N末端在以下方面也在调节MLL甲基转移酶活性中发挥作用：1）ASH2L-N通过与核小体底物结合增强H3K4的整体甲基化。这是通过PHD的组蛋白H3/H4相互作用介导的(补充图2D)通过WH基序的DNA相互作用(Chen等人，2011年、和图1C和1D); 2）ASH2L-N介导与泛素的相互作用。有趣的是，ASH2L WH基序参与两种功能，WH基模中两个残基（即K131A和K99A）的突变分别破坏了这两种功能。具体而言，ASH2L K131A显著降低了两种DNA的亲和力(Chen等人，2011年)和核小体(图3)这导致MLL复合体的整体活性降低。另一方面，ASH2L K99A干扰泛素相互作用并消除泛素依赖性调节H3 K4甲基化。这两个突变体的不同结果表明，ASH2L与核小体结合本身不足以进行反调节。因此，泛素可能通过ASH2L提供额外的信号以增强MLL活性。事实上，当泛素被置于ASH2L或RbBP5上时，H3甲基化的反调节被保留。需要进一步研究泛素化信号如何传递到MLL催化位点以增强其活性。泛素可能诱导ASH2L的构象变化，从而导致MLL核心复合物的变化，从而实现最佳催化(图7C).

有趣的是，我们发现ASH2L可以被MSL1/2弱泛素化在体外(补充图3A). 虽然在我们的分析条件下，我们无法检测到ASH2Lub对MLL活性的依赖性刺激(图2B)，我们的结果并不排除较高水平的ASH2L泛素化可能在这种反调节中发挥作用。在这种情况下，ASH2L泛素化可以在MLL复合物中诱导类似的构象变化，从而导致进一步激活。鉴于这种可能性，我们注意到以前在酵母中的研究表明，ySET1复合物成分Swd2是泛素化的，其泛素化是Spp1招募所必需的，Spp1是一种共享ASH2L N末端结构的ySET1蛋白，也是Rad6/Bre1介导的H3 K4甲基化所必需的(Vitaliano-Prunier等人，2008年). 测试组蛋白串扰是否通过蛋白泛素化的保守机制进行调节将是一件有趣的事情。

质粒和重组蛋白

将人Ash2L的RbBP5、WDR5、野生型、K99A和K131A、MLL的SET结构域、MLL3和Set1构建体克隆在基于pET28a的SUMO载体中用于细菌表达。将泛素的cDNA连接到Ash2L、RbBP5和H2B的N末端，将其亚克隆到pET28a载体中用于泛素化蛋白表达。泛素、Flag-Ash2L及其突变体也被构建到pET28a载体中。其他结构包括MSL1、MSL2、RNF20、RNF40，如前所述(Wu等人，2011年).

体外组蛋白泛素化和甲基化分析

对于在体外使用组蛋白泛素化分析、100 ng E1、500 ng E2和1ug不同的E3复合物。在30°C下，将它们与1ug HA-泛素、1ug游离组蛋白或核小体在20 ul反应缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 7.9）、5 mM MgCl2、2 mM NaF、0.5 mM DTT和4 mM ATP）中孵育1小时。通过添加2XSDS负载缓冲液停止反应，并使用泛素化分子的抗HA抗体、特异性赖氨酸泛素化的抗H2B K120ub或抗H2A K119ub抗体进行免疫印迹。hE1（E-304）、hRAD6B（E2-613）、hUbcH5c（E2-627）、hUbcH13（E2-664）和HA-ubiquitin（U-110）均来自Boston Biochem。

对于在体外组蛋白甲基化（HMT）检测，在10uM H存在下，用5ul HMT缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0，10%甘油）进一步培养带有或不带有ATP的完整泛素化反应（如上）^三-SAM、100ng重组MLL复合物（总蛋白量）或DOT1L在30°C下放置一小时。通过放射自显影检测甲基at离子。

过度表达和击倒实验

为了进行过表达研究，将表达Myc-tagged ASH2L、ASH2L K131A和ASH2L K99A的载体联合转染到HeLa细胞中。对于敲除实验，如前所述，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将对照或MSL2L shRNA载体（Sigma Mission）转染HeLa细胞(Wu等人，2011年). 如前所述，在最后一次转染48小时后，从这些样品中提取总组蛋白(Dou等人，1999年).

核小体下拉和Co-IP实验

将His标记核小体和靶MLL复合物混合在结合缓冲液（0.1%NP-40，0.5mg/ml BSA，250mM NaCl，Tris-HCl pH7.5，20mM咪唑）中1小时，然后与30μL Ni-NTA浆液孵育3小时。用结合缓冲液洗涤后，用250mM咪唑和100mM氯化钠洗脱结合蛋白。洗脱后的蛋白质进行ASH2L印迹。

对于Co-IP实验，将纯化的His-Flag-Ash2L WT、K99A和K131A蛋白与泛素混合在结合缓冲液中（0.1%NP-40、0.5mg/ml BSA、NaCl 250mM、Tris-HCl pH 7.5）。将混合物与标记珠结合3小时，然后用20mM标记肽洗脱结合蛋白并用免疫印迹检测。

这项工作得到了NIGMS（GM082856）、美国癌症学会（ACS）、SU2C以及白血病和淋巴瘤学会学者YD的资助。我们感谢Ming Lei博士和Yong Chen博士为ASH2L、MLL和MLL3 SET域的表达载体以及项目的一般性讨论。