mTOR与Rheb-GTPase和猛禽的直接相互作用：使用荧光寿命成像进行亚细胞定位

摘要

背景

哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）信号通路在细胞调节中起着关键作用，并参与多种疾病。mTOR是细胞生长、衰老、核糖体生物生成、蛋白质合成、肌动蛋白-细胞骨架组织、自噬和代谢的中心调节器。它在耦合细胞生长中也起着重要作用通过信号通路，根据营养物质、细胞能量供应和氧气的可用性[1]. mTOR形成两种不同的异聚物，mTORC1和mTORC2。mTORC1包含mTOR，猛禽(第页调节一有关联的第页mTOR蛋白）、mLST8和PRAS40[2-5]，而mTORC2含有mTOR、rictor（雷帕霉素对mTOR不敏感的伴侣）、mLST8、mSin1和原[6-9]，猛禽和里克特分别是mTORC1和mTORC2的特定成分。

瑞布(R（右）作为小时独白e（电子）丰富的b条rain）是一种小的GTP结合蛋白，已被证明可以促进哺乳动物细胞和果蝇细胞的细胞生长和控制细胞大小[10]是一种关键蛋白质，传递上游信号以调节mTORC1。Rheb在这些重要复合物中的参与尚不清楚。然而，据报道，Rheb直接与mTOR催化结构域的氨基端叶结合，并以GTP/GDP依赖的方式激活mTOR激酶[11]在细胞裂解物研究中，尽管使用这种方法很难证明直接的相互作用。此外，使用下拉分析方法的证据表明Rheb与mLST8和猛禽相关[11,12]. mTORC1和mTORC2复合物在涉及人类癌症和其他重要疾病的几种途径中都发挥着关键作用，这使得开发这些途径的抑制剂成为制药/生物技术行业的高度优先事项。

据报道，Rheb–TSC2 GAP活性可能刺激mTOR磷酸化，虽然Rheb被认为是mTOR信号复合物的“成分”，但目前还没有令人信服的证据表明直接的相互作用Rheb和mTOR之间报告。Rheb也有可能结合并激活mTOR相互作用蛋白，如rictor、raptor或mLST8，而不是直接与mTOR交互作用并激活其[1].

猛禽与mTOR相互作用，形成对营养敏感的复合物，向细胞生长机器发出信号[2,三]. 也有报道称，当细胞缺乏氨基酸或能量产生物质时，mTOR受体复合物的稳定性增加[三]. 然而，其他研究[2]在富营养和贫营养条件下处理细胞时，没有证据表明mTOR-受体复合物的稳定性发生变化。这两项研究之间观察结果差异的原因[2,三]自上次报告以来尚不清楚[2]使用类似的实验条件未能证明营养状况对哺乳动物细胞中mTOR–猛禽复合物稳定性的影响[三,13]. 此外，有一些证据表明，猛禽具有mTOR支架蛋白的功能，与mTOR底物的TOR信号（TOS）基序的结合被认为是有效的mTOR催化磷酸化所必需的体内[14]. 因此，活细胞中mTOR、Rheb和猛禽之间相互作用的动态方面需要新的检测相互作用的方法，例如荧光共振能量转移-荧光寿命成像（FRET-FLIM）技术提供的在活性环境中观察适当标记材料的方法[15-18].

参与mTOR信号通路的几种蛋白质，包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）[19]，PDK1[20]，阿克特[21]、磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN）[22]、块茎[23]和p70S6K及其基底S6[24]已发现定位于细胞质和细胞核。此外，据报道，mTOR在细胞质和细胞核之间穿梭，而不是猛禽[25-27]. 相比之下，尚未报道Rheb的核定位。

利用共焦单光子和多光子激发态发射显微镜以及时间相关单光子计数（TCSPC）进行荧光寿命成像，可以明确确定荧光团的位置。随着绿色荧光蛋白（GFP）技术的发现，通过成像方法可以获得有关活细胞内部工作的重要新信息。细胞内蛋白质的相互作用可以通过在标记有适当GFP荧光团的蛋白质对之间使用稳态FRET来实现，例如增强型GFP（EGFP，增强型绿色荧光蛋白）和单体红色荧光蛋白（DsRed）。利用稳态FRET，供体荧光团（在这种情况下为GFP）被激发并发出荧光，但激发态能量被受体荧光团重新吸收，在这种情况中为DsRed，该荧光团本身以较长波长发出荧光，提供两个荧光团，并推断出它们所附着的蛋白质，接近（约7nm内）。监测稳态FRET强度是出了名的困难，并且需要困难的校正等。更好的方法是监测供体寿命的缩短，这与稳态强度测量相关的问题无关，并且是直接物理相互作用的证据。我们之前已经证明，GFP标记蛋白的激发态寿命减少约200 ps表示通过蛋白-蛋白质相互作用而猝灭[15-17]. 此外，这里使用的双光子激发荧光寿命成像显微镜（2P-FRET-FLIM）分析[15-17]，提供了优于标准单光子方法的几个优点，包括减少了激发光的细胞毒性和减少了荧光团的光漂白。通过光电倍增管作为检测器降低激发光（>900nm）的灵敏度，可以获得更高的设置灵敏度。利用灵敏的先进成像技术——时间相关单光子计数、荧光寿命成像和分子GFP融合技术，首次直接探测了Rheb、，mTOR和猛禽以及猛禽和mTOR，同时为其亚细胞定位提供了新的见解。

虽然GFP表达方法非常适合提供活细胞中蛋白质潜在相互作用的证据，因为这是一种过度表达，但不能排除标记的蛋白质可能在其较低的天然内源性水平上不相互作用的可能性。因此，该方法始终存在一些不确定性。然而，评估相互作用的替代方法更具局限性，因为它们都涉及整个细胞溶解后的下拉分析或细胞分馏，破坏定位信息，并在混合细胞器内容物时引入相互作用人工制品。由于这些原因，GFP方法被广泛使用，并且是评估细胞成分潜在相互作用的最佳方法，只要人们意识到其局限性。

在这项研究中，我们报告了使用先进的实时显微镜在HEK293、CHO和HeLa细胞中Rheb的显著核定位以及mTOR（但不是猛禽）的高水平恒定池。有趣的是，在所研究的所有条件下，细胞核中都没有猛禽。观察到Rheb-mTOR和猛禽-mTOR之间存在持续和直接的相互作用，但细胞浆中Rheb和猛禽之间没有相互作用。

结果

Rheb定位于哺乳动物细胞的细胞质和核区域

EGFP-Rheb的功能首先通过Western blots检测，使用mTORC1信号诱导的磷酸化S6-K1形式的抗体（见图1). 由于EGFP-Rheb的表达，S6-K1-磷酸化（D行，2通道）增加，因此具有功能性。数据表明，Rheb在很大程度上控制了S6-K磷酸化水平。如果mTOR或猛禽都没有功能，它们会降低S6-K磷酸化水平，事实上，EGFP-mTOR和DsRed-raptor的表达会显著增加S6-K的磷酸化水平。因此，EGFP-mTOR和DsRed-raptor也可能起作用。

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图1

通过S6激酶活性确定EGFP-Rheb、EGFP-mTOR和DsRed-raptor的功能。在HEK细胞中表达EGFP-Rheb、EGFP-mTOR和DsRed-raptor，运行凝胶并用Rheb、mTOR、raptor和S6激酶（thr389）的相应抗体进行印迹。EGFP-Rheb的表达水平显示在A行第2、5和7道，但抗体无法检测到内源性水平。mTOR的内源性水平可以在B行、1、2、4和7道中看到（表达EGFP-mTOR时密度增加（3、5和6道，高MW太近，迁移差异太大）。猛禽的内源性水平可以在C行，泳道1、2、3和5中看到，泳道4、6和7显示DsRed猛禽的表达。

EGFP和DsRed标记蛋白在研究中的几种哺乳动物细胞系中高效表达。图2显示了瞬时表达的荧光蛋白与HEK293和HeLa细胞中的Rheb蛋白融合的共焦图像。本研究中使用的细胞系的转染表达水平有所不同，HEK293细胞的转染效率高于80%，而CHO和HeLa细胞的转印效率约为60%（CHO图像数据未显示），这可能是由于三种细胞系的最佳转染条件不同。荧光标记的Rheb、raptor和mTOR经SDS-PAGE和凝胶电泳证实，mTOR、Rheb和raptor标记了正确的荧光蛋白，并且构建和表达正确（数据未显示）。Rheb和mTOR的主要定位似乎是高尔基体和内质网的核周区域。

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图2

EGFP公司-Rheb和DsRed-哺乳动物细胞中Rheb的表达。A类)HEK293电池和B类)HeLa细胞瞬时转染EGFP-Rheb（左面板）和DsRed-Rheb载体（右面板）。转染后24小时，在尼康TE2000 U共焦显微镜下分析活细胞。棒材8μm。

为了确定EGFP-Rheb是否存在于细胞核内，我们获得了表达荧光蛋白的HEK293细胞的三维多光子TCSPC图像Z堆叠（图3A-K型). 使用这项技术，可以观察到EGFP-Rheb蛋白在整个细胞中的存在，并且在细胞质和核区域都有显著的表达水平。考虑到细胞质/高尔基体区域内EGFP-Rheb的平均荧光强度（每秒52000个光子计数，图第三层红色方框），与核区域内的光子计数（每秒26000个光子计数，图第三层黄框），我们可以估计Rheb在细胞核内的表达水平约为40%，在细胞质、高尔基体和内质网内的表达水平约为60%。在表达EGFP-Rheb的HEK293细胞中，发现了细胞质和细胞核定位（图4). 此外，我们使用抗Rheb抗体进行了免疫组织荧光染色（图4)，尽管众所周知，Rheb抗体的质量有些低，但核周和核染色是明显的。使用高尔基荧光探针（BODIPY Texas Red神经酰胺，Invitrogen）和内质网探针（ER-Tracker Red；格列本脲BODIPY-TR，Invitorgen）进行的共定标研究表明，EGFP-Rheb定位于高尔基和ER（见图5,​,66).

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图3

表达EGFP-Rheb的HEK293多光子诱导荧光的3D叠加图像。转染24小时后，通过多光子激发（920 nm激光激发，520 nm发射）从HEK293活细胞的TCSPC图像中获得荧光。未经进一步图像处理即显示原始数据。图像显示出清晰的Rheb核定位。黄色和红色方框（F）表示用于比较光子计数的核区和ER/Golgi区。图像尺寸120x100μm。

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图4

Rheb的免疫组织化学染色。用共焦显微镜观察表达EGFP-Rheb（左面板）的HEK293细胞或固定在4%甲醛中并用抗Rheb抗体与德克萨斯州红标记二级抗体结合处理的细胞。棒材10μm。

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图5

附属的-Rheb在ER上的细胞定位。A类)HEK293细胞；B类)用EGFP-Rheb瞬时转染HeLa细胞。转染细胞后24小时用1μM ER Tracker红染色，并用共焦显微镜分析活细胞。图像显示Rheb定位于ER Bar 8μm。

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图6

大黄在高尔基体上的亚细胞定位。A）HEK293细胞；B）用EGFP-Rheb瞬时转染HeLa细胞。转染细胞后24小时用5μM BODIPY TR C5神经酰胺染色，并用共焦显微镜分析活细胞。图像显示Rheb定位于高尔基。棒材8μm。

mTOR在哺乳动物细胞中显示出一些核定位，但主要是内质网和高尔基体定位

通过瞬时转染mTOR两端标记的EGFP，研究mTOR在HEK293、HeLa和CHO细胞中的定位。转染24h和48h后检测细胞的表达。如图所示，HEK293和HeLa细胞主要在细胞质中表达mTOR，细胞核内有一些可检测但较弱的表达7.

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图7

EGFP-mTOR主要在哺乳动物细胞的细胞质中表达。研究了EGFP标记的mTOR在HEK293、HeLa和CHO细胞中的表达。用EGFP标记的mTOR瞬时转染细胞，并在转染48小时后使用Nikon TE2000U倒置显微镜和EC1共聚焦系统分析活细胞中的表达。（EGFP-mTOR；在mTOR和mTOR-EGFP的N端标记的EGFP；在mTO的C端标记的EGFP）。棒材8μm。

使用TCSPC技术，我们观察到三个独立实验中HEK293细胞的平均百分比计数为细胞核内约20%EGFP-mTOR和细胞质区内约80%（误差为±6%，两个区域均为SD）（数据未显示）（注意，该量化信息在标准共焦激光扫描显微镜图像中丢失）。在HeLa细胞群体中观察到EGFP-mTOR的最大核表达为~32%（±8%），而在CHO细胞中，该数量为~26%（两个区域均为±6%）（数据未显示）。

猛禽只在细胞质中表达

用DsRed受体载体瞬时转染HEK293、HeLa和CHO细胞，研究猛禽的定位。数字8A、B结果表明，在HEK293细胞中，DsRed受体主要位于细胞质内，在转染后24h和48h呈点状结构。DsRed受体在HeLa中的瞬时转染（图8摄氏度)和CHO细胞（图第8天)表现出相似的表达模式。

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图8

瞬时转染DsRed受体在不同哺乳动物细胞类型中的亚细胞定位。DsRed标记的猛禽在HEK293细胞中表达A）24小时和B）48小时，HeLa细胞48小时，C）和CHO细胞48h，D）用尼康TE2000 U共焦显微镜分析转染后不同时间的活细胞。棒材8μm。

EGFP-mTOR显示与DsRed-Rheb的直接相互作用，不受雷帕霉素的影响

为了研究mTOR结合伙伴的相互作用，首先在HEK293和HeLa细胞中瞬时表达EGFP-mTOR，并使用FLIM进行分析，以获得转染后48小时的控制激发态寿命（供体生色团）（图9). 用EGFP mTOR转染48小时的HEK293细胞的寿命图像如图所示9，带有相应的FLIM图像。在三个独立的实验中，发现所有细胞的EGFP-mTOR的平均寿命为2400±100ps。位于细胞核内的EGFP-mTOR显示出与细胞质中相似的寿命。

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图9

HEK293细胞表达EGFP-mTOR的荧光寿命成像。A）转染48小时后HEK293细胞表达EGFP-mTOR的共聚焦图像；B）相同细胞的寿命图像（寿命的颜色编码如所示(C))，图像尺寸120 x 110μm；C）图中所示的整个区域（白色边框）的寿命分布（B）寿命图像的数据采集时间最佳为3次30秒的累积，图像尺寸为128×128像素（蓝色十字线表示未使用的单像素寿命值）。荧光寿命值由（C），表示中显示的整个区域的值（B）从三个独立的实验中获得的数据为~2450±100ps。

转染48小时后，HEK293细胞与DsRed-Rheb共表达EGFP-mTOR，如图所示10安在三个独立的实验中，在DsRed-Rheb存在下EGFP-mTOR的平均激发态寿命被确定为2200±50 ps，由于Rheb和mTOR之间的直接相互作用，由于EGFP到DsRed的能量转移，能级降低。在HeLa细胞中，在共转染细胞中观察到EGFP-mTOR寿命（2100±100 ps）的类似猝灭，再次表明直接相互作用，并且可以观察到HEK293细胞中直接mTOR/Rheb相互作用的证据，无论EGFP是在mTOR的N端还是C端（数据未显示）。

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图10

DsRed Rheb在HEK293细胞中与EGFP mTOR直接相互作用，并且缺乏雷帕霉素的作用。（A、B）左面板：EGFP-mTOR共聚焦488 nm激发图像（与DsRed-Rheb共表达，转染48小时后）和DsRed/Rheb共聚焦543 nm激发图像，无（A）和（B）雷帕霉素（100 nM）处理24小时。（A、B）中间面板：共转染细胞的寿命图像（寿命的颜色编码显示在右侧面板中）。（A、B）右侧面板整个区域（白色边框）的寿命分布，如中间面板所示。中数据的生存期值（A）由于DsRed（连接到Rheb）将EGFP的右侧面板（连接到mTOR）从约2450±100 ps（仅EGFP）淬火而减少（见图9)到2200±100ps（n=3），因此显示出直接相互作用。中的数据（B）右面板显示EGFP（附在mTOR上）的寿命，用雷帕霉素处理后，猝灭没有缓解，表明它不会影响直接相互作用。终身图像的数据采集时间最佳为3次30秒的累积，图像尺寸为128×128像素，bar 8μm。

在三个独立的实验中，对HEK293细胞核区EGFP-mTOR的平均寿命的分析确定为2000±100 ps。HeLa细胞在EGFP-mTOR和DsRed-Rheb联合转染细胞的核区域显示出类似的表达（数据未显示）。供体（EGFP-mTOR）在核区的寿命从2400±100 ps到2000±100 ps的猝灭表明，EGFP-mTOR和DsRed-Rheb在细胞核中的相互作用（由于激发态能量转移）与在细胞质中的不同（即它们更接近），可能是由mTOR/Rheb复合物的不同构象引起的。重要的是，在本研究中，始终观察到EGFP-mTOR和DsRed-Rheb在HEK293细胞中以相似的水平表达（约40%），而单独表达时，这些水平不同（仅mTOR约30%，但也表达Rheb的细胞约40%）。

雷帕霉素对HEK293细胞中表达的EGFP-mTOR和DsRed-Rheb直接相互作用的影响通过24小时处理（100 nM）进行测定。EGFP的寿命（2200±100 ps，三个独立实验的数据）不受治疗的影响，表明雷帕霉素对相互作用没有影响（见图10亿).

虽然间接方法已广泛推断出Rheb与mTOR的相互作用，但这是第一个显示相互作用发生并在细胞特定区域发生的活细胞成像工作。尽管它有我们所看到的过度表达的缺点，但它使我们能够研究活细胞中相互作用的机制和后果。

猛禽直接与mTOR相互作用，但不与Rheb相互作用，并且mTOR与受体的相互作用不受雷帕霉素的影响

EGFP标记在mTOR的两端，DsRed标记在猛禽的N端，观察到GFP的寿命测量。在共表达DsRed受体的HEK293细胞中测定供体EGFP-mTOR的激发态寿命。图像整个区域的平均寿命为2300±100 ps（图11安). EGFP-mTOR和DsRed-raptor分别在488 nm和543 nm处激发的共表达细胞的相应共焦图像，如图所示11安，显示这两种蛋白质的高表达水平（>70%的细胞）。Golgi和ER共聚焦共定位数据表明，共转染细胞中供体荧光团的猝灭寿命表明，EGFP-mTOR和DsRed受体在正常生长条件下在核周区域直接相互作用。在HeLa和CHO细胞中也观察到类似结果（数据未显示）。对HEK293和HeLa细胞中共表达EGFP-Rheb（供体）和DsRed-Raptor（受体）的细胞进行分析，得出供体的非抑制激发态平均寿命为2400±100 ps，表明Rheb和猛禽之间缺乏直接相互作用（数据未显示）。

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图11

EGFP-mTOR与HEK293细胞中的DsRed受体直接相互作用，雷帕霉素缺乏作用。（A、B）左面板：EGFP-mTOR的共聚焦488 nm激发图像（转染48小时后与DsRed受体共同表达）和DsRed-受体的543 nm激发图像，无（A）和（B）雷帕霉素（100 nM）处理24小时。（A、B）中间面板：共转染细胞的寿命图像（寿命的颜色编码显示在右侧面板中）。（A、B）右侧面板此处所取区域的寿命分布在细红线区域内（而不是如前所示的整个区域），如中间面板所示。中数据的生存期值（A）EGFP的右侧面板（连接到mTOR）由于DsRed（连接到猛禽）的猝灭而减少，仅EGFP为~2450±100 ps（见图9)到2300±100ps（n=3），因此显示出直接相互作用。中的数据（B）用细红线标记的细胞的EGFP（附在mTOR上）寿命的右面板（下面的细胞被省略，因为它不表达DsRed受体，见左面板），用雷帕霉素治疗后，对寿命中心（2300 ps±100 ps）没有影响。终身图像的数据采集时间最佳为3次30秒的累积，图像尺寸为128×128像素，bar 8μm。

用EGFP-mTOR和DsRed猛禽共转染HEK293细胞，24小时后在2小时或24小时用雷帕霉素处理。EGFP-mTOR（猝灭）激发态寿命（~2300±100 ps）无影响，表明相互作用不受雷帕霉素处理的影响（图11亿). 尽管可能存在边缘未抑制的EGFP（肩部2400–2500 ps，图11亿然而，由于mTOR与猛禽的相互作用不如Rheb mTOR（分别为2300ps和2200ps），因此很难确定这是否表明雷帕霉素的边际作用。

氨基酸饥饿改变了mTOR与Rheb直接作用的定位和性质

在氨基酸饥饿的条件下，EGFP-mTOR观察到点状结构或颗粒（图12安). 当重新添加氨基酸时，标点结构逐渐减少，约60分钟后消失（见图12摄氏度)或单独添加血清（FCS）后更快（数据未显示）。此外，HEK293细胞中的氨基酸饥饿和再刺激也导致了不同程度的EGFP-胎时淬灭，在核周区达到约2100 ps，在标点结构中达到约2400 ps。结果再次表明，Rheb和mTOR在这两个区域的相互作用可能不同。值得注意的是，EGFP-Rheb的亚细胞定位和分布不受这种处理的影响

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图12

氨基酸饥饿和再刺激并不影响EGFP-mTOR和DsRed-Rheb在核周区的直接相互作用。(A-C公司)左面板：HEK293细胞的EGFP-mTOR共聚焦488 nm激发图像（转染48小时后与DsRed-Rheb共表达）和DsRed/Rheb共聚焦543 nm激发图像，HEK292细胞隔夜缺血，然后在D-PBS中缺氨基酸1小时(A类)然后再添加氨基酸（B、C）.去除氨基酸后出现点状结构，添加氨基酸后消失，且似乎不含Rheb。A类-C)中间面板，共转染细胞的寿命图像（寿命的颜色编码显示在右侧面板中）。（A-C）右面板单元格区域（红线内）的寿命分布，如中间面板所示。A、 揭示二者都淬灭和未淬灭的EGFP反映了核周mTORheb和点状mTOR的混合物，如寿命图像所示；B）氨基酸再刺激10min后相同细胞；C）在氨基酸重新刺激60分钟后，点状结构消失。在所有时间点，以白色圆圈标记的区域，主要是ER/Galgi，显示淬火寿命，即Rheb与mTOR相互作用。棒材8μm。

氨基酸饥饿不影响mTOR与猛禽的定位或直接作用

在氨基酸饥饿条件下，在细胞质中的小点状结构中也观察到了mTOR与受体的相互作用，在核周区域的Rheb中也是如此（图13). 在氨基酸饥饿和随后的再添加条件下，EGFP-mTOR寿命（2200±100 ps）没有显著变化（图13)因此我们得出结论，EGFP-mTOR和DsRed-raptor之间的相互作用保持不变。此外，DsRed受体的定位和分布不受氨基酸饥饿处理的影响。

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图13

氨基酸饥饿和再刺激对EGFP-mTOR与DsRed受体直接相互作用的影响。(A类-C)左面板：HEK293细胞的EGFP-mTOR共聚焦488 nm激发图像（转染48小时后与DsRed受体共表达）和DsRed-受体共聚焦543 nm激发图像，HEK292细胞隔夜缺血，然后在D-PBS中缺氨基酸1小时(A类)然后再添加氨基酸(B类,C). 去除氨基酸后出现点状结构，添加氨基酸后消失。(A类-C)中面板，共转染细胞的终身图像。生存期的颜色编码显示在右侧面板中，这是EGFP-mTOR和DsRed受体共表达细胞区域的生存期分布（中间面板中用红线标记的区域）(A类-C)右面板单元格区域（红线内）的寿命分布，如中间面板所示。A、 显示淬火EGFP，反映出mTOR/猛禽在点状结构和其他区域的直接相互作用。请注意，EGFP-mTOR的寿命略有缩短，约为2350 ps，这可能表明在点状结构中可能仍存在一些mTOR-受体相互作用，但在氨基酸饥饿条件下“更松散”（比较图11). （仅显示EGFP-mTOR表达的细胞用于比较，白色圆圈）。氨基酸再刺激后(B类,C)点状结构消失，EGFP的淬火寿命恢复到<2300 PS。

讨论

这项研究首次显示了Rheb和mTOR在活细胞特定区域的直接相互作用。尽管之前的研究表明，使用下拉式方法进行交互[11]在研究可能在细胞不同部位同时发挥不同作用的信号复合体时，能够在（活的）细胞-细胞基础上研究定位和相互作用的能力很重要，mTORC1复合体似乎就是这样。FRET-FLIM方法提供了另外两个优点。它能够显示Rheb和猛禽与mTOR的直接相互作用，并且通过该技术可以区分相互作用组分的不同构象，使用下拉分析方法无法获得此类信息。

EGFP和DsRed标记的Rheb均位于高尔基体和内质网的核周区，在转染细胞中的表达水平没有差异。先前对GFP标记的Rheb的研究也表明这种核周堆积[28-30]. 共焦图像采集的不敏感特性（即，由于模拟信号阈值化）可能会导致难以在不损失较弱信号的情况下设置标准共焦光电倍增管的阈值。因此，增益和背景电平可能导致信号丢失或过采样。使用高灵敏度的时间相关单光子计数，如TCSPC，可以在任何背景水平上检测荧光光子，并能够量化检测到的光子数量。因此，在这项使用TCSPC的当前研究中，我们报告了在细胞质和亚细胞核区域内持续存在且可观察到的EGFP-Rheb，尽管来自细胞核的信号有点弱，可能是因为它过度表达。然而，关于核Rheb的存在，重要的是要注意（i）有人认为mTOR在核区域和细胞质之间穿梭[25-27]以及（ii）mTORC1在核糖体生物发生中起着关键作用，核糖体发生在核仁中[1]. Rheb在细胞核内的存在表明它可能与该区室中的mTOR相互作用。尽管Rheb在细胞核内的作用尚不清楚，也不知道它是否仅仅存在于细胞核内，或确实能够穿梭进出，但它可能在指导mTOR定位以及因此在细胞核内下游信号传递方面发挥作用。观察到的Rheb和mTOR之间的相互作用不太可能是由于定位错误，因为随机分布的蛋白质分子将相距足够远（>>10nm），以限制直接稳定的相互作用。

也有报道称，通过使用活细胞的定时成像，在与ER短暂结合后，EGFP-Rheb定位于细胞质内高度有序的不同结构，这些结构显示出高尔基体膜的特征[28]. 据报道，Rheb也定位于线粒体[31]以及FKBP38和mTOR[32]. 研究还表明，GFP标记的Rheb与Rab7共定位，Rab7是内胚体和溶酶体结构的标记[33]. 我们的研究没有发现EGFP-Rheb与Mitotracker共定位（数据未显示），这与体外表达的Rheb不定位于线粒体的观察结果一致[30]. 以前有报道称，EGFP标记的Rheb在细胞质中显示出颗粒状荧光模式，而在质膜或细胞核中没有发现，并且主要是内膜定位[34]. 然而，据报道，mTOR的一些上游调控因子在细胞核和细胞质中均有表达，并且mTOR在翻译调控中起着重要作用。此前，基于免疫荧光、细胞分馏和Western blot分析的数据，也提供了mTOR核定位的证据[25-27].

该途径的其他成分，如块茎蛋白、Rheb和p70S6K也定位于细胞质（见引言）。事实上，据报道，Rheb的上游调节因子tubin定位于细胞质和细胞核[23]与mTORC1的主要底物之一p70S6K类似[24]. 此外，还发现mTOR在细胞质和细胞核之间穿梭，这是调节p70S6K活化和4E-BP1磷酸化的有丝分裂刺激所必需的[25]. 本研究首次为Rheb和mTOR在活细胞中的核定位提供了支持性证据。mTOR的核定位可能是进化上保守的现象，可能在mTOR信号传递和功能中发挥重要作用，如前所述[35]. 关于猛禽，以前的免疫荧光研究表明，猛禽位于细胞质内[33]. 活细胞共焦成像也显示了细胞质定位和细胞核缺失。此外，寿命数据显示，猛禽在细胞质中和细胞质中氨基酸饥饿诱导的点状结构中与mTOR相互作用（见下文）。

Rheb参与mTORC1复合体一直是一个重要的关注点，因为它能够通过其GDP/GTP结合状态控制复合体的活动，因此与mTOR相互作用[11,12,36]. 据报道，在细胞裂解物研究中，Rheb直接与mTOR催化结构域的氨基端叶结合，并以GTP/GDP依赖的方式激活mTOR激酶。此外，通过下拉试验，Rheb也被证明与mLST8和猛禽相关[11,12].

本研究的关键目标之一是研究Rheb和mTOR是否直接地在活细胞中相互作用，以及这种相互作用是否受到mTORC1信号受损的条件的影响（实施通过营养饥饿或雷帕霉素治疗）。由于所用的裂解条件，先前使用的免疫沉淀/细胞裂解物方法容易产生伪影，并且无法区分直接和间接相互作用。在这里，我们能够证明DsRed-Rheb与EGFP-mTOR的直接相互作用（无论DsRed是否与Rheb的C-或N-末端结合。还显示了DsRed-raptor与EGFP-mTOR的间接相互作用。相比之下，当与DsRed-aptor共表达时，EGFP-Rheb的EGFP寿命没有降低（结果未显示），然而，与它们没有直接相互作用的情况一致，考虑到mTOR（280 kDa）与Rheb（21 kDa，猛禽）和150 kDa相比体积较大，它们在mTOR上的位置可能比有效FRET（~7 nm）的距离更远。因此，结果与信号必须从Rheb传递的模型一致通过mTOR连接到猛禽和下游激酶。从最近的低温电子显微镜结构来看，mTOR的N端似乎与单个猛禽分子的平面相互作用，形成一个界面[37]而mTOR的C端与第二猛禽分子形成第二界面的一侧相互作用。目前活细胞研究的相互作用数据与该结构研究的拟议模型一致，其中可能有多个猛禽分子与mTOR结合。

DsRed-Rheb在细胞质和细胞核中不同程度的EGFP-mTOR寿命淬灭证明，这两个区域的直接相互作用性质可能不同，此外，在细胞核中发现显著的Rheb是一个新发现，并表明细胞核中的mTOR水平也在增加。核浓度增加的机制和相互作用性质的细节仍有待研究。根据这些研究，建议修改Rheb与mTOR的结合，以包括Rheb核定位（图14). 很明显，Rheb在细胞核中的定位对mTOR信号具有重要意义。

在单独的窗口中打开

图14

Rheb的表达和转运到细胞核。不同细胞外信号对Rheb的激活使Rheb能够直接与mTOR相互作用。Rheb可能与mTOR结合，在细胞核和细胞质之间穿梭，也可能单独转移到细胞核，以实现未知的功能（方案由[42].

雷帕霉素对mTOR信号传导的拮抗作用的作用机制一直备受关注，尤其是由于其抗细胞生长/癌症药物的潜力。使用GFP/FRET-FLIM方法，雷帕霉素的添加没有影响mTOR、Rheb或猛禽的定位，也没有影响它们的相互作用。此外，与其他研究一致[38]氨基酸饥饿和雷帕霉素处理均不影响mTOR-Heb相互作用。关于雷帕霉素对mTOR受体相互作用的影响，Oshiro及其同事[39]据报道，雷帕霉素可以分解这种相互作用，而其他药物则可以[2]雷帕霉素治疗后未观察到与珠下拉试验一致的解离[7]以及我们的结果。重要的是，我们从活细胞获得的数据表明，雷帕霉素的作用机制不是通过mTOR受体相互作用的完全分离。如前所述，雷帕霉素可能通过其他机制发挥作用[14]或直接作用于mTORC1的催化活性[40]. 我们的观察结果也与最近的工作一致[40]表明雷帕霉素-FKBP12与mTOR的FRB结构域结合导致变构构象改变，降低了mTORC1的固有催化活性。为了了解雷帕霉素如何抑制mTORC1的某些功能，还需要做更多的工作。

mTOR的点状定位是由氨基酸提取引起的，在重新添加氨基酸后，点状结构消失（至少如EGFP-mTOR所示）。虽然Rheb与这些结构无关，但猛禽的分布存在异质性，因为在单个细胞内的某些但并非所有情况下，它似乎与mTOR相关。这是一种过度表达，并且整个细胞的寿命分析是平均的，因此很难解释内源性情况下会发生什么。然而，似乎在氨基酸提取条件下，mTOR与受体的结合更松散（不活跃？）。这被视为DsRed（附属于猛禽）在以下氨基酸提取条件下对EGFP（附于mTOR）的猝灭（显示为mTOR寿命缩短）较少的而不是氨基酸的存在。mTOR活性受氨基酸可用性调节通过如最近所述，与mTOR直接相关的“ragulator”复合体（包括RAG-GTP’ases）[41]，也观察到点状结构。然而，该研究表明，在缺乏氨基酸的情况下，mTOR存在于细胞中的点状结构中，但在添加氨基酸后，它会集中在较大的结构（溶酶体）中，而我们发现mTOR是由于氨基酸饥饿而存在于点状结构。可能是过度表达导致了我们的结果，也可能是其他一些差异。

结论

总之，Rheb、mTOR和猛禽主要居住在高尔基体/ER类结构上，其中mTOR直接与Rheb和猛禽相互作用，此处首次使用FRET-FLIM方法在活细胞中显示。还显示了Rheb在哺乳动物细胞核内的明确定位（方案1）。雷帕霉素不影响mTOR-Heb或mTOR-受体相互作用水平的升高，这意味着雷帕霉素不会通过破坏这种复合物来抑制mTORC1信号。氨基酸饥饿导致形成复合物（包含EGFP-mTOR），这些复合物以点状结构出现，在重新添加氨基酸或血清后消失。raptor-mTOR的相互作用不受氨基酸缺乏的影响，而Rheb-mTOR的结合在颗粒内“松动”，但在核周区域不“松动”。虽然GFP技术应用非常广泛，但需要注意其缺点，因为该方法使用标记蛋白的过度表达，这可能会影响相互作用和下游靶活性。因此，解释时需要谨慎，需要检查对这些下游活动的最小影响，以确认功能性，正如我们在这里使用S6-激酶活动所做的那样。总的来说，我们证明了先进的时间分辨FRET-FLIM技术为研究信号通路提供了一个强大的协议，并且它突出了该技术的物理能力，为开发和测试设计用于在活细胞中实时靶向特定通路的药物提供了急需的信息。

方法

缩写

FRET：荧光共振能量转移；荧光寿命成像显微镜；EGFP：增强型绿色荧光蛋白；mTORC1：雷帕霉素复合物1的哺乳动物靶点；mTOR：雷帕霉素的哺乳动物靶点；TCSPC：时间相关单光子计数。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

RBY PB AWP VI CGP RAA JPO AJ CDS SWB参与了研究设计。RBY VI CGP AJ CDS SWB进行了实验。RBY VI CGP CDS SWB进行了数据分析。RBY AWP VI CGP CDS SWB撰写或参与了手稿的撰写。所有作者阅读并批准了最终手稿。

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