c-Src激活通过刺激c-Met介导头颈癌对埃洛替尼的耐药性

细胞系

所有HNSCC细胞系均来自人类，来源如下：686LN(14)G.Chen（埃默里大学）；FaDu，美国典型培养物保藏中心（ATCC，美国马里兰州罗克维尔）；UM-SCC-22A、UM-SCC22B和UM-SCC1，T.Carey（密歇根大学）；PCI-15B，T.Whiteside（匹兹堡大学）；CAL-33，G.Milano（法国尼斯安托万·拉卡萨涅中心）；和HN-5，J.Myers（MD Anderson）。所有细胞系在进行实验后2个月内通过基因分型进行验证(15).

表达显性活性c-Src的稳定HNSCC细胞系的建立

用表达显性活性c-Src（DA-Src）的质粒转染686LN细胞，该质粒在酪氨酸529处突变为苯丙氨酸，消除了529位的抑制性磷酸酪氨酸。相应的控制载体pUSEamp和DA-Src质粒从Upstate Biotechnology，Inc.（Lake Placid，NY，USA）获得。转染三天后，将细胞置于含有200μg/ml新霉素的选择培养基中再培养10天，然后进行验证。

蛋白质印迹

按说明制备细胞裂解物(16). 如前所述，对40微克总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹(17).

HGF-ELISA法

根据制造商的说明，采用Quantikine Human HGF ELISA（R&D Systems，Minneapolis，MN USA）采集并分析细胞培养基一式三份。

Matrigel侵犯分析

使用Matrigel-coated改良Boyden腔插入物（BD Biosciences，Bedford，MA，USA）进行侵入检测。电池（1.25×10⁴)被播种到上室。上下腔都装有药物治疗。下室还含有10%的FBS，用作化学引诱剂。细胞在37°C和5%CO中培养24小时₂孵化器。去除保留在上腔的非侵入性细胞，将侵入的细胞固定并用Hema 3染色（Fisher Scientific，Hampton，NH，USA）。侵入的细胞数量被归一化为细胞增殖（通过MTT分析归一化到每个治疗组的外径）。在放大200倍的显微镜下对随机选择的六个视野进行计数。从三个独立实验中计算平均值±SE。

MTT分析

使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）测定细胞活力。细胞一式三份（3×10⁴/24孔板中的孔）隔夜进行不同浓度的药物治疗，如图例所示。添加MTT溶液（5 mg/ml MTT存于PBS中；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA），用于呈现有色甲胎素产品，然后将其溶解于DMSO中，并使用平板阅读器在570 nm处进行比色测量（BioTek Instruments，Inc.Winooski，VT，USA）。生长抑制率计算为（OD_车辆−外径_药物)/外径_车辆× 100%. 对于图5D，在存在重组人HGF（50ng/mL）或载体对照的情况下，将细胞置于24孔板中。在MTT分析之前，细胞在载体或HGF的持续存在下接受药物治疗48小时。

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图5

siRNA对c-Src的特异性敲除增强了HNSCC细胞对厄洛替尼的敏感性。（A） 686LN和FaDu HNSCC细胞（1×10⁵/well）转染c-Src siRNA或对照siRNA（300pmoles）48小时。通过Western blotting在两种细胞系中观察到c-Src-敲除。显示了具有代表性的Western印迹结果。β-微管蛋白作为负荷对照。与β-微管蛋白相比，密度测定结果显示在每个印迹下方。在3个独立实验中观察到类似的结果。（B，C）C-Src siRNA或对照siRNA转染剂（686LN和FaDu）以指定剂量（EC）用二甲基亚砜或埃洛替尼处理₅₀和亚EC₅₀各细胞系的剂量）。48小时后用MTT法评估细胞活力。显示了三个独立实验的结果。P<0.0001***，P<0.01**（D）686LN亲代细胞在含有重组人HGF（50ng/ml）或载体对照物的24孔板中培养。在MTT分析之前，细胞在载体或HGF的持续存在下接受厄洛替尼治疗48小时。通过Western blotting（插图）确认磷酸化-c-Met激活。P<0.0001。

siRNA转染

小干扰RNA（siRNAs）购自Dharmacon，（美国科罗拉多州拉斐特）。人特异性c-Src siRNA（D-003175-05）的靶序列为5′GAGAACCUGUGUGCAAAG-3′。使用四种siRNA的混合物作为单一试剂（L-003156-00）靶向c-Met。来自Dharmacon的对照siRNA（D-001210-01用于c-Src，D-001810-10-05用于c-Met）被用作非序列特异性效应的对照。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000在HNSCC细胞中转染siRNA（300pmoles）。

体内研究

6周龄雌性裸鼠（nu/nu）购自美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室。将稳定细胞系VC-2或DA-Src-5接种到裸鼠（1×10）的侧翼⁶细胞/肿瘤）与基质凝胶（BD Biosciences）混合。接种后第5天可触及肿瘤结节，小鼠被随机分为四组。每周用40mg/kg厄洛替尼、15mg/kg PF04217903或载体（20%盐酸特拉普酚）给小鼠治疗5天₂O、 Sigma-Aldrich）经口灌胃。在另一项实验中，每周给小鼠注射0.03mg西妥昔单抗或溶媒对照药5天。用数字卡尺每周测量两次肿瘤大小。肿瘤体积计算为：体积=长度×宽度²/2.在治疗期结束时，处死动物，取出肿瘤并固定在10%的福尔马林缓冲液中进行免疫染色。动物护理严格遵守匹兹堡大学制定的机构指南。

免疫组织化学

在热诱导抗原回收之前，用二甲苯将载玻片脱蜡并重新水化。在室温下将非特异性结合阻断45分钟。用Ki67（1:50，GeneTex）、phospho-Src（1:100，Santa Cruz Biotechnology）和phosphoy-Met（1:100，Cell Signaling Technology）的一级抗体培养切片。如前所述，使用ApopTag过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒（美国马萨诸塞州Billerica Millipore）测定凋亡细胞的数量(18). 阅读幻灯片并对每个样本每五个字段中的阳性细胞数进行评分。结果报告为平均值±SE。

c-Src活化有助于埃洛替尼耐药性体内

接下来，我们试图检查是否也观察到c-Src介导的埃洛替尼耐药体内将.686LN VC-2和DA-Src-5细胞皮下注射到免疫低下小鼠体内，5天后口服载体（20%曲普醇）或厄洛替尼（40mg/kg）以建立肿瘤。所有组的初始治疗前肿瘤体积具有可比性，无统计学差异。与载体治疗相比，埃洛替尼治疗使VC细胞形成的肿瘤体积减少了68.7%（平均肿瘤体积=1215±320 mm^三vs 382±32毫米^三，n=14，P=0.034）(图2A). 然而，与载体相比，DA c-Src细胞建立的肿瘤对厄洛替尼完全不敏感（平均肿瘤体积=977±200 mm^三相对于910±140毫米^三，n=14，P=0.95）。这些结果表明，c-Src激活也有助于厄洛替尼耐药体内VC和DA c-Src细胞之间肿瘤体积的差异很可能是由于DA-Src肿瘤中基质含量较低。

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图2

c-Src活化有助于厄洛替尼耐药，但不影响西妥昔单抗耐药体内（A）将VC-2和DA-Src-5 HNSCC细胞接种到裸鼠侧面。每周用载体对照物（20%特拉普酚）或40mg/kg厄洛替尼经口灌胃给小鼠治疗5天，为期4周。肿瘤植入后5天开始治疗。结果表示每个治疗组14个肿瘤的平均肿瘤体积±S.E。未配对学生t检验，*P<0.05。（B） Ki67对细胞增殖细胞进行免疫组化染色的代表性图像和定量结果，Tunel分析对凋亡细胞进行免疫组织化学染色。结果显示为每个区域凋亡细胞或Ki67阳性细胞的平均数±S.E.未配对Student t检验，P<0.05*，P<0.0005***。比例尺=50μm。（C） 1×10⁶将DA-Src-5 HNSCC细胞接种于裸鼠侧腹部。每周用溶媒对照品（生理盐水）或0.03mg西妥昔单抗腹腔注射给小鼠2天，持续13天。肿瘤植入15天后开始治疗。结果表示每个治疗组7个肿瘤的平均肿瘤体积±S.E。未配对学生t检验，*P<0.05。

在福尔马林固定切除的肿瘤中检测肿瘤异种移植物的凋亡和细胞增殖程度(图2B); 在VC中厄洛替尼治疗后，凋亡细胞核的染色增加，而Ki67染色降低，但在DA-Src肿瘤异种移植物中则没有。对每个治疗组4个肿瘤的切片中的凋亡细胞和增殖细胞数量进行了量化，结果表明，与VC异种移植物的对照治疗（平均43.7±9.2个凋亡细胞/场，P=0.0007）相比，厄洛替尼治疗的VC异种移植中凋亡细胞显著增加了4倍（平均177±11个凋亡细胞每场）与对照组（平均298±19个增殖细胞/场，P=0.025）相比，厄洛替尼治疗的VC异种移植物的细胞增殖减少了52.7%，具有统计学意义。与载体对照组相比，厄洛替尼治疗的DA-Src异种移植物的凋亡或细胞增殖没有显著差异。此外，我们观察到，与VC异种移植物相比，DA-Src肿瘤异种移植物表达的磷酸化Src高5.2倍（P＜0.005），与埃洛替尼治疗无关（数据未显示）。

在平行实验中，我们发现DA-Src细胞对EGFR中和抗体西妥昔单抗（EC₅₀母细胞剂量），肿瘤体积抑制57.4%（P<0.05）(图2C)而VC异种移植物中的抑制率为63.4%。686LN亲代细胞此前已被证明对西妥昔单抗敏感体内(20). 这个体内西妥昔单抗在DA-Src异种移植物中的反应与在体外侵袭试验中西妥昔单抗显示DA-Src细胞系中侵袭细胞数量显著减少（数据未显示）。

活化c-Src诱导HNSCC细胞c-Met磷酸化

c-Met的扩增和过度表达与非小细胞肺癌获得性埃洛替尼耐药相关(11). 为了确定c-Met在c-Src介导的埃洛替尼耐药中的作用，我们评估了表达DA-Src的HNSCC细胞中c-Met的总形式和磷酸化形式的表达。如所示图3A与对照组相比，DA-Src-3和DA-Src-5的磷酸化-Met增加了25倍以上，c-Met总表达增加非常温和。与我们之前的研究结果一致，即HGF是HNSCC中的旁分泌因子(10)，我们通过ELISA证实DA-Src细胞中c-Met磷酸化的增加与c-Met配体HGF无关，因为没有检测到HGF的产生(补充图2). 这表明磷酸化c-Src的活化是观察到的c-Met活化的原因，正如已经报道的那样(21). 我们还确认体内，磷酸化-Met在DA-Src细胞的肿瘤异种移植中表达上调。IHC检测到DA-Src细胞比VC细胞增加20倍(补充图3).

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图3

活化的c-Src在HNSCC细胞中诱导显著的c-Met磷酸化。（A） VC-1和VC-2细胞以及DA-Src-3和DA-Src-5细胞中p-c-Met和总c-Met的表达水平。底部面板中显示的代表性斑点的密度测定量化。在至少3个独立实验中观察到类似的结果。（B） 用200nM达沙他尼或1μM厄洛替尼处理DA-Src-5细胞24小时。制备细胞裂解物并分析p-EGFR、p-c-Met和p-Src的表达。显示了一个具有代表性的Western blot，并且p-c-Met表达的定量从3个独立实验归一化为β-微管蛋白。P<0.0001***，ns=无显著性。（C） 在达沙替尼或埃洛替尼治疗（B）后，评估一组含有不同埃洛替尼EC50s（1.56–13.14μM）的8个HNSCC细胞系（CAL-33、UM-SCC-22A、HN-5、PCI-15B、VC-1、VC-2、DA-Src-3、DA-Src-5）的磷酸化-Met表达。计算并分析达沙替尼处理细胞中观察到的残余磷酸化-Met表达与厄洛替尼处理的细胞[磷酸化-Met-表达（达沙替尼布/厄洛替尼布）]中所观察到的剩余磷酸化-Met表达的密度比与厄洛替尼EC的相关性₅₀.

由于两种表皮生长因子受体均报道了c-Met的配体依赖性激活(12)和c-Src(21)，我们检查了EGFR或c-Src抑制剂在活化c-Src-存在的情况下调节磷酸化-Met的程度。在DA c-Src细胞中，厄洛替尼治疗导致磷酸化-Met的轻微降低（10-15%），而达沙替尼治疗几乎完全降低磷酸化-Met水平(图3B). 达沙替尼和厄洛替尼均抑制其各自的靶点磷酸化Src和磷酸化EGFR。为了证实这一发现，我们检测了来自图1A（CAL-33、UM-SCC-22A、HN5和PCI-15B）具有广泛变化的埃洛替尼敏感性（参考文献。20和补充表1)，以及两个686LN DA-Src克隆和两个VC克隆。我们发现厄洛替尼EC之间存在显著相关性（P=0.045）₅₀以及磷酸化-Met在达沙替尼和厄洛替尼存在下被抑制的程度，使用的浓度可使相应靶点（c-Src或EGFR）的磷酸化完全降低。为了进行这一测定，计算了达沙替尼处理的细胞中残留的磷酸-Met与厄洛替尼处理细胞中残留磷酸-Met的比率(图3C). 细胞对厄洛替尼的耐药性越强，该比率越低。这表明，在DA c-Src细胞和其他埃洛替尼耐药的HNSCC细胞系中，配体诱导的c-Met活化与c-Src-偶联比与EGFR偶联更紧密，因为它对达沙替尼更敏感。这可以为EGFR酪氨酸激酶抑制剂存在下的酪氨酸激酶信号传导提供一种替代途径。

敲除c-Met可提高埃洛替尼的敏感性

接下来，我们使用c-Met siRNA来确定敲除DA-Src细胞中的c-Met是否会增加埃洛替尼的敏感性。图4A表明c-Met的敲除导致埃洛替尼敏感性增加2至3倍（P<0.05）。对照siRNA转染的细胞用0.1μM和0.5μM埃洛替尼分别对细胞生长抑制7.6±5.0%和23.9±2.9%，而c-Met敲除分别对细胞生长抑制24.9±0.4%和40.7±0.5%，在这些厄洛替尼浓度下（0.1μM厄洛替尼布P=0.040，0.5μM厄洛替尼布P=0.016时，c-Met与对照siRNA生长抑制）。插图显示siRNA处理对c-Met表达的抑制率为83.8%。

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图4

DA-Src细胞中siRNA对c-Met的特异性敲除可恢复对厄洛替尼的敏感性。用c-Met或对照siRNA（300pmoles）瞬时转染686LN DA-Src-5细胞48小时，然后用厄洛替尼按指定剂量治疗。48小时后用MTT法评估细胞活力。显示了三个独立实验的结果。学生t检验，*P<0.05。通过Western blotting（插图）证实c-Met的敲除。（B） 用0.1μM和0.5μM厄洛替尼单独或与PF04217903（1μM）或达沙替尼（EC）联合处理686LN DA-Src-5细胞₅₀，380nM）48小时，然后进行MTT分析。显示了三个独立实验的结果。学生t检验，*P=0.010，**P=0.003，***P<0.0001。（C） DA-Src-5荷瘤小鼠每周5天通过口服灌胃接受以下治疗，共4周：溶媒对照、厄洛替尼（40mg/kg）、PF04217903（15mg/kg）或联合治疗。肿瘤植入后6天开始治疗。结果表示每个治疗组12个肿瘤的平均肿瘤体积±S.E。未配对学生t检验，*P=0.0068与对照组比较。（D） Ki67对细胞增殖细胞进行免疫组化染色的代表性图像和定量结果，Tunel分析对凋亡细胞进行免疫组织化学染色。结果显示为每个区域凋亡细胞或Ki67阳性细胞的平均数±S.E.未配对Student t检验，P<0.05*，P<0.0005***。比例尺=50μm。

接下来，我们将c-Src或c-Met抑制剂与厄洛替尼联合应用于DA c-Src细胞中，并检测细胞活性，以确定厄洛替尼可通过双重治疗增强反应(图4B). 在本实验中，厄洛替尼单独在0.1μM和0.5μM时分别对细胞生长产生10.6±3.7%和14.7±5.6%的抑制作用。c-Met TKI PF04217903公司(13)，作为一种单剂，对细胞增殖的抑制最小（10%），最高可达5μM。然而，添加1μM PF04217903与0.1μM和0.5μM厄洛替尼联合使用，分别产生21.9±3.1%和31.4±9.0%的抑制。这表示灵敏度增加了2倍。类似地，在其EC中添加达沙替尼₅₀在DA-Src细胞中，在0.1μM和0.5μM的浓度下，（380 nM）对厄洛替尼的作用分别导致81.1±0.7%和81.7±0.3%的细胞生长抑制，使厄洛替尼可提高6倍以上。在其EC中添加达沙替尼也观察到类似的趋势₂₅（30nM）至0.1μM和0.5μM厄洛替尼对细胞生长的抑制率分别为43.8±1.5%和58.8±1.9%（数据未显示）。这些结果表明，通过在埃洛替尼中添加选择性c-Met抑制剂或将埃洛替尼与Src抑制剂结合，可以克服因活化c-Src过度表达而导致的埃洛替宁耐药性。

c-Met抑制使DA-Src肿瘤对埃洛替尼敏感体内

如果埃洛替尼耐药是由于c-Src激活所致，这表明在c-Src-激活水平较高的患者中，应交替使用c-Src-inhibitor。最近对HNSCC患者进行的第2阶段试验结果表明，达沙替尼作为单一药物缺乏临床活性，且与毒性相关，即使其剂量能够抑制c-Src(22). 以前在临床前模型中观察到达沙替尼与Met抑制剂联合使用时抗HNSCC活性增加体内(21)，与我们的在体外观察到c-Met活化与过活性c-Src偶联。由于达沙替尼联合治疗（包括在埃洛替尼或c-Met抑制剂中添加达沙替尼可）可能对患者产生不可接受的毒性，我们研究了DA-Src产生的c-Met显著活化是否可以作为替代治疗靶点体内我们使用DA-Src-5细胞的肿瘤异种移植物模型来测试添加c-Met抑制剂是否可以改善对埃洛替尼的反应。c-Met抑制剂已成功且安全地与厄洛替尼联合用于肺癌患者的临床试验(23). c-Met抑制剂PF04217903，公布剂量为15mg/ml(24)单独使用，并与厄洛替尼联合使用。携带DA-Src-5异种移植瘤的免疫缺陷小鼠接受载体对照、厄洛替尼（40mg/kg）、PF04217903（15mg/kg）或厄洛替尼加PF04217703治疗，每周5天，共4周。所有治疗组的初始肿瘤体积相似。与对照组相比，厄洛替尼和PF04217903单独治疗肿瘤体积无显著差异（P>0.05）。然而，与对照组相比，联合治疗使肿瘤体积减少了56.2%（P=0.0068）(图4C)与厄洛替尼敏感的VC对照细胞单独使用厄洛替尼可抑制68.7%的肿瘤体积相比(图2A). 该结果表明体内通过添加c-Met抑制剂，c-Src激活的HNSCC细胞对厄洛替尼的耐药性可被克服约80%。

实验结束时，肿瘤中凋亡细胞和增殖细胞的平均数量分别通过Tunel分析和Ki67免疫染色进行评估(图4D). 联合治疗组凋亡细胞最多，增殖细胞最少。与对照组（15.2±1.8）相比，所有治疗组（厄洛替尼：18.0±1.6，PF04217903：28.2±4.3，联合：40.7±2.4）的凋亡细胞均增加。联合治疗组的平均凋亡细胞数明显高于对照组（P<0.0001）、仅厄洛替尼组（P<0.001）和仅PF04217903组（P=0.033）的凋亡细胞平均数。增殖细胞的数量也观察到类似的结果。与对照组相比，厄洛替尼和PF04217903单独治疗导致增殖细胞数量减少8.5%（P=0.26）和26%（P=0.007）。与对照组相比，联合治疗降低了58.5%（P<0.0001），并且与两个单药治疗组相比也显著降低。在对厄洛替尼敏感的VC细胞异种移植物中，这种对增殖细胞标记的效果优于单独使用厄洛替尼可观察到的效果（减少52.7%，图2B).

敲除亲代细胞中的c-Src可降低c-Met活化并提高对埃洛替尼的敏感性，而HGF治疗可导致埃洛替尼耐药

为了在没有外源性添加的c-Src载体的情况下确定内源性c-Src-对c-Met磷酸化的贡献，检测了用c-Src-siRNA处理的HNSCC亲代细胞中总c-Met和磷酸化c-Met的表达。将c-Src-siRNA瞬时转染两个具有代表性的HNSCC细胞系，其中c-Src、686LN和FaDu的内源性表达适度，在48小时后导致c-Src-蛋白的显著但部分的敲除（686LN63%和FaDu51%）(图5A). 即使在686LN和FaDu细胞中内源性c-Src被部分敲低，磷酸化c-Met的表达也几乎完全消除。这一结果表明，HNSCC细胞中内源性c-Src的表达也与HNSCC中c-Met的激活有关。c-Met的激活很可能是通过c-Src直接介导的配体依赖机制实现的(21)尤其是在HNSCC细胞系中未检测到HGF(10).

我们还测试了内源性c-Src的下调及其伴随的活化c-Met的减少是否会提高HNSCC亲代细胞对厄洛替尼的敏感性。如所示图5B和C，即使siRNA部分敲低内源性c-Src，686LN和FaDu细胞的厄洛替尼敏感性在其各自的EC时也增强₅₀和亚EC₅₀厄洛替尼剂量。在0.1μM厄洛替尼治疗48小时时，c-Src siRNA的瞬时转染使686LN细胞对厄洛替尼敏感性增加了1.8倍（63±1.7%的生长抑制，与对照siRNA的35.0±0.18%的生长抑制相比；n=3个实验，P=0.003），并且在48小时时0.5μM厄洛替尼也观察到持续增强(图5B). 在FaDu细胞中，具有较高的内源性c-Src和磷酸化-c-Src，以及较高的EC₅₀厄洛替尼（2.0μM）比686LN细胞（0.5μM）对c-Src的特异性敲除导致埃洛替尼在EC的敏感性增加1.6倍和2.8倍₅₀（2.0μM）和亚EC₅₀厄洛替尼的（0.5μM）浓度(图5C). 这些结果表明，内源性c-Src有助于HNSCC细胞对厄洛替尼的敏感性。

为了确定亲代埃洛替尼敏感的686LN细胞是否也可以通过HGF直接激活c-Met而对埃洛替尼产生耐药性，我们用外源性人重组HGF处理这些细胞(图5D插图）。在48小时时观察到厄洛替尼浓度反应向左移动(图5D)证明HGF治疗后亲代细胞对埃洛替尼的耐药性增加了2倍以上（EC₅₀=2.45μM（无HGF处理）与EC₅₀HGF治疗=5.98μM，P<0.0001）。综上所述，这些观察结果支持c-Met激活在HNSSC厄洛替尼耐药中的作用，这可能通过配体刺激以及配体依赖性激活发生。

财务支持：这项工作得到了NIH拨款R01CA77308、P50CA097190和美国癌症协会（JRG）的支持。VWYL获得了头颈部SPORE发育研究奖（P50CA0970）和匹兹堡基金会Patricia L.Knebel基金会的支持。该项目使用匹兹堡大学癌症研究所动物设施，并获得P30CA047904奖项的部分支持。

我们感谢李嘉颖的技术支持。