索拉非尼在实验性肝纤维化中的抗纤维化活性——体内抑制靶点、剂量和疗效窗口的优化

AlamarBlue®细胞活力测定

使用alamarBlue®（Invitrogen）评估细胞活力。在12小时和24小时内，用7.5和15µM处理每个孔含有约5000个LX-2细胞的96 well板。将AlamarBlue®试剂直接添加到每个孔中，在37°C下培养平板，使细胞将resazurin转化为resurufin，并测量荧光信号。

原发性人类HSC的分离

如前所述，在原发性良性肿瘤或结肠癌单一转移进行肝切除的患者中，从正常人肝脏的楔形切片中分离出原发性HSC[10]. 通过在塑料上培养7-14天来激活HSC，并传代至第3代进行以下实验。除了原代HSC外，我们还利用了一个经过验证的永生化人类HSC系LX-2，其特征与原代激活HSC的特征非常相似[11].

细胞增殖试验

DNA合成使用^三如前所述的H-胸腺嘧啶掺入[11]. LX-2细胞以每孔20000个细胞的密度接种在24孔板中。24小时后，将培养基更换为含有0.2%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基12小时，然后用索拉非尼（7.5µM和15µM）处理细胞24或48小时，以及1 Ci/mL^三收获前添加H-胸腺嘧啶核苷4小时。然后用冰镇PBS清洗细胞三次，并在4°C的甲醇中固定30分钟。细胞在0.25%氢氧化钠/0.25%十二烷基硫酸钠中溶解。用盐酸（1N）中和后，使用闪烁计数器（贝克曼·库尔特）测量放射性。

DNA分离和电泳

为了检测LX-2细胞中的片段或凋亡DNA（小DNA片段），根据制造商的指南，使用凋亡DNA阶梯提取试剂盒（美国山景城BioVision），从用10µg/ml索拉非尼和载体处理12和48小时的LX-2电池中分离出DNA。样品在2%琼脂糖凝胶中运行，用溴化乙锭染色，并通过紫外线透照进行可视化。

逆转录和实时定量PCR

使用RNeasy Mini试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）提取并纯化LX-2细胞、初级星状细胞或100 mg大鼠全肝组织中的RNA，并使用SprintTM RT Complete-RNA-to-cDNA EcoDry™Premix（双引物）管（加利福尼亚州山景城Clontech）将1µg总mRNA反向转录到互补DNA（cDNA）中，并在LightCycler®480 RealTime PCR System（Roche）上使用SYBR green qPCR Master Mix（罗氏）进行定量PCR分析。数据表示为GAPDH正常化后成纤维基因的相对表达。

西部印记

使用RIPA裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH=8，150 mM NaCl，1%IGEPAL，0.5%脱氧胆酸钠和0.1%SDS）以及补充蛋白酶抑制剂混合物和蛋白磷酸酶抑制剂混合物（罗氏）从细胞中提取总蛋白。通过匀浆从大鼠肝组织中提取蛋白质。蛋白质浓度用Bio-Rad DC试剂盒（Bio-Rad）测定。使用的抗体如下：兔抗I型胶原蛋白抗体（1:2000）（Rockland）、鼠抗aSMA抗体（1:500）（Millipore）和兔抗GAPDH抗体（1:200）（Santa Cruz）。

体内TAA治疗大鼠的研究

雄性Sprague-Dawley大鼠体重280-300克或8-10周龄（Jackson Laboratory），根据NIH指南进行饲养，并经西奈山IACUC委员会批准。大鼠被饲养在西奈山医学中心的动物护理设施中，在恒定温度下进行12小时的光暗循环。在研究期间，大鼠可以自由饮用自来水。

体内研究采用了“预防”（第2组）、“治疗”（第3组）和“逆转”（第4组）治疗方案以及对照组（第1组）(补充图1)。每组包含4个不同的亚组，每个亚组包含7只大鼠。第1组每周腹腔注射磷酸盐缓冲液（PBS），不注射TAA。在第2、3和4组中，大鼠通过IP给予150 mg/kg TAA（西格玛化学公司，密苏里州圣路易斯），每周三次，持续8周，以诱导肝硬化。大鼠每天灌胃给予索拉非尼，剂量为1.25 mg/kg/天（A亚组）、5 mg/kg/天（B亚组）、7 mg/kg/天（C亚组）和媒介物对照（12.5%Cremaphor（Sigma）、12.5%乙醇和75%水）（D亚组）；与TAA同时开始8周（第2组），在第4-8周期间（第3组），或在TAA停止后第8-12周开始（第4组）。

在处死时，用一根插入门静脉的16G血管导管测量门静脉压力，以测量水柱的高度。在含有EDTA的微滤管中采集血液，以5000 rpm的速度造粒10分钟，获取AST、ALT、肌酐和胆红素的血浆样本，并取出肝脏，称重和处理。脾脏也被取出并称重后丢弃。

肝脏组织学和纤维化定量

肝脏用3.7%福尔马林固定，石蜡包埋并切片。肝脏切片用饱和苦味酸中0.1%天狼星红染色（均来自Sigma Chemical Co.）。每只动物取4张苦味酸红染色载玻片，每张载玻片随机取9张图像，每只动物共取36张图像，使用计算机化BIOQUANT生命科学形态计量学α系统进行胶原蛋白定量。

索拉非尼抗TAA诱导的肝纤维化作用体内

为了研究索拉非尼对肝纤维化的直接影响，我们进行了体内硫代乙酰胺（TAA）致大鼠肝损伤模型的研究[13,14]. 索拉非尼之前未在TAA所致的实质损伤模型中进行过评估，该模型更类似于人类疾病，因为其坏死和炎症程度低于CCl₄诱导性肝损伤[13]. 此外，服用TAA 5-6周后，自发可逆性最小（数据未显示）。使用了四种不同的给药方案，其中所有动物均使用载体或索拉非尼给予TAA 8周，持续4周或8周(补充图1)：第1组，每周注射PBS的对照组，用于统计比较；第2组：同时给予TAA和索拉非尼的“预防性”方案；第3组：“治疗性”方案，索拉非尼在8周TAA给药开始后仅4周开始服用，随后继续服用4周，以及；第4组：“可逆性”方案，即在完成8周的TAA后才给予索拉非尼4周。

实时PCR、Western blot、Sirius红染色和Bioquant胶原蛋白定量的综合数据(图6,​,77和​和8）8)证明索拉非尼在“治疗”治疗组（第3组）中最有效，而“预防”方案（第2组）显示出非剂量依赖性疗效，而药物在“可逆性”中无效（第4组）（数据未显示）。

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图6

索拉非尼下调TAA诱导大鼠肝纤维化中成纤维mRNA表达

实时PCR用于量化与纤维化相关的关键基因的表达。观察到TGF-β1、a-SMA、I型胶原持续下调，而MMP2、TIMP1和β-PDGFR在低剂量下下调。MMP14没有受到显著影响。n=3*第页<0.001.

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图7

“治疗”治疗组大鼠肝组织的肝纤维化显著减轻

7a）第3组动物的代表性肝脏切片中，放大100倍和200倍的H&E和天狼星红的大鼠肝脏组织学。通过分析每只动物36个天狼星红染肝切片来评估相对纤维化面积（以占肝总面积的百分比表示）。以100倍放大率采集每个视野，并使用计算机化生物定量形态测量系统进行分析。用索拉非尼7b）1.25 mg/kg/天7c）5 mg/kg/天和7d）7 mg/kg/日治疗的动物肝脏纤维化存在统计学显著差异*p<0.001

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图8

索拉非尼抑制TAA治疗大鼠肝脏α-SMA蛋白的表达

western blot分析索拉非尼治疗大鼠肝脏a-SMA蛋白的表达；a） TAA治疗开始时，第2和b组），第4-8周，第3组。与给药大鼠相比，a-SMA蛋白表达显著降低。

在“治疗”组（第3组）中，纤维生成基因（包括Collα）持续下调₁（一） 和Collα₂（一）(图6)与形态计量学的胶原蛋白定量结果一致，该结果表明，与车辆注射的肝脏相比，胶原蛋白面积减少了70%(图7)。索拉非尼还下调了MMP2、α-SMA、β-PDGFR和TGFβR1的mRNA(图6)。第4组的mRNA表达或胶原减少没有显著变化（数据未显示）。

除第2组接受索拉非尼5mg/kg/天治疗的动物外，所有亚组的肝脏重量与体重比率均无显著差异，与相应的对照药物亚组相比，该比率有所降低(表1)。各亚组之间的门静脉压力没有显著差异（参见补充图2、3和4).

利息清单

这项工作得到了拜耳奥尼公司（10-0752）与西奈山医学院肝病科签订的研究合同的支持。斯科特·弗里德曼（Scott Friedman）是拜耳-纽约咨询公司（Bayer-Onyx）的顾问，也是专家咨询委员会（Expert Advisory Board）的成员。拜耳-Onyx的工作人员对数据的生成或解释或手稿的准备没有任何意见。